ウイルス

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4101 (2023) この記事を引用

771 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ミオシンの発現と精製は、正常な機能と突然変異によって引き起こされる変化を機構的に洞察するために重要です。 後者は、突然変異がいくつかの衰弱性疾患を引き起こす横紋筋ミオシン II にとって特に重要です。 しかし、このミオシンの重鎖は発現することが難しく、C2C12 細胞を使用する標準的なプロトコールはウイルス感染に依存しています。 これは時間と労力がかかり、インフラストラクチャの需要と生物学的危険性を伴うため、広範な使用が制限され、さまざまな突然変異の迅速な生成が妨げられます。 私たちはここで、これらの課題を克服するウイルスフリーの方法を開発します。 このシステムを使用して、C2C12 細胞にヒト心臓ミオシン重鎖のモータードメインをトランスフェクトします。 細胞トランスフェクション、培養および回収条件を最適化した後、マウス必須軽鎖および調節軽鎖と同時精製した発現タンパク質の機能を特徴付けました。 in vitro 運動性アッセイにおける滑走速度 (1.5 ～ 1.7 μm/s; 25 °C)、最大アクチン活性化触媒活性 (kcat; 8 ～ 9 s-1) および最大活性の半分のアクチン濃度 (KATPase; 70) –80 μM) は、ウイルスベースの感染を使用して以前に見つかったものと同様でした。 この結果により、新しいタイプの研究、例えば、さらなる特徴付けのために選択される広範囲の突然変異のスクリーニングが可能になるはずである。

ミオシンは、ATP 代謝回転によって駆動される周期的なプロセスでアクチン フィラメントと相互作用することによって力と運動を発生させる分子モーターです。 このプロセスは、筋肉の収縮、非筋細胞の運動性/力の発生、細胞内貨物輸送、細胞シグナル伝達など、さまざまな重要な機能の基礎です1。 最近、ミオシン スーパーファミリーで最大 79 のクラス 2 が同定されました。 それらはすべてミオシン重鎖 (MHC; ~ 90 ～ 250 kD) を中心に構築されており、アクチン結合部位、触媒 ATPase 部位、および運動機能やフィラメントの形成や積荷結合に重要なその他の要素を備えています。 さらに、安定化、調節、調節の役割を持つ軽鎖が各重鎖に結合しています。 ミオシンの運動機能の基本的な機構を洞察するためだけでなく、病気の原因となる変異の詳細な研究のためにも、言及されたすべてのタンパク質成分を発現および精製できることが重要です。

タンパク質の発現および精製に最もよく使用されるシステムは、発現宿主として大腸菌に依存しており、高い精製収率（発現産物が可溶性の場合）および労力とコスト効率が高くなります3。 しかし、原核生物系には、真核生物タンパク質の適切なフォールディングと翻訳後修飾を支援するための完全な細胞機構が欠けています。 機能的なミオシン軽鎖の発現と精製は大腸菌を使用して可能ですが、ミオシン重鎖 (MHC) はこのシステムを使用して機能的な形で生産することはできません 4。 したがって、Dictyostelium 5、6、7、Drosophila melanogaster 8、昆虫細胞 9、10、11、12、13、14、および哺乳動物細胞 15、16 に基づいたさまざまな真核生物の発現および精製システムが開発されています。 これらのシステムは、さまざまな MHC クラスの産生にはうまく機能しますが、脊椎動物の横紋筋ミオシンでは限定的な成功にとどまっています 17、18、19。これは、おそらく筋細胞のタンパク質フォールディング機構をすべて含めることができていないためです。 多くの論文で UNC-45 がミオシンの折り畳みとサルコメアの構築に関与するシャペロンであることが特定されています 20、21、22、23、24 が、Hsp70/Hsp9025 やシャペロニン 26 などの他の因子が関与しているようです。 この見解に沿って、Winkelmannらは、横紋筋ミオシンの完全に機能的な形態への適切な折り畳みが、分化した筋肉様環境、すなわち筋筋管でのみ起こるという証拠を提示した27、28、29。 この考えに基づいて、筋管に分化するマウス C2C12 筋芽細胞が発現宿主細胞株の選択として導入されました 27。 筋芽細胞は、プロモーターの下でニワトリ胎児骨格筋 MHC を保持するプラスミドでトランスフェクトされました。これにより、MHC 発現は筋管への分化時にのみ開始されます。 精製収量は、アクチン活性化 ATPase 活性に基づいてミオシン機能を評価するのに十分でした。 この初期バージョンの C2C12 ベースの発現および精製システム (ここでは「C2C12 ベースのシステム」) での安定した細胞株 27 の生成は、時間の経過とともに比較的高い精製収率と、トランスフェクション サイクルを排除したコスト効率の高いワークフローを提供します。 しかし、安定した細胞株の開発には最大 12 か月かかる場合があり 30、特定のミオシンのいくつかの異なる構築物 (点突然変異など) を調べるには最適なアプローチではありません。 対照的に、一過性発現には開発時間が短く、ターンオーバーが早いという利点があります30。 したがって、C2C12 ベースのシステムは、肥大型心筋症に関連するミオシン点突然変異を導入し、その影響を研究するために、一過性アデノウイルス発現を利用して後に修正されました 31。 同じシステムは Resnicow ら 32 によってさらに最適化され、組換えヒト骨格および心臓ミオシン アイソフォームの一過性動態解析に十分な量の MHC の生成が可能になりました 33、34、35。 注目すべきことに、これらの研究では、ヒトβ-心臓ミオシン変異体が昆虫細胞から発現および精製された以前の報告19よりも、野生型（WT）および変異体β-心臓ミオシンの両方でかなり高いATPアーゼ活性が達成されました。 現在、C2C12筋管のアデノウイルスベースの感染により、特に重要な機能研究、インビトロ運動性アッセイおよび一過性生化学溶液動態学のために、適切に折り畳まれて機能的な横紋筋ミオシン（S1およびHMM様構築物）の十分な量の産生が可能になっている34,36。

C2C12 ベースのシステムはウイルス遺伝子送達に依存しており、機能性タンパク質が高収率で得られますが、他の哺乳動物細胞ベースのシステムと比較すると、時間と労力がかかり、コストもかかります。 これは、アデノウイルスに基づく遺伝子送達方法と C2C12 細胞増殖の接着モードの両方によるものです。 アデノウイルスの使用に関しては、十分なウイルス力価を得るためにヒト細胞株（HEK293など）を使用した一連の濃縮および精製ステップが必要なため、時間と労力がかかります37,38。 ウイルスベースの遺伝子送達に関連する他の制約には、ウイルス遺伝子配列を含まなければならない非常に大きなプラスミドの段階的クローニングが含まれます39。 これにより、挿入サイズが制限され、ウイルスまたは細胞株の突然変異誘発の可能性が制限されます40。 さらに、ウイルスの取り扱いは人員に潜在的な危険をもたらすため、スタッフの追加トレーニングを伴う、より高い安全レベルの実験室インフラストラクチャが必要です。 これらの要件により、C2C12 ベースのシステムは日常的な使用にはアクセスしにくくなります8。 この点で欠けているのは、効果的なウイルスフリーのトランスフェクション法です。

しかし、C2C12 筋芽細胞のような筋細胞、特に分化した形態 (筋管や心筋細胞など) は、トランスフェクトが難しいことが知られています 41。 in vitro 遺伝子送達に一般的に使用される非ウイルス化学的方法 (ポリエチレンイミン、リン酸カルシウムなど) は、低効率、コスト効率の悪さ、および細胞生存率の低さを伴うことがよくありました 41,42,43,44,45,46,47。 したがって、実験セットアップは、低コンフルエントの筋芽細胞培養の小規模なものに限定されました。 エレクトロポレーションによる遺伝子エレクトロトランスファーなどの物理的方法は、非常に効率的です。 しかし、それらは特別な装備要件と小規模な行動様式によって再び制限されます48、49、50。 タンパク質精製には、遺伝子送達方法が効率的でコスト競争力があるだけでなく、より大きな細胞体積に容易に適用できることが重要であり 51 、これは C2C12 細胞における一過性の遺伝子発現がウイルス遺伝子送達によって支配されている理由を説明しています 52。

しかし、最近では、非ウイルス性の化学的トランスフェクション剤の入手可能性が拡大し、コストも削減されています。 一部のサプライヤーは、C2C12 細胞を高効率でトランスフェクトするためのプロトコル (アプリケーション ノート) を提供しています。 ここでは、市販されており手頃な価格の DNA トランスフェクション キット、Polyplus JetPrime を検討しました。 私たちの知る限り、トランスフェクション試薬 JetPrime は、C2C12 細胞を使用した横紋筋ミオシンの生産にはこれまで使用されていません。 その使用により、C2C12 細胞におけるヒト心臓ミオシン重鎖 (β-MHC) の一過性発現と精製のための詳細なプロトコルを開発することができました。 我々は、ヒト β-MHC を発現および精製し、その後機能アッセイで検証することにより、このアプローチの有効性を実証します。 全体として、ウイルスベースの遺伝子送達に依存した以前のデータと我々の結果を比較すると、ミオシン構築物の長さと軽鎖組成が類似している限り、機能的な差異は最小限であることが示されています。 我々は、我々の結果により、C2C12ベースの発現および精製システムが横紋筋MHC産生にとってより魅力的で利用しやすいものになると予想しています。 特に、ウイルスベースのシステムよりもかなり速い変異体の生成とより安全なタンパク質精製は、目的が（心）筋症などのさまざまな変異を研究する場合に有利です56、57、58。

一過性遺伝子発現技術による組換えタンパク質の生産は、トランスフェクション効率に大きく依存します。 一般に、効率的なタンパク質精製収率を確保するには、トランスフェクション試薬と目的の遺伝子 (GOI) を含むプラスミドの組み合わせごとにトランスフェクション パラメーターを最適化する必要があります。 ここでは、我々の知る限り、C2C12細胞における横紋筋ミオシンの産生にはこれまで使用されていないトランスフェクション試薬JetPrimeを使用します。 このトランスフェクション試薬には C2C12 細胞用のプロトコール (アプリケーションノート) が付属していますが、β 心臓ミオシンモータードメイン構築物 (S1L; 図 1A) を保持する作業用プラスミドを使用してトランスフェクション パラメーターを再テストしました。 この構築物は、マウス由来の宿主細胞株での発現のために最適化されたコドンであり、C2C12細胞における長いミオシンサブフラグメント1（aa 1〜843; S1L）のウイルスベースのトランスフェクションに以前に使用されたものと非常によく似ています（表S1）。 ただし、私たちのプラスミドは、以前の S1L の研究のように Avi タグではなく、C 末端に FLAG タグを持つ強化緑色蛍光タンパク質 (eGFP) に融合されています。 eGFPは、発現の進行のモニタリング、インビトロ運動アッセイにおける表面固定化、単一分子研究におけるミオシンモータードメインの局在化など、いくつかの点で有用なタグです（図S1の予備結果を参照）。 トランスフェクションのモードは、適切に形成された DNA:JetPrime 複合体に依存します。 したがって、両方の成分の量、特にそれらの比率は重要なパラメータであり、使用するプラスミドに依存します（たとえば、プラスミドサイズ、プラスミド構造および立体構造の違いにより）。 したがって、最初に、さまざまな DNA:JetPrime 比でトランスフェクション効率をテストしました。 図 1B に見られるように、トランスフェクション効率は幅広い比率で最適なままであり、テストした最高比率でのみ効率が低下し始めました。 結果に基づいて、会社のアプリケーション ノートで推奨されているように、さらなる実験のために比率 1:2 を維持しました。 私たちがテストした次のパラメーターは、播種した細胞数あたりの DNA の量でした。 同社のアプリケーションノートでは、24 ウェル プレートのウェルに 4 × 104 細胞あたり 0.75 μg を播種することが推奨されています。 ウェル面積が約 2 倍大きい 12 ウェルプレートのウェル (研究で使用した場合) の場合、これは 1 ウェルあたり 8 × 104 個の播種細胞あたり 1.5 μg の DNA に相当します。 推奨される DNA 量と、場合によっては低いトランスフェクションを改善できるいくつかのより高い値をテストしました。 図 1C の結果は、DNA 量が増えてもトランスフェクション効率が向上しないことを示しています。 むしろそれらはその衰退につながりました。 したがって、さらなる実験のために、播種した細胞数あたりの推奨 DNA 量を維持しました。

トランスフェクションと発現の最適化。 (A) 特定の部分のアミノ酸残基を示す発現コンストラクトの Cartoon64。 (B) 異なる DNA:JetPrime 比でのトランスフェクション効率。 後続の実験では 1:2 が選択された場合、効率範囲が比較的広いことに注意してください。 (C) 播種細胞数 (ここでは 8 × 104 細胞) あたりのさまざまな量のプラスミド (DNA) でのトランスフェクション効率。 その後の実験では 1.5 μg の量を選択しました。 (D) 細胞の播種数を増加させるためのトランスフェクション効率、および播種後の細胞トランスフェクション前の 2 つの増殖期間 (24 時間および 48 時間)。 細胞数の増加は細胞のトランスフェクションを改善しなかったことに注意してください。 最小数の細胞を播種して 2 日間増殖させると、最高のトランスフェクション効率が得られました。 (E) トランスフェクション後 8 日ごとに評価したトランスフェクション効率。 右下: GFP 蛍光を伴う領域の割合として推定されたトランスフェクション効率。 右上：発現された構築物の量を定量するために使用される抗FLAG抗体を使用したウェスタンブロット。 元のブロットは補足図S2に示されています。 個々のデータを含むすべての棒グラフは、細胞培養皿 (ウェル) あたり 3 ～ 6 枚の画像 (視野) の平均 ± SD を表します。 スケールバーは 100 μm を表します。

はじめにで概説したように、横紋筋ミオシンの適切な折り畳みは、分化した筋管でのみ発生します。 したがって、C2C12 筋芽細胞がトランスフェクション後できるだけ早く分化プロセスに入ることが重要です。 これは、筋芽細胞が完全にコンフルエントになったときに最も効率的に達成できます。 メーカーのアプリケーションノートでは、最適な播種細胞密度は、トランスフェクション時の細胞コンフルエンスが 60 ～ 70% であるとしています。 通常、コンフルエンスが低いほどトランスフェクション効率が向上します。 しかし、私たちの場合、それは最も必要な筋管分化を遅らせます。 したがって、いくつかの異なる細胞播種密度で、細胞播種後のトランスフェクションの 2 つの異なる時点 (つまり、トランスフェクション前に 24 または 48 時間増殖する細胞) を使用して、トランスフェクション効率を調べました。 目的は、トランスフェクション時にほぼ 100% の細胞コンフルエンスに達することでした。 私たちの主な発見は、推奨される細胞播種数であるウェルあたり 8 × 104 を使用したが、推奨される 24 時間ではなく細胞播種後 48 時間でトランスフェクションを行うと、最も高いトランスフェクション効率が得られるということでした (図 1D)。 この時の細胞コンフルエンスも 100% 近くであり、分化と筋管形成への迅速な進行が保証されました。 これらの実験に基づいて、トランスフェクション前に細胞を 36 時間増殖させた直径 60 mm の培養皿を使用する最終プロトコールでは、推奨される細胞播種数が使用されました。 ここでは、60 mm 細胞培養皿を用いたパイロット実験に基づいて、48 時間ではなく 36 時間 (図 1D) が使用されました。

最後に、最高のタンパク質発現を得るために、トランスフェクション後の最適な細胞採取時間を決定しました。 図 1E からわかるように、ウエスタンブロットで評価すると、トランスフェクトされた細胞の総面積および発現タンパク質の量に関して、発現は時間の経過とともに増加し、7 ～ 8 日目で飽和する傾向が示されました。

上記の分析は、β-心臓ミオシン S1L コンストラクト (S1L-eGFP-FLAG、図 1A) を発現するためにいくつかの 60 mm 細胞培養皿を使用した大規模トランスフェクションへの最適化されたプロトコルとその適応の基礎です。 このプロトコルは、実験手順で詳しく説明されています。 トランスフェクション後7日目に細胞を回収した後、細胞を溶解し、抗FLAG抗体で装飾されたマイクロメートルスケールのビーズからなる精製樹脂を使用して細胞溶解物からS1L構築物を捕捉しました（図2A上）。 結合タンパク質は、過剰な遊離FLAGペプチドとの競合によって溶出されました（図2A下）。 代表的な SDS-PAGE タンパク質ゲル (図 2B) は、S1L 構築物が内在性マウス軽鎖と同時精製された精製ミオシン調製物を示しています。 模擬精製ゲルの結果から示唆されているように、他のいくつかの少量のタンパク質夾雑物は、非特異的な細胞溶解物が精製ビーズ上の抗 FLAG 抗体に結合した結果です。 488 nm での eGFP 吸収によって評価すると、トランスフェクト細胞 1 cm2 あたり最大 0.08 μg、平均で 0.04 ± 0.02 μg (平均 ± SD、n = 5) が達成されました。 したがって、10 個の 60 mm 培養皿からの細胞を使用したタンパク質精製により、1.4 μM 濃度で最大 13 μg のタンパク質が得られました。

抗FLAG抗体樹脂（ビーズ）を用いたアフィニティー精製。 (A) 上: FLAG タグを介して発現タンパク質を捕捉した後のビーズの GFP 蛍光。 下: 3X FLAG ペプチドによる溶出後に消失した蛍光を示すビーズ (上と同じ顕微鏡条件下で表示)。 スケールバー: 200 μm。 (B) 左: マウス ELC (約 23 kDa) および RLC (約 19 kDa) と同時精製された精製ヒト β-心筋ミオシン重鎖 S1L-eGFP-FLAG コンストラクト (レーン 1、MHC; 125.5 kDa) を示す SDS-PAGE 溶出分析。 kDa)。 右: 非トランスフェクト C2C12 細胞を使用したモック精製。小さなタンパク質夾雑物 (レーン 2) は、3X FLAG ペプチドとのインキュベーション後に共溶出した樹脂に結合した非特異的細胞ライセートの結果であることを示しています。 元のゲルは補足図S3に示されています。

次に、NADH 共役アッセイを使用して定常状態の基底 ATPase とアクチン活性化 ATPase を測定することにより、精製ミオシン構築物の特性評価を開始しました。 S1L-eGFP-FLAGの定常状態ATPアーゼ活性の分光測光データを図1〜3に示す。 アクチンは、S1L-eGFP-FLAG の定常状態の ATPase 活性を約 200 倍（kbasal ～ 0.04 から kcat ～ 8 s-1）増加させ、KATPase ～ 80 μM、これは、ATPase 活性の最大値の半分におけるアクチン濃度です (表 1)。 精製された S1L-eGFP-FLAG サンプル中の活性頭部の割合に関するより感度の高いアッセイは、表面に付着したモータータンパク質によってアクチン フィラメントの滑走が観察される in vitro 運動性アッセイ (IVMA) です。 ２つの独立した発現および精製実験のＩＶＭＡ結果を図３ＣおよびＤに示す（動画Ｓ１〜Ｓ２）。 アクチンフィラメントの滑走速度は、2 つの調製物について平均 1.5 および 1.8 μm/s でした (図 3C、表 1)。 以前の研究と同様に、より短いS1モーターフラグメント（sS11-808aa）35、59、60を使用して、良好な運動性を達成するには、アフィニティー精製による不活性頭部の除去（「デッドヘッディング」）が必要でした。 運動性フィラメント（FMF）の割合は平均して 60% と 69% に達し、それぞれ 1 つと 2 つのデッドヘッドが発生しました（図 3D、表 1）。 残念ながら、比較のためにウイルストランスフェクションで得られたS1Lを使用した以前の研究では、運動性フィラメントの割合に関するデータを見つけることができませんでした。

マウスミオシン軽鎖と同時精製された精製ヒトβ心臓S1L構築物の機能アッセイ。 (A) NADH 共役アッセイを使用した、[S1L-eGFP-FLAG] および [MgATP] は一定だが、[F-アクチン] (モノマーに関連する濃度) は 5 (a)、10 ( b)、15 (c)、20 (d)、30 (e)、40 (f)、60 (g)、80 (h)、または 100 (i)。 (B) [F-アクチン] の関数としてのアクチン活性化定常状態 ATPase 活性。 データ点を通る実線は、式 (1) に最もよく適合します。 (1) 表 1 に示す最適パラメータを使用したデータ。3 つの独立したタンパク質調製物からのデータを異なる色で示します。 (C) 2 つの異なるタンパク質調製物 (調製物 1 および調製物 2) の 25 °C での in vitro 運動性アッセイにおけるアクチン フィラメントの滑り速度。 データは、各製剤の 25 ～ 30 フィラメントの平均 ± 95% CI に重ねられます。 (D)。 1 回 (Prep 1 の場合) または 2 回 (Prep 2 の場合) アフィニティー精製後の運動性フィラメントの画分 (「デッドヘッディング」)。 データは、各調製物のフローセルごとに 5 つの視野からの平均 ± 95% CI に重ねられます。 (E) アクチン フィラメントの滑り速度とフィラメントの長さの関係 (準備 1 の C と同じデータ)。 (F) アクチン フィラメントの滑り速度とフィラメントの長さの関係 (準備 2 の C と同じデータ)。 E および F の水平の直線は、長さが 3 µm を超える場合、フィラメントの長さに対する速度の依存性が最小限であることを示唆する平均値を示しています。

インビトロ運動性アッセイ表面上のモーター密度は、適切に配向された抗体の密度とミオシンモーターフラグメントのインキュベーション条件 (時間と濃度) の両方に依存します。 モーター密度は測定しませんでしたが、アクチンフィラメントの長さが3μmを超える場合（図3E、F）、ほぼ一定の速度は、密度が最大滑り速度を達成するのに十分であることを示唆しており、最大滑り速度は交差によって制限されます。付着率の影響を受けないブリッジの剥離率は一定（筋肉の場合と同様）61,62。 図 3E、F の結果を解釈する際の考慮事項は、十分に長いフィラメントの場合、ミオシン密度が低くても、より低い値でも速度が飽和することが知られているということです 61。 しかし、それでもなお、我々の研究ではモーター密度が十分に高く、速度が分離制限されているという結論を下せると確信しています。 第一に、飽和は、Uyeda et al.61 の研究で低いモーター密度で見られたより長いフィラメント長ではなく、約 3 μm のフィラメント長ですでに発生していました。 さらに、分離制限速度を与えるのに十分なモーター密度のさらなる証拠として、私たちの研究で観察された最大速度は、アデノウイルスベースのタンパク質生産を使用した以前の研究で見つかったものと類似しており（表S1および図S4）、それらとも一致しています。筋肉細胞に見られます63。

脊椎動物横紋筋ミオシンの現在の最先端の発現および精製システムは、C2C12 細胞へのウイルス遺伝子導入に依存しています。 ウイルス遺伝子導入は高い遺伝子送達効率を保証し、その結果、高いタンパク質発現と精製収率を保証しますが、「はじめに」で述べたように欠点もあります (図 S5 も参照)。 これはおそらく、世界中でその実装が限定的であり、研究環境の成長を妨げ、新しいアイデアの大規模なテストと以前の結果の広範な独立した確認の両方を妨げていることを説明しています。 実際、私たちの知る限り、組換え脊椎動物筋ミオシンを定期的に利用することに成功しているのは、世界中でほんの一握りの研究室だけです（例えば、32、33、34、53、65、66、67に反映されています）。 私たちは、インフラストラクチャと人員要件の両方に関して、ウイルス遺伝子導入をより便利でユーザーフレンドリーなアプローチに置き換えることが、より広範な方法の有用性への第一歩となるだろうと仮説を立てています。 さらに我々は、これを達成するための最初のステップは、基本的な機能アッセイに有用な精製横紋筋ミオシン II モーター断片の生成を可能にする直接的なアプローチを実証し、完全に報告することであると信じています。 私たちが説明するトランスフェクション試薬 JetPrime に基づく C2C12 細胞の非ウイルストランスフェクション法は、そのようなアプローチです。 まず、この方法の基礎を築くために、S1L-eGFP-FLAG コンストラクトを C2C12 細胞にトランスフェクションするためのさまざまなトランスフェクション パラメーターをテストして最適化しました。 この研究では、マウス宿主バックグラウンドでの発現のためにコドンが最適化された構築物 (下記のデータ利用可能性ステートメントを参照) を使用しました。 プロトコールを最適化するためのテストには、DNA と JetPrime の比率、[DNA] と細胞の比率、トランスフェクション時の細胞コンフルエンス、そして最終的に細胞採取の時間を変更することが含まれていました。 一部のテストでは会社のアプリケーション ノートのパラメーター値が確認されましたが、他のパラメーターはさらなる最適化が必要であることがわかりました。 これは、適切な筋肉のミオシンの折り畳みには成熟した筋肉の状態が必要であり、これは分化した C2C12 筋管でのみ確保され、筋芽細胞の段階では確保されないという事実に特に関連しています。 したがって、ウイルス遺伝子導入は筋管期で行われることが多い（ただし、53,66を参照）。

筋管やその他の分化した筋細胞は、非ウイルス法を使用してトランスフェクトするのが難しいことで知られています。 したがって、同社のアプリケーションノートでは、24 時間後の検査で高いトランスフェクション効率を達成するために、70% の単層コンフルエンスで筋芽細胞の JetPrime トランスフェクションを実行するように指示されています。 我々の目的からすると、このアプローチには、筋芽細胞に適切な折り畳み機構が欠如しているため、発現したミオシンが適切に折り畳まれず、不活性なミオシンヘッドの蓄積と凝集が生じるリスクがあります。 したがって、ここで説明する重要なプロトコルの最適化には、(i) トランスフェクション期間 (4 時間) の直後に分化が始まるほぼ 100% コンフルエンシーでの筋芽細胞のトランスフェクション、および (ii) トランスフェクション後の最適な採取日を慎重に選択することが含まれます。 両方のパラメーター値は、ウイルス遺伝子送達法を使用しているにもかかわらず、100% コンフルエントの筋芽細胞段階の細胞を感染させ、すぐに分化培地に移し、その後 7 日後に筋管を採取したという Nesmelov グループの報告によって動機づけられました 66。感染。 我々の結果は、一方では、筋芽細胞融合によるより速い筋管形成を優先して、トランスフェクションの24時間後に期待された高い発現効率（JetPrime C2C12アプリケーションノート）が犠牲になったことを示しています（図1E）。 一方、トランスフェクション後の最初の数日間の低発現は、発現タンパク質のごく一部のみが適切なフォールディング機構の観点から最適ではない細胞内環境を経験しているため、本発明者らに有利に働く。 トランスフェクション直後の低トランスフェクション領域 (< 10%) がその後どのように拡大し、トランスフェクション後 7 ～ 8 日目にピークに達する傾向があるかを観察するのは興味深いことです。 これは、少数のトランスフェクト筋芽細胞と主要な非トランスフェクト筋芽細胞（または検出限界以下の発現でトランスフェクトされた筋芽細胞）の間のプラスミドの水平移動が原因で発生した可能性が最も高くなります。 もう一つの興味深い観察は、細胞をより高い密度で播種するよりも、播種後 36 ～ 48 時間以内に最初にほぼ 100% のコンフルエンスに達するように細胞を播種すると、この推定上の遺伝子水平伝達プロセスが加速されることです。 24 時間後にはすでに合流点に達します (一般的な方法と同様)。 トランスフェクション前の長期間の増殖時間にわたって自発的に確立される細胞間接触が、筋芽細胞融合、水平プラスミド転移、および全体的なトランスフェクション効率の促進にとって重要であると推測する人もいるかもしれません (図 1D)。 興味深いことに、最近発表された報告書では、筋芽細胞へのウイルス遺伝子導入を使用して、遺伝子導入後 7 日目の細胞採取も行われています 53,66,68。 それでも将来的には、より長い発現期間が考慮される可能性があります。 したがって、ウイルストランスフェクションによる最近の報告では、筋芽細胞感染の 9 ～ 11 日後に細胞が採取され、150 mm 細胞培養ディッシュあたり最大 262 μg という顕著な精製β-心臓ミオシン HMM 様構築物の収量が得られました 69。 7日後に収穫53。

私たちのプロトコールでは、Spudich/Ruppel 35,36 や Leinwand の研究室 33,70 で一般的に行われているように、精製したマウス軽鎖とヒト心臓軽鎖を同時トランスフェクトしたり、その後交換したりすることはありません。 代わりに、ヒトのベータ心臓 MHC がマウスの軽鎖と一緒に精製されます。 これは、ウイルスベースの遺伝子送達に依存する他のほとんどの以前のプロトコルと同様です53、65、68、69。 ある研究では、Swenson et al.53 は、2 つの必須アイソフォーム (骨格筋 Myl1、心房/胎児 Myl4) と 1 つの調節アイソフォーム (骨格筋 Mylpf) から構成されるマウス軽鎖を完全に同定しました。 ヒトβ-心臓ミオシン HMM 様構築物が C2C12 細胞を使用して発現および精製された別の研究では、3 番目の MLC1F アイソフォームが観察されました 65。 異なる軽鎖の検出は、異なる MHC コンストラクトにおける軽鎖結合領域の異なる長さを部分的に反映していますが、異なる研究室間の C2C12 細胞状態の違いも示唆している可能性があります。 細胞の状態は、1 つの研究室内で得られるミオシン ATPase 活性測定値の変動に関連しているため、これは重要である可能性があります 71。

図 2B に示すように、S1L 調製物はかなり純粋です。 ただし、さらなる改善のために、微量の汚染タンパク質を回避するために、将来的にはいくつかの追加のアプローチが採用される可能性があります。 したがって、イオン交換クロマトグラフィー (HiTrap Q HP カラム 33、35 など) による追加の精製を利用して、溶出液を精製することができます。 あるいは、結合した構築物を精製ビーズから切断できるように、eGFP と FLAG タグの間の TEV 制限部位を操作することもできます 35。 後者のアプローチを使用すると、FLAG ペプチドの競合結合による溶出は必要なくなります。 このステップを回避すると、FLAG 樹脂精製ビーズに結合して溶出時に放出される可能性のある非特異的タンパク質の汚染が細胞溶解物から除去される可能性が最も高くなります。 最後に、優れた精製タグを使用できます (例: HaloTag72)。 しかし、我々は、我々の研究の主な焦点である遺伝子送達法を超えて、確立された精製プロトコールの変更を避けることを目的としていたため、ここではそれは試みられていない。

当社が説明するウイルスフリー C2C12 ベースの発現および精製システムの収量は、培養細胞 1 cm2 あたり最大 0.08 μg の均一なタンパク質です。 これは、同様の心臓ミオシン構築物を使用したウイルス C2C12 システムの報告収量よりも約 2 ～ 4 倍低く 53、54、55、同様の長さで代替タグ (His タグ) を使用した他の横紋筋ミオシン アイソフォームについて報告されている収量よりも 4 ～ 8 倍低くなります。 ）34． 収量もまた、最近報告された心臓重メロミオシン（HMM）様構築物よりも 8 ～ 21 倍（モルで 6 ～ 17 倍）低いです 69。 現在、ウイルスの遺伝子送達機構に代わる同様に効果的な手段がないため、非ウイルストランスフェクションでは収量が低下すると予想されます。 しかし、重要なことは、当社のウイルスフリー法を使用した活性タンパク質の収量は、定常状態の ATPase および in vitro 運動性アッセイに十分であるということです。

明らかに、我々の小規模発現系の収量は低すぎて、一過性動力学を使用したミオシン運動機能の完全な特性評価や、例えばクライオEMを使用した構造研究を可能にすることができません。 このような研究を可能にするためにスケールアップすると、トランスフェクション試薬自体のコストにより、メソッドが法外に高価になります。 ただし、ここで説明するように、小規模な S1L 生産の場合、この方法はアデノウイルスに基づく方法よりもコストと時間の効率が高く、一般的に利用しやすいです。 これは、例えば、広範囲の突然変異の研究のための戦略を示唆している。１．本方法を使用して小規模に生成された広範囲の突然変異の最初の機能スクリーニング（ＡＴＰアーゼおよびインビトロ運動性アッセイを使用）、おそらくその後に続く。 2. 一時的な生化学反応速度論および構造研究を可能にする、タンパク質生産のスケールアップのための最も興味深い突然変異の選択。 後者のアップスケーリングは、アデノウイルスベースの一過性発現または別のかなり長いプロセス、すなわち安定した細胞株の生成のいずれかを使用して、限られた数の突然変異が選択されれば達成できます27。 後者は、相当量の特定の構築物を繰り返し生成することに興味がある場合に有用である可能性があります。 このような安定した C2C12 細胞株は、適切に濃縮した後、大量のタンパク質を発現することができます。 限られたトランスフェクション効率に対する感度が低いため、安定した細胞株の生成には非ウイルス リポソーム ベース (リポフェクチン) トランスフェクション剤が使用されました 27。

上記で検討した戦略に加えて、多くの一時的な生化学反応速度論の代わりに単一分子アッセイを使用する開発も予測しています。 このような開発が実現できれば、現在の非ウイルス一過性発現法によって生成されたタンパク質を使用して、ほぼ完全な生化学的特性評価が可能になるでしょう。 さらに、将来的には、非ウイルス性トランスフェクションのコストを削減するだけでなく、収量も増加する可能性があります。 したがって、発現をさらに高めるために、記載されたプロトコルの特定の適応を行うことができます。 現在、細胞分化とタンパク質発現は、2% ウマ血清を含む標準的な分化培地で行われています 32,34,35。 ただし、より豊富な分化/発現培地製剤が実装されています。 ごく最近では、10% のウマ血清と 1% のウシ胎児血清を含む分化培地の使用に成功しました 53,69。 このような製剤は、私たちのシステムでもタンパク質発現を潜在的に高める可能性があります。 実際、タンパク質発現効率を高めるには、最小限の量（例えば 1%）のウシ血清が重要である可能性があることがわかっています 73。

精製されたモーターの活性は、定常状態条件で基礎およびアクチン活性化 ATPase を測定することによってチェックされました。 驚くべきことに、測定された定常状態パラメーター、つまりアクチンなしの基礎活性 (kbasal)、アクチン活性化 ATPase 活性 (kcat) および KATPase は、最近報告された値 (kbasal ~ 0.02 s-1、kcat ~ 8 ～ 9 s-) と非常に良く一致しています。 1、KATPase ~ 70-80 µM)、同様の (S1L) コンストラクトを使用し、ここと同様にマウス軽鎖と共精製しましたが、ウイルストランスフェクションを使用しました 53,54,55 (表 S1;図 S4)。 さらに、私たちの研究で得られたアクチンフィラメントの滑り速度（1.5〜1.8μm / s）も、前述の研究で観察されたもの（1.5〜1.7μm / s）と同じ範囲内にあります（表S1、図S4）。

一方で、必須（RLCではない）のみを保持し、ヒト心臓軽鎖35、59、60、71、74、75、76または軽鎖を持たないさらに短いミオシン構築物 S11-787aa 65。 これらの研究は、同様のままである基礎ATPアーゼ活性（kbasal〜0.02 s-1）を除いて、アクチン活性化ATPアーゼ活性パラメータ値（kcat〜6 s-1、KATPase〜40μM）の低下を示しました（表S2、図S4）。 さらに、これらの短いコンストラクトを使用したアクチンフィラメントの速度は、S1Lの場合よりも低かった（〜0.9μm / s）（表S2、図S4）。 ウイルストランスフェクションを使用したこれらの実験の一部で kcat 値が低かったのは、C2C12 細胞状態間のばらつきによるものであり 71、これは、細胞の突然変異を引き起こすさまざまな疾患を分析する場合、実験を並行して実行する（野生型タンパク質と突然変異タンパク質の両方を発現する）ことが賢明である可能性があることを示唆しています。 β-心臓ミオシン。 マウス軽鎖の S1L の KATPase 値がヒト ELC の sS1 よりも一貫して高いこと、および in vitro 運動アッセイでの滑走速度が一貫して高いことを考慮すると、これらの効果は方法論的な特殊性ではなく、sS1 と S1L コンストラクト間の真の違いを反映していると考えられます。 この見解を裏付けるように、マウス軽鎖と同時精製されたヒトβ-ミオシン HMM 様構築物も同様の約 1.5 μm/s の速度を示します 69。 観察された違いの背後にあるさまざまなメカニズムが考慮される可能性があります。 以前に指摘したように、軽鎖結合レバーアームの異なる長さと異なる軽鎖アイソフォームが、これらの点で重要である可能性があります53。 sS1 と比較して S1L のレバーアームの長さが増加したこと自体が、より高い滑空速度の原因となる可能性があります 78。 さらに、マウス軽鎖を使用した S1L によって生成される滑走速度は、ヒトの心室からの皮を剥いた筋線維 (すべてのヒトミオシン重鎖および軽鎖) で見られるのと同様 (温度補正後) であると思われるため 63、その必要はないと思われるマウスとヒトの軽鎖が滑空速度に及ぼす追加の影響を想定するため。

しかし、これに関連して、必須軽鎖アイソフォーム 79,80 および調節軽鎖アイソフォーム 81,82 が横紋筋ミオシン ATPase の動態特性とアクチンフィラメントの滑走速度の両方に劇的な効果を示すことを他の研究が実証していることを考慮することが重要です。 さらに、Tangらは実験を並行して行ったところ、ヒト心室調節軽鎖をマウス調節鎖に置換すると（マウスELCの交換なし、表S2の研究3.1対3.2）、KATPaseとアクチンフィラメント速度の低下が実証されたことを観察した55。それぞれ約 40% と約 15% 減少しました (図 S4 も参照)。 他の複雑さを伴うことなく、さまざまな軽鎖の役割をより明確に扱うには、すべての実験を同様の明確に定義された条件下で、軽鎖アイソフォームの完全な特徴付けを行って実行する必要があります。 上で議論したように、いくつかの認識された変動を考慮すると、そのような研究は将来的に興味深いものと思われます。

我々は、生化学的および生物物理学的分析に十分な量の活性型ヒト横紋筋ミオシンを生産するための、ウイルスフリーのトランスフェクション、一過性発現、およびタンパク質精製方法を報告します。 我々は、ウイルス生産段階を回避することが、ヒト横紋筋ミオシン発現および精製システムの「民主化」（cf.83）に貢献し、より広範な科学コミュニティにとって魅力的で手頃な価格のものになると確信しています。 これは、発現および精製された横紋筋ミオシンの使用に依存する科学的発見の速度と質の両方に大きな利益をもたらすことが期待されます。 この段階では、方法の制限として、上で議論したウイルス遺伝子送達と比較して精製収率が低いことが挙げられます。 もう 1 つの考えられる制限は、大規模な細胞トランスフェクションを実施する場合の JetPrime 試薬の現在のコストです (2022 年 4 月にスウェーデンの代理店から入手した製品見積から推定、60 mm 細胞培養ディッシュあたり約 15 ユーロ)。 公正なコストの判断には、同等のウイルス力価に対するコストの推定が必要ですが、この方法は、定常法を使用して、広範囲の異なる変異を並行して迅速に特徴付けるための中小規模の実験に最も適していると言えるかもしれません。状態および単一分子の生化学的および生物物理学的技術。 他の方法よりもスケールアップが必要な場合、特にアデノウイルスベースの感染がより適しています。 上記では、私たちの方法をアデノウイルスベースのタンパク質生産または安定した細胞株を使用した生産と組み合わせる戦略を提案します。 しかし、将来的には、C2C12 細胞に適した新しいトランスフェクション試薬が、より優れた費用対効果で市販される可能性が最も高くなります。 さらに、単一分子法の開発により、最小限の発現タンパク質のみを必要とする、より広範な生化学的特性評価が可能になる可能性があることが予測できます。

アクチンは、スウェーデンのリンシェーピングにある地域動物実験倫理委員会によって承認された手順に従って、安楽死させたウサギから得た筋肉から精製されました（参考文献17,088-2020）。 安楽死させる直前に、活性物質を含むゾレチル 0.25 ml の筋肉内注射によりウサギを麻酔した。ゾラゼパム 6 mg/kg。 チレタミン、6 mg/kg およびメデトミジン、0.6 mg/kg。 次いで、安楽死させた後、耳静脈にペントバルビタール２ml（１００mg/ml）を注射した。 すべての手順はリンネ大学の獣医師によって行われました。 この研究ではアクチンの特性が焦点になっていなかったため、アクチンは 1 匹のウサギのみから単離されました。 むしろ重要なのは、アクチンとの相互作用における 3 つの異なる発現精製によるミオシン間の変動の可能性でした (以下を参照)。

プラスミドは、ヒト β-MHC のヒト MYH7 遺伝子 (https://www.uniprot.org/uniprot/P12883) を含むように設計され、ヌクレオチド配列はマウス筋肉 C2C12 宿主バックグラウンドでの発現用に最適化されました。 完全長の MYH7 遺伝子は、サブフラグメント 1 と呼ばれる長さ (S1L; ヒト β-MHC のアミノ酸残基 1 ～ 848) を発現するために短縮され、CMV プロモーター 84 の下で pcDNA-3.1 プラスミドにクローニングされ、Tobacco Etch が追加されました。強化された緑色蛍光タンパク質 (eGFP) タグおよび FLAG タグ (GenScript Biotech Corporation) の前のウイルス (TEV) プロテアーゼ切断部位。 この論文では、この構築物をヒトβ心臓 S1L-eGFP-FLAG または単に S1L と呼びます。 この構築物は単一のモータードメインを持ちますが、必須軽鎖結合部位と調節軽鎖結合部位の両方を含みます。

A vial of the mouse myogenic C2C12 cell line (ATCC CRL 1772) was purchased from Sigma (Sigma-Aldrich, Germany, now Merck). The cell line has been derived by serial passage of primary cultures of adult thigh muscle after injury85. For routine culture, C2C12 cells were seeded at a density of 103 cells/cm2 (for 3 days growth) or 0.5 × 103 cells/cm2 (for 4 days growth). They were then grown in growth medium, GM [DMEM-high glucose no sodium pyruvate (Sartorius, Germany), 10% Fetal Bovine Serum (HyClone), 1% Antibiotic–Antimycotic solution (Gibco) and 2 mM L-glutamine (Sigma)] in polystyrene cell culture flasks or dishes (Sarstedt) at 37 °C in a humidified condition supplied with 5% CO2 (Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubator, Thermo Fisher). The cells were subcultured when the confluency was around 60–70%. Under our cell culture conditions, doubling time was estimated (2006)." href="/articles/s41598-023-30576-1#ref-CR86" id="ref-link-section-d92737242e1505">86 は 16 ± 2 時間となります (平均 ± SD、n = 43)。

筋原性分化のために、細胞を95%のコンフルエントまで増殖させ、培地を分化培地DMに置き換えた。 後者の培地には、DMEM-高グルコース (ピルビン酸ナトリウム不含) (Sartorius)、2% ドナー馬血清 (HyClone)、1% 抗生物質・抗真菌薬溶液 (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、1% MEM 非含有培地が含まれていました。必須アミノ酸（Gibco）、25 mM HEPES（Gibco）および 1 μM インスリン（Sigma-Aldrich、現在は Merck）。 24時間ごとに新鮮なDMと交換することにより、細胞を7日目まで分化させた。 継代数 5 ～ 15 の間の細胞のみを実験に使用しました。

C2C12 細胞の一過性トランスフェクションは、JetPrime® DNA トランスフェクション試薬キット (PolyPlus-transfection® SA、フランス) (本論文では「JetPrime 試薬」と表記) を使用して実行されました。 この手順では、C2C12 細胞用のメーカーのアプリケーション マニュアルを出発点としましたが、大規模なタンパク質発現用にプロトコルを最適化しました。

トランスフェクション効率を最適化するために、特に記載のない限り、C2C12 筋芽細胞を 12 ウェル プレート (Sarstedt) に 8 × 104 細胞/ウェルで播種し、トランスフェクション前に 70% のコンフルエンスに達するまで約 24 時間増殖させました。 トランスフェクションマスターミックスは、1.5μgのプラスミドDNA（1μg/μl）と3μlのJetPrime試薬（1：2比）を100μLのJetPrime®バッファー（独自のPolyPlus-transfection®SA、フランス;「JetPrime」）中で混合することによって調製しました。特に明記しない限り、各ウェルの「バッファー」を以下に示します）。 トランスフェクションミックスを細胞に滴下し、37 °C で 3.5 ～ 4 時間インキュベートしました。 細胞を０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；すべてウェル当たり）で１回洗浄した後、ＧＭを０．５ｍｌのＤＭに置き換えることによってトランスフェクションプロセスを停止した。 前述したように、DM は 6 日目まで 24 時間ごとに変更されました。トランスフェクションと発現効率は蛍光顕微鏡で分析されました。 研究では、S1L 発現を経時的に行った後、C2C12 筋芽細胞を 30 × 104 細胞で個々の 35 mm (直径) 培養皿 (Nunc、Thermo Scientific) に播種し、トランスフェクション前に 95% のコンフルエンスに達するまで約 36 時間増殖させました。 各ディッシュについて、7.5μgのプラスミドDNAと15μlのJetPrime試薬(1:2比)を200μLのJetPrime緩衝液中で混合することによって、トランスフェクションマスターミックスを調製した。 トランスフェクションミックスを細胞に滴下し、37 °C で 3.5 ～ 4 時間インキュベートしました。 細胞を２ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後（すべて１つの皿につき）、ＧＭを２ｍｌのＤＭで置き換えることによって、トランスフェクションプロセスを停止した。 前述したように、DM は 8 日目まで 24 時間ごとに交換しました。トランスフェクションと発現効率は、最初に蛍光顕微鏡によって毎日 (1 日あたり 1 ディッシュ)、次に細胞の回収後にウェスタンブロットによって分析されました。

タンパク質精製のために、C2C12 筋芽細胞を直径 60 mm のプラスチック皿 (Sarstedt) に 6 × 105 細胞/cm2 で播種し、トランスフェクション前に 95% のコンフルエンスに達するまで約 36 時間増殖させました。 トランスフェクションマスターミックスは、各 60 mm ディッシュあたり 500 μL の JetPrime バッファー中で 11.25 μg のプラスミド DNA (1 μg/μl) と 22.5 μl の JetPrime 試薬 (1:2 比) を混合することによって調製しました。 トランスフェクションミックスを細胞に滴下し、37 °C で 3.5 ～ 4 時間インキュベートしました。 細胞を３ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、ＧＭを５ｍｌのＤＭに置き換えることによってトランスフェクションプロセスを停止した。 前述したように、DM は 7 日目まで 24 時間ごとに交換しました。細胞を 7 日目に回収しました。3 ml の冷 PBS ですすいだ後、1 ml の冷 PBS を含むセル スクレーパーを使用して細胞を削り取りました。 次いで、細胞を1.5mlエッペンドルフチューブに移し、4℃、300gで5分間遠心分離することによって穏やかにペレット化した。 上清を廃棄し、ペレットを液体窒素を使用して急速冷凍し、その後 -80 °C で保存しました。

GFP タグ付きミオシン構築物の発現は、水銀ランプ (HBO 103 W/2、Osram、ドイツ) を備え、10 倍の対物レンズを使用して倒立蛍光顕微鏡 (Axio Observer D1、Zeiss、ドイツ) によって得られた顕微鏡写真でモニタリングおよび分析されました。 FITCフィルターセット。 明視野顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真は、EMCCD カメラ (C9100-12、浜松ホトニクス、専用 HCImage ソフトウェアで制御) を使用し、8 ビット画像深度で一定の露光時間 (150 ms) とゲイン (100) で取得しました。 画像は、トランスフェクション後、最大 8 日間、さまざまな間隔で取得されました。 光強度は、位置 5 (透過率 ~ 20%) に保たれた個別の FL 減衰器 (カタログ番号 423,647、Zeiss) によって可能な限り低く維持され、細胞の光毒性を避けるために励起光への細胞の曝露は最小限に抑えられました。 各パラメータまたは細胞培養ウェル/ディッシュごとに、ランダムに選択した位置から最大 6 枚の明視野および蛍光顕微鏡写真を取得しました。 選択バイアス（高蛍光領域の意図しない選択）を避けるために、新しい位置は常にサンプル全体を包括的に調査する明視野照明の下で選択されました87。 必要に応じて、画像の明るさとコントラストを ImageJ (画像/調整/明るさ/コントラスト) で調整しました。

ミオシン構築物を発現する細胞はイメージング時に常に 100% コンフルエントであったため、トランスフェクション効率は 1) 蛍光画像で取得された総蛍光領域の割合、および 2) それらの領域の蛍光強度 (平均グレースケール レベル) として決定されました。 。 後者は、画像取得が近い期間、できれば同日に、同等のランプ使用時間と同じ顕微鏡（取得）設定で行われた場合にのみ、実験間で比較できることに注意してください。 分析を容易にするために、利用可能な関数のセットを備えたマクロが Imagej (フィジー) で作成されました (「//」はコメントを示します)。

//背景減算.run("背景を減算…", "ローリング = 50");

//画像セグメンテーション.setAutoThreshold("Default dark");setAutoThreshold("Default dark no-reset");setThreshold(4, 255);//しきい値は画像の品質に基づいて調整する必要があります。

//総蛍光面積の割合と平均グレー値を測定します。 関数「測定」設定では、「しきい値に制限」をチェックすることが重要です。

画像が同日に取得された実験の場合、トランスフェクション効率 (TE) は、相対的な比較を容易にするために、総蛍光面積の割合 (A) と蛍光強度 (I) の積として計算されました: TE = A × I (任意の単位)異なるトランスフェクションパラメータの間で。

細胞溶解物または精製タンパク質から得られた総タンパク質を、SDS-PAGE およびウェスタンブロットを使用して分析しました。 総タンパク質分離株の場合、RIPA バッファー (150 mM NaCl、5 mM EGTA、1% Triton X-100、0.1% SDS、25 mM Tris-HCl、1 × Roche プロテアーゼ阻害剤カクテル) を使用して細胞を氷上で 30 分間溶解しました。 、30 秒間超音波処理します (Branson 2510-DTH 超音波洗浄器)。 続いて、エッペンドルフ遠心分離機 5430R を使用して 17,949 × g (13,000 RPM)、4℃で 10 分間遠心分離しました。 次に、タンパク質サンプルを Pierce™ LDS 非還元サンプルバッファー (ThermoFisher) および 50 mM DTT と混合し、95℃で 5 分間加熱しました。 電気泳動は、NuPAGE™ 4 ～ 12% Bis-Tris ゲル (Thermofisher) 上で 90 V で 45 分間実行され、その後、NuPAGE™ MES SDS ランニングバッファー (ThermoFisher) 中で 140 V に増加して 1 時間実行されました。 Trans-Blot Turbo transfer system (BioRad) を使用し、1 A、25 V で 30 分間、タンパク質を 0.2 μm PVDF 膜に転写しました。 転写後、メンブレンを 0.2% ブロッキングバッファー (EZ block、Biological Industries) 中で 1 時間インキュベートし、TBS-T バッファー (20 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% Tween 20、pH = 7.4 ～ 7.6) で洗浄しました。次いで、ブロッキング緩衝液中で１：２０，０００に希釈した抗ＦＬＡＧ抗体（ａｂ１２５７、Ａｂｃａｍ）とともに一晩インキュベートした。 ブロットをTBS-T緩衝液で洗浄し、次いでTBS-Tで1:20,000に希釈したロバ抗ヤギ抗体(ab6885、Abcam)とともに1時間インキュベートした。 最後にメンブレンを TBS-T で洗浄し、NovexTMECL 化学発光基質キット (ThermoFisher) を使用してブロットを展開しました。 画像は、ChemiDoc XRS ゲル イメージング システム (Biorad) を使用して取得しました。

精製戦略 (緩衝液組成など) は、以前に記載された手順 32、35 に基づいていました。 すべての緩衝液は精製に使用する前に脱気しました。 ペレットを、ｐＨ７．２の溶解緩衝液（２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０％スクロース、０．５μＭ）中に再懸濁した。 ％ Tween-20、および 1 × Roche プロテアーゼ阻害剤カクテル）を混合し、ダウンスホモジナイザーを使用して氷上で 50 ～ 70 ストロークでホモジナイズしました。 溶解細胞は、Optima MAX-XP 超遠心分離機で MLA-80 固定角ローターを使用し、遠心分離の直前に 1 ～ 2 mM の新鮮な MgATP を添加し、4 °C、100,000 × g で 1 時間遠心沈降しました。 上清をエッペンドルフ チューブ内の Anti-Flag 樹脂® M2 アフィニティー ゲル (Sigma-Aldrich) とともにニューテーター上で 4 °C で 1.5 時間インキュベートし、アルミホイルとパラフィルムで包み光と空気から遮断しました。 このステップでは、トランスフェクトされた細胞の蛍光に応じて、60 mm プレートあたり 20 ～ 40 μl の充填樹脂を使用しました。 インキュベーション後、Anti-Flag 樹脂を含むビーズを、pH 7.2 の洗浄バッファー (20 mM イミダゾール pH 7.2、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM) の 20 ～ 25 樹脂容量で 2 回洗浄しました。 DTT、3 mM ATP、10% スクロース、1 × Roche プロテアーゼ阻害剤カクテル) を使用し、その後 ATP とプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加せずに 2 回洗浄しました。 タンパク質を、ｐＨ７．２の溶出緩衝液（２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％スクロース、および１５０μｇ／ｍｌの3 × FLAG ペプチド (Sigma-Aldrich))。 溶出液をPierce Micro-Spinカラム(Thermo Scientific)上に流し、残留ビーズを除去し、次いでAmicon Ultra-0.5遠心分離フィルターユニットを使用して濃縮した。 溶出には、低タンパク質結合の 1.5 ml 微量遠心管 (Thermo Scientific) を使用しました。 タンパク質濃度は、61,000 M-1 cm-1 の eGFP 吸光係数を使用して 488 nm での吸光度を測定することによって決定されました。

すべての緩衝液および溶液はアッセイ前に脱気されました。 発現されたβ-心臓ミオシン構築物の活性は、定常状態条件での NADH 共役アクチン活性化 ATPase アッセイによって測定されました 88。 アッセイは、ATPase アッセイ緩​​衝液 (10 mM イミダゾール pH 7.5、5 mM KCl、1 mM MgCl2 および 1 mM DTT) 中で、23℃で、UV 分光光度計 (UV-1800、島津製作所) を使用して 340 nm で吸光度を測定することによって実行されました。 - 5分間のスキャンモード。 この装置には、作業容量範囲 50 ～ 200 μl のスーパーマイクロ ブラック キュベットを保持するためのスーパー マイクロ セル ホルダーが装備されており、必要なサンプルの容量を効果的に削減できます。 F-アクチンはウサギの背筋から精製され、脱気したアッセイバッファーで 3 回透析されました 89。 フィラメントを安定化させるために、透析後のアクチンにファロイジン(Merck)を1.1等モル濃度で添加した。 反応混合物は、2 mM MgATP および NADH カクテル溶液 (1.2 mM NADH、200 U/ mlの乳酸デヒドロゲナーゼ、500 U/mlのピルビン酸キナーゼおよび2.5 mMのホスホ(エノール)ピルビン酸)。 基礎ミオシン ATPase (kbasal) は、アクチン フィラメントを含まない最終濃度 70 ～ 150 nM のミオシンを使用して測定されました。 各アクチン濃度での反応吸光度トレースを ATP 代謝回転対時間としてプロットし、得られた傾き (ATPase 速度) をミオシン濃度に対して正規化しました。 アクチン濃度の増加に対してプロットされた正規化された反応速度は、長方形の双曲線に従い、ブリッグス ハルダンの定常状態 Eq.88 によってフィッティングされました。

kcat と KATPase を取得し、kbasal (V0) の適切な推定値を取得します (GraphPad Prism v9)。 アッセイは 3 つの個別のタンパク質調製物を使用して実行されました (n = 3)。

発現されたβ-心臓ミオシン S1L 構築物によって生成されるアクチン フィラメントの運動性は、標準的な in vitro 運動性アッセイ手順を使用して評価されました 35,90。 カバーガラスを酢酸アミル中の 1% ニトロセルロースでコーティングし、風乾し、前述のように組み立ててフローセルを形成しました 91。 最初に、運動性フィラメントの割合を改善するために 1 ～ 2 回のアフィニティー精製を実行することにより、非機能的なモーターヘッドを機能的なヘッドから分離しました 91。 アフィニティー精製は、S1L 濃度の 10 倍の濃度 (サブユニット濃度) でアクチンフィラメントを含む発現タンパク質と原液を氷上で 5 分間混合し、その後 4 mM MgATP を添加し、氷上で 5 分間インキュベートすることによって実行しました。 次に、混合物を超遠心機 (Optima MAX-XP、Beckman Coulter) の TLA 120.1 ローターを使用して 244,900 × g (75,000 RPM) で 4 °C で 10 分間遠心分離し、機能モーターを含む上清をアッセイに使用しました。 。 低イオン強度溶液 (LISS、10 mM MOPS、25 °C で pH = 7.4、1 mM MgCl2、0.1 mM EGTA) を脱気し、さらに 50 mM KCl および 1 mM DTT を追加して洗浄バッファーを生成しました。 フローセルを抗GFP抗体(MAB3580、Merck、洗浄緩衝液で6倍希釈)で2分間コーティングし、その後1 mg/ml BSAでブロックした(2分間、洗浄緩衝液で調製)。 洗浄バッファーで希釈したアフィニティー精製 S1L-eGFP-FLAG タンパク質 (≦ 325 nM; アフィニティー精製前に測定) をフローセルに添加し、5 分間インキュベートしました。 非活動的なモーターは、以前に記載されているように「アクチンのブロック手順」によってさらにブロックされました91。 ピペッティングにより洗浄緩衝液中で細断した非蛍光F-アクチン(500nM)を、2mM ATPとともに2分間(洗浄緩衝液中)インキュベートし、続いて洗浄緩衝液で2回洗浄した。 最後に、洗浄緩衝液中15 nMの濃度でローダミン-ファロイジンで標識したアクチンフィラメントを加え、2分間インキュベートした後、1倍量で洗浄しました。 最後に、運動性アッセイ溶液を添加した。 アッセイ溶液には、ＬＩＳＳ（上記参照）、４５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．６４％メチルセルロース、および２ｍＭ ＭｇＡＴＰが含まれていた。 また、ATP 再生用の混合物 (200 μg/ml クレアチンホスホキナーゼ (CPK)、2.5 mM クレアチンリン酸 (CP)) および酸素除去用の混合物 (3 mg/ml グルコース、40 μg/ml カタラーゼ、100 μg/ml グルコース オキシダーゼ) も補充されました。 (GOX))。 イオン強度は６０ｍＭであった。 アクチンフィラメントの滑りの動画は、63X 対物レンズ (対物ヒーターを装備)、Cy3 フィルターセット、および EMCCD カメラ (C9100-12、浜松ホトニクス、HCImage によって制御) を備えた Zeiss Axio Observer 落射蛍光顕微鏡を使用して、25 ± 1℃で記録されました。ソフトウェア)、5 フレーム/秒、16 ビット画像深度で。 滑り速度は、カスタムメイドの MATLAB プログラムを使用して計算されました92。 運動性フィラメントの割合は、ImageJ93、94 を使用して決定されました。

アクチン活性化 ATP 代謝回転速度の分析のためのカーブ フィッティングについては上で説明しました。 統計的仮説検定は実行されませんでしたが、重複しない 95% 信頼区間は統計的に有意な差に対応すると想定されます。 中心測定値 (算術平均値) とエラーバーの意味と起源は、図の凡例と表に記載されています。

主な目的は、グループ間または特定の母集団値からの観察変数の違いを実証することではないため、実験の前にサンプルサイズの計算は実行されませんでした。 代わりに、目標は、S1L の発現レベルと精製タンパク質の機能性を、変動性に関する情報とともにテストすることでした。 独立したランダム イベント (n) の定義は、図の凡例と表 1 に示されています。

統計分析、例えば信頼区間の計算および曲線フィッティングは、Graph Pad Prism ソフトウェア v. 9.2 (Graph Pad Software LLC) を使用して実行されました。

この研究中に生成または分析されたほとんどのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。 現在の研究中に生成または分析された追加データは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。 現在の研究中に生成されたヒトβ心臓ミオシンモータードメイン (S1L) をコードする DNA 配列は、NCBI GenBank 寄託所 (国際ヌクレオチド配列共同研究 [INSDC] の一部) でアクセッション番号 OQ092356 として入手可能です。

Heissler、SM & Sellers、JR 多様な細胞機能に対するミオシンの運動学的適応。 トラフィック https://doi.org/10.1111/tra.12388 (2016)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kollmar, M. & Muhlhausen, S. ミオシンのレパートリーの拡大は、中原生代の真核生物の多様化と同時に起こります。 BMCエボリューションバイオル。 17、211。https://doi.org/10.1186/s12862-017-1056-2 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ソール、J.ら。 全長ヒトタンパク質生産パイプラインの開発。 タンパク質科学。 23、1123–1135。 https://doi.org/10.1002/pro.2484 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McNally, EM、Goodwin, EB、Spudich, JA & Leinwand, LA 大腸菌におけるミオシン重鎖とミオシン軽鎖の共発現と構築。 手順国立アカド。 科学。 米国 85、7270–7273。 https://doi.org/10.1073/pnas.85.19.7270 (1988)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Lozanne, A. & Spudich, JA 相同組換えによる細胞性粘菌ミオシン重鎖遺伝子の破壊。 サイエンス 236、1086–1091。 https://doi.org/10.1126/science.3576222 (1987)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Manstein、DJ、Ruppel、KM、Spudich、JA Dictyostelium discoideum における機能的ミオシン頭部フラグメントの発現と特性評価。 サイエンス 246、656–658。 https://doi.org/10.1126/science.2530629 (1989)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

藤田 洋 他ヒト家族性肥大型心筋症変異体と同等の Dictyostelium discoideum の変異体ミオシンの特性評価 - 変異体ミオシンの分子力レベルは予後に影響を与える可能性があります。 Ｊ．クリン． 調査します。 99、1010–1015。 https://doi.org/10.1172/Jci119228 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldwell, JT、Melkani, GC、Huxford, T. & Bernstein, SI キイロショウジョウバエの間接飛翔筋システムを使用したミオシン アイソフォームのトランスジェニック発現と精製。 方法 56、25 ～ 32。 https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2011.12.002 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Trybus、KM 発現された切断型平滑筋ミオシンの制御。 重要な軽鎖の役割と尾の長さ。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 269、20819–20822 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sweeney, HL、Straceski, AJ、Leinwand, LA、Tikunov, BA & Faust, L. アクチン相互作用に欠陥がある心筋症ミオシンの異種発現。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 269、1603–1605 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Henn, A. & De La Cruz, EM 脊椎動物のミオシン VIIb は、張力の生成と維持に適した高デューティ比モーターです。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 280、39665～39676。 https://doi.org/10.1074/jbc.M507667200 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ohki, T.、Mikhailenko, SV、Arai, T.、Ishii, S.、Ishiwari, S. 昆虫細胞/バキュロウイルス系における組換えアクチンおよびミオシン V-HMM の高収量への栄養素の添加による改善-密度細胞培養。 J.マッスルレス。 セルモチル。 33、351–358。 https://doi.org/10.1007/s10974-012-9323-8 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

中村正人 ほか光で作動するギアシフトを使用したミオシンおよびキネシンモーターの遠隔制御。 ナット。 ナノテクノロジー。 9、693–697。 https://doi.org/10.1038/nnano.2014.147 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

原口 哲 ほか超高速ミオシンとそのアミノ酸配列、構造的特徴を発見。 手順国立アカド。 科学。 米国 https://doi.org/10.1073/pnas.2120962119 (2022)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Collins, K. & 松平, PT 刷子縁ミオシン I 重鎖の組換え発現。 セルモチル。 細胞骨格。 32、151–161。 https://doi.org/10.1002/cm.970320216 (1995)。

記事 CAS Google Scholar

ウサジ、M.ら。 一時的かつ安定にトランスフェクトされた懸濁液からのヒトミオシンの過剰発現と精製は、HEK293SF-3F6 細胞に適応しました。 アナル。 生化学。 558、19–27。 https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.07.026 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rindt, H.、Bauer, BJ & Robbins, J. 酵素的に活性なミオシン重鎖のインビトロ産生。 J.マッスルレス。 セルモチル。 14、26–34。 https://doi.org/10.1007/BF00132177 (1993)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Moncman, CL、Rindt, H.、Robbins, J. & Winkelmann, DA 非筋肉細胞で発現される筋ミオシンの分離集合体。 モル。 バイオル。 セル 4、1051 ～ 1067。 https://doi.org/10.1091/mbc.4.10.1051 (1993)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sata, M. & Ikebe, M. 家族性肥大型心筋症の原因となるヒト心臓ベータミオシンの変異の機能解析。 臨床転帰への影響。 Ｊ．クリン． 投資する。 98、2866–2873。 https://doi.org/10.1172/jci119115 (1996)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, MG、Landsverk, ML、Barral, JM & Epstein, HF 2 つの哺乳類 UNC-45 アイソフォームは、異なる細胞骨格および筋肉特異的な機能に関連しています。 J. Cell Sci. 115、4013–4023。 https://doi.org/10.1242/jcs.00108 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Barral, JM、Bauer, CC、Ortiz, I. & Epstein, HF Caenorhabditis elegans における Unc-45 変異は、ミオシン構築における CRO1/She4p 様ドメインに関与していることを示唆しています。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 143、1215–1225。 https://doi.org/10.1083/jcb.143.5.1215 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barral, JM、Hutagalung, AH、Brinker, A.、Hartl, FU & Epstein, HF ミオシンの分子シャペロンとしてのミオシン集合タンパク質 UNC-45 の役割。 サイエンス 295、669–671。 https://doi.org/10.1126/science.1066648 (2002)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Melkani, GC、Bodmer, R.、Ocorr, K. & Bernstein, SI UNC-45 シャペロンは、ショウジョウバエ心臓モデルにおけるミオシンベースの筋原線維組織と心臓収縮性を確立するために重要です。 PLoS ONE 6、e22579。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022579 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hellerschmied, D. et al. 筋ミオシンの結合と折り畳みに重要な UNC-45 シャペロンの分子的特徴。 ナット。 共通。 10、4781。https://doi.org/10.1038/s41467-019-12667-8 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Glazier、AA et al. HSC70 は、野生型および変異型心臓ミオシン結合タンパク質 C のシャペロンです。JCI Insight 3、e99319 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Srikulam, R. & Winkelmann, DA ミオシン II の折り畳みは、分子シャペロニンによって媒介されます。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 Rev. 274、27265–27273。 https://doi.org/10.1074/jbc.274.38.27265 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kinose, F.、Wang, SX、Kidambi, US、Moncman, CL & Winkelmann, DA グリシン 699 は骨格筋ミオシンの運動活性にとって極めて重要です。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 134、895–909 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chow, D.、Srirakulam, R.、Chen, Y. & Winkelmann, DA 横紋筋ミオシン モーター ドメインの折り畳み。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 277、36799–36807。 https://doi.org/10.1074/jbc.M204101200 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Srikulam, R. & Winkelmann, DA シャペロンを介した横紋筋におけるミオシンの折り畳みと集合。 J. Cell Sci. 117、641–652。 https://doi.org/10.1242/jcs.00899 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang, J. 産業微生物学およびバイオテクノロジーマニュアル第 3 版 (アメリカ微生物学会、2010)。

Google スカラー

Wang, Q.、Moncman, CL & Winkelmann, DA 運動ドメインの変異は、ミオシン活性と筋原線維組織を調節します。 J. Cell Sci. 116、4227–4238。 https://doi.org/10.1242/jcs.00709 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Resnicow, DI、Deacon, JC、Warrick, HM、Spudich, JA & Leinwand, LA ヒト骨格筋ミオシンモーターファミリー間の機能的多様性。 手順国立アカド。 科学。 米国 107、1053 ～ 1058 年。 https://doi.org/10.1073/pnas.0913527107 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Deacon, JC、Bloemink, MJ、Rezavandi, H.、Geeves, MA、Leinwand, LA 組換えヒトαおよびβ心臓ミオシンモーター間の機能的差異の同定。 細胞。 モル。 生命科学。 69、2261–2277。 https://doi.org/10.1007/s00018-012-0927-3 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bloemink, MJ、Deacon, JC、Resnicow, DI、Leinwand, LA、Geeves, MA 超高速ヒト外眼ミオシンは、高速骨格 IIa、IIb、および IId アイソフォームとは速度論的に異なります。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 288、27469～27479。 https://doi.org/10.1074/jbc.M113.488130 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommese、RF et al. ヒトβ-心臓ミオシン運動機能に対するR453C肥大型心筋症変異の分子的影響。 手順国立アカド。 科学。 米国 110、12607 ～ 12612。 https://doi.org/10.1073/pnas.1309493110 (2013)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. et al. ミオシンメサと肥大型心筋症の変異によって引き起こされる過収縮の基礎。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 24、525–533。 https://doi.org/10.1038/nsmb.3408 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kovesdi, I. & Hedley, SJ アデノウイルスプロデューサー細胞。 ウイルス 2、1681 ～ 1703 年。 https://doi.org/10.3390/v2081681 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dumitrescu, M.、Trusca, VG、Fenyo, IM & Gafencu, AV アデノウイルス生産の効率的な方法。 JoVE 74、e61691。 https://doi.org/10.3791/61691 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

彼、TC ら。 組換えアデノウイルスを生成するための簡略化されたシステム。 手順国立アカド。 科学。 米国 95、2509 ～ 2514 年。 https://doi.org/10.1073/pnas.95.5.2509 (1998)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, TK & Eberwine, JH 哺乳類細胞トランスフェクション: 現在と未来。 アナル。 バイオアナル。 化学。 397、3173–3178。 https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Djurovic, S.、Iversen, N.、Jeanson, S.、Hoover, F. & Christensen, G. 心筋細胞における非ウイルス性トランスフェクションとアデノ関連ウイルス形質導入の比較。 モル。 バイオテクノロジー。 28、21–32。 https://doi.org/10.1385/MB:28:1:21 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Balci, B. & Dinçer, P. マトリゲル基底膜マトリックスを使用したマウス由来 C2C12 筋芽細胞の効率的なトランスフェクション。 バイオテクノロジー。 J. 4、1042–1045。 https://doi.org/10.1002/biot.200800269 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フェルナンデス・プエンテ、E. 他 C2C12筋芽細胞/筋管および単一骨格筋線維における過酸化水素バイオセンサーHyPerおよびHyPer2の発現および機能解析。 科学。 議員 10、871。https://doi.org/10.1038/s41598-020-57821-1 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dodds, E.、Dunckley, MG、Naujoks, K.、Michaelis, U. & Dickson, G. 培養マウス筋肉細胞のリポフェクション: リポフェクタミンと DOSPER の直接比較。 ジーン・サー。 5、542–551。 https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300604 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

yamano, S.、Dai, J. & Moursi, AM 非ウイルス遺伝子導入試薬のトランスフェクション効率の比較。 モル。 バイオテクノロジー。 46、287–300。 https://doi.org/10.1007/s12033-010-9302-5 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Goullee, H. et al. マトリゲル上の低コンフルエント培養を使用した初代ヒト筋芽細胞における CRISPR/Cas9 遺伝子編集の改善。 スケルトン。 マッスル 11、1–13 (2021)。

記事 Google Scholar

Vitiello, L.、Bockhold, K.、Joshi, PB & Worton, RG DODAC:DOPE リポソームによる高血清濃度での培養筋芽細胞のトランスフェクション。 ジーン・サー。 5、1306–1313。 https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300729 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クエンヌヴィル、SP et al. phiC31 インテグラーゼによる筋肉由来幹細胞および筋芽細胞のヌクレオフェクション: ヒト筋芽細胞による全長ジストロフィン融合遺伝子の安定した発現。 モル。 それで。 10、679–687。 https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2004.05.034 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

真鍋 祐介 ほか培養 C2C12 筋管を使用した急性筋収縮モデルの特性評価。 PLoS ONE 7、e52592。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052592 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Potočnik, T.、Sachdev, S.、Polajžer, T.、Maček Lebar, A. & Miklavčič, D. エレクトロポレーションによる効率的な遺伝子トランスフェクション & mdash; パルスパラメータのインビトロおよびインシリコ研究。 応用科学。 12、8237 (2022)。

記事 Google Scholar

クリスティーナ、E. 他ポリエチレンイミン、コスト効率の高いトランスフェクション試薬。 信号伝達。 6、179–184。 https://doi.org/10.1002/sita.200500073 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Jiang, P.、Ren, L.、Zhi, L.、Hu, X. & Xiao, RP HEK293T および C2C12 細胞における細胞調製および遺伝子送達のためのプロトコル。 スタープロトック。 2、100497。 https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100497 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スウェンソン、AM et al. Omecamtiv mecarbil は、ヒトベタ心筋ミオシンのデューティ比を高め、その結果、カルシウム感受性が高まり、心筋の力の発達が遅くなります。 J Biol Chem 292、3768–3778。 https://doi.org/10.1074/jbc.M116.748780 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, W.、Unrath, WC、Desetty, R.、Yengo, CM ヒト心臓ミオシンのコンバータードメインにおける拡張型心筋症変異は、運動活動とオメカムティフ・メカルビルへの反応を変化させる。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 294、17314–17325。 https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010217 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, W.、Ge, J.、Unrath, WC、Desetty, R.、Yengo, CM 心筋症の変異は、ヒト心臓ミオシンのアクチン活性化パワーストロークに影響を与えます。 生物物理学。 J. 120、2222–2236。 https://doi.org/10.1016/j.bpj.2021.04.007 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walsh, R.、Rutland, C.、Thomas, R. & Loughna, S. 心筋症：ミオシン重鎖 7 における疾患の原因となる突然変異とその表現型の発現に関する系統的レビュー。 循環器学 115、49–60。 https://doi.org/10.1159/000252808 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ochala, J. & Sun, YB 先天性心筋症および骨格性ミオパチーに対する新しいミオシンベースの治療法。 J.Med. ジュネット。 53、651–654。 https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2016-103881 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Parker, F. & Peckham, M. 横紋筋ミオシンにおける疾患変異。 生物物理学。 黙示録 12、887 ～ 894。 https://doi.org/10.1007/s12551-020-00721-5 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. et al. 肥大型心筋症の変異R403Qを持つヒトβ心臓ミオシンの収縮性パラメーターは、運動機能の喪失を示しています。 科学。 上級 1、e1500511。 https://doi.org/10.1126/sciadv.1500511 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkar、SS et al. 肥大型心筋症の変異 R403Q および R663H は、アクチンと相互作用できるミオシン ヘッドの数を増加させます。 科学。 上級 6、eaax0069 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uyeda、TQP、Kron、SJ & Spudich、JA ミオシン ステップ サイズ: 低密度の重いメロミオシン上でのアクチンのゆっくりとした滑り運動からの推定。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 214、699–710。 https://doi.org/10.1016/0022-2836(90)90287-V (1990)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Walcott, S.、Warshaw, DM および Debold, EP ミオシン分子間の機械的結合により、アンサンブル測定と単一分子測定の間に差異が生じます。 生物物理学。 J. 103、501–510。 https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.06.031 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カリフォルニア州ブレアら。 ヒトの心不全は、両心室からの心筋の収縮力を低下させます。 JACC 基本翻訳科学。 5、786–798。 https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2020.05.014 (2020)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

レン、J.ら。 DOG 1.0: タンパク質ドメイン構造のイラストレーター。 セル解像度 19、271–273。 https://doi.org/10.1038/cr.2009.6 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Winkelmann, DA、Forgacs, E.、Miller, MT & Stock, AM ヒトのベータ心臓ミオシン運動活性に対する薬物誘発性のアロステリック変化の構造的基礎。 ナット。 共通。 6, 7974 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gargey, A.、Ge, J.、Tkachev, YV & Nesmelov, YE ヒト心臓ミオシンの力生成領域における静電相互作用は、アクトミオシンからの ADP 解離を調節します。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 509、978–982。 https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.01.045 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woody, MS、Winkelmann, DA、Capitanio, M.、Ostap, EM & Goldman, YE 単一分子機構は、心臓ミオシンによる力の生成における最も初期の事象を解決します。 Elife https://doi.org/10.7554/eLife.49266 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gargey, A.、Iragavarapu, SB、Grdzelishvili, AV & Nesmelov, YE ヒト心臓ミオシンの SH1-SH2 ヘリックスにおける静電相互作用は、強力なアクトミオシン結合の時間を調節します。 J.マッスルレス。 セルモチル。 42、137–147。 https://doi.org/10.1007/s10974-020-09588-1 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スノバーガー、A.ら。 肥大性心臓変異 R712L を持つミオシンは、作業性脳卒中を減少させますが、omecamtiv mecarbil によって回復されます。 Elife https://doi.org/10.7554/eLife.63691 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ベラ、CD 他早期発症または遅発性肥大型心筋症に関係する変異を有するミオシン運動ドメインは、同様の特性を持っています。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 294、17451–17462。 https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010563 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawana, M.、Sarkar, SS、Sutton, S.、Ruppel, KM & Spudich, JA 肥大型心筋症を引き起こすコンバーター変異を伴うヒト β 心臓ミオシンの生物物理学的特性。 科学。 上級 3、e1601959。 https://doi.org/10.1126/sciadv.1601959 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オハナ、RF 他。 哺乳動物細胞からの機能的ヒトキナーゼの HaloTag ベースの精製。 プロテインエクスプレスプリフ。 76、154–164 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

ファム、ＰＬら。 無血清懸濁液で増殖する HEK293 EBNA1 細胞の大規模一過性トランスフェクション: ペプトン添加剤により、細胞増殖とトランスフェクション効率が向上します。 バイオテクノロジー。 バイオエンジ。 84、332–342。 https://doi.org/10.1002/bit.10774 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アディカリ、AS et al. 早期発症型肥大型心筋症変異は、ヒトβ-心臓ミオシンの速度、力、およびアクチン活性化ATPアーゼ活性を大幅に増加させます。 細胞代表 17、2857 ～ 2864。 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.11.040 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アクセル、T.、チェ、ユウ。 E.、Sutton, S.、Ruppel, KM & Spudich, JA ヒト心臓ミオシン変異と小分子エフェクターに起因するアンサンブル力の変化。 細胞代表 11、910–920。 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.04.006 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウジファルシ、Z.ら。 拡張型心筋症のミオシン変異体では、力を生み出す能力が低下しています。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 293、9017–9029。 https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.001938 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンダーソン、RL et al. ヒトβ心臓ミオシンの超弛緩状態と、ミオシン分子から筋線維までのマバカムテンの作用機序を解読します。 手順国立アカド。 科学。 米国 115、E8143 ～ E8152。 https://doi.org/10.1073/pnas.1809540115 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uyeda, TQ、Abramson, PD & Spudich, JA ミオシン運動ドメインの首領域は、動きを生み出すレバーアームとして機能します。 手順国立アカド。 科学。 米国 93、4459–4464。 https://doi.org/10.1073/pnas.93.9.4459 (1996)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ワン・TB 他心室ミオシンと遅発性骨格ミオシンは、同じミオシン重鎖アイソフォームを持っているにもかかわらず、異なる化学機械的特性を示します。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 298, 748。 https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102070 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

オステン、J. et al. ミオシン必須軽鎖 1sa は、ベータミオシン分子上を滑るアクチンと細いフィラメントを減速させます。 J. Gen. Physiol. https://doi.org/10.1085/jgp.202213149 (2022)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Amrute-Nayak、M. et al. 非進行性高速骨格ミオシン II の進行性モーターへの変換。 小 15、1804313 (2019)。

記事 Google Scholar

ナヤック、A. et al. 単一分子分析により、制御性軽鎖が骨格ミオシン II の機能を微調整していることが明らかになりました。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 295、7046–7059。 https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.012774 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンブローズ、B. et al. 単一分子 FRET の民主化: 正確な距離と生体分子のダイナミクスを測定するためのオープンソース顕微鏡。 生物物理学。 J. 118、614a (2020)。

記事 ADS Google Scholar

マッコール、GSら。 プラスミド DNA を使用した筋細胞による成長ホルモン産生の最適化。 Ｊ．エンドクリノール． 165、329–336。 https://doi.org/10.1677/joe.0.1650329 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yaffe, D. & Saxel, O. 分化に必要な血清が変化した筋原性細胞株。 微分 7、159–166。 https://doi.org/10.1111/j.1432-0436.1977.tb01507.x (1977)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Roth、V. 倍増時間コンピューティング、 (2006)。

Lee, JY & Kitaoka, M. 蛍光イメージング実験の厳密さと再現性に関する初心者向けガイド。 モル。 バイオル。 セル 29、1519 ～ 1525 年。 https://doi.org/10.1091/mbc.E17-05-0276 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De La Cruz、EM および Ostap、EM ミオシン ATPase の動態および平衡解析。 方法 Enzymol. 455、157–192。 https://doi.org/10.1016/S0076-6879(08)04206-7 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pardee、JD & Spudich、JA 筋アクチンの精製。 方法酵素mol。 85、164–181。 https://doi.org/10.1016/0076-6879(82)85020-9 (1982)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kron、SJ、Toyoshima、YY、Uyeda、TQ、Spudich、JA ミオシンでコーティングされた表面上のアクチンの滑り運動のアッセイ。 方法酵素mol。 196、399–416。 https://doi.org/10.1016/0076-6879(91)96035-p (1991)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rahman, MA、Salhotra, A. & Mansson, A. in vitro 運動性アッセイで非機能的なミオシン ヘッドを除去するために広く使用されている方法の比較分析。 J.マッスルレス。 セルモチル。 39、175–187。 https://doi.org/10.1007/s10974-019-09505-1 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mansson, A. & Tagerud, S. in vitro 運動性アッセイからのデータ分析における多変量統計。 アナル。 生化学。 314、281–293。 https://doi.org/10.1016/s0003-2697(02)00610-3 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シンデリン、J.ら。 フィジー: 生物学的画像解析のためのオープンソース プラットフォーム。 Nat メソッド 9、676 ～ 682。 https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Abramoff, M.、Magalhães, P.、Ram, SJ imageJ による画像処理。 バイオフォトニクス・インターナショナル 11、36–42 (2003)。

Google スカラー

リファレンスをダウンロードする

この研究は、欧州連合の EU Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション フレームワーク プログラム (補助金契約 732482) (将来および新興技術、Bio4comp)、スウェーデン研究評議会 (補助金番号 2015-05290 および 2019-03456)、および学部から資金提供を受けました。スウェーデンのリンネ大学で健康と生命科学の博士号を取得。 この研究は、スタンフォード大学の JA Spudich 研究室の A Mansson の休暇中に開始されました。 このサバティカルは、ウェナー・グリーン財団とリンネ大学健康生命科学部の共同出資で行われた。 研究の進捗は、リンネ大学健康生命科学部の資金提供によるL Moretto博士によるSpudich博士とKC Ruppel博士の研究室への研究訪問にも依存している。 さらに、主要なプロトコルを寛大に提供し、研究の過程で重要なアドバイスや議論を行ってくれたSpudich博士とRuppel博士に感謝します。 また、リンダ・ソング博士は、議論とアドバイスで認められています。 最後に、原稿を読んでコメントをくださった Spudich 教授に感謝いたします。

リンネ大学が提供するオープンアクセス資金。

Lok Priya Velayuthan と Luisa Moretto の著者も同様に貢献しました。

リンネ大学化学生物医科学部、391 82、カルマル、スウェーデン

ロク・プリヤ・ヴェラユタン、ルイーザ・モレット、スヴェン・タゲルド、マルコ・ウシャジ、アルフ・マンソン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

LPV: 形式的な分析、方法論、調査、執筆 - 元の草案の準備、視覚化、執筆 - レビューと編集。 LM: 形式的な分析、方法論、調査、執筆 - オリジナル草案の準備、執筆 - レビューと編集。 ST: 概念化、方法論、執筆 - レビューと編集。 MU: 概念化、形式分析、検証、データキュレーション、方法論、調査、執筆 - 原案の準備、監督、執筆 - レビューおよび編集。 AM: 概念化、検証、データキュレーション、方法論、調査、執筆 - 原案の準備、監督、執筆 - レビューと編集、資金調達。 すべての著者が提出されたバージョンを承認しました。

マルコ・ウシャジまたはアルフ・マンソンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

補足ビデオ2.

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Velayuthan, LP、Moretto, L.、Tågerud, S. 他生化学的および生物物理学的アッセイのための、哺乳類筋肉細胞におけるヒト心筋ミオシンのウイルスフリートランスフェクション、一過性発現、および精製。 Sci Rep 13、4101 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 12 月 7 日

受理日: 2023 年 2 月 27 日

公開日: 2023 年 3 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。