ナノドラッグはH2O2枯渇とサイコサポニンb1徐放による相乗療法により肝線維症を救済する

Communications Biology volume 6、記事番号: 184 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

低酸素と過酸化水素 (H2O2) の蓄積は線維形成促進性の肝臓環境を形成し、これには線維形成と肝星細胞 (HSC) の慢性刺激が含まれます。 カタラーゼ (CAT) は、H2O2 を触媒して酸素と水に変える主要な抗酸化酵素ですが、さまざまな肝疾患、特に肝線維症でその活性を失います。 この研究では、肝硬変患者および肝線維化マウスの臨床検体が収集され、その結果、CAT の減少が低酸素誘発性トランスフォーミング成長因子 β1 (TGF-β1) と密接に相関していることが示されました。 続いて、CAT 様 MnO2 と抗線維症サイコサポニン b1 (Ssb1) を組み合わせた多機能ナノシステムが、抗線維化療法のために構築されます。 MnO2 は蓄積した H2O2 を触媒して酸素に変換し、それによって低酸素ストレスと酸化ストレスを改善して HSC の活性化を防ぎ、Ssb1 の抗線維化薬効の強化を助けます。 この研究は、TGF-β1が肝線維症におけるCATの減少の原因であることを示唆しており、我々が設計したMnO2@PLGA/Ssb1ナノシステムは、過剰なH2O2と低酸素ストレスを除去することで抗線維化効率の向上を示し、これは肝線維症治療の有望な治療法となる可能性がある。

肝線維症は、アルコール使用障害やウイルス性肝炎感染の増加により、世界的に大きな健康上の負担となっています1。 現在の治療法は、主に肝星細胞 (HSC) の活性化の阻害と過剰に沈着したコラーゲンの除去に焦点を当てていますが、これは再発のリスクを伴う一時的な緩和策です2。 肝臓の低酸素症は、過剰なアルコールや薬物の摂取、または肝臓損傷により顕著に発生し、肝臓疾患、特に肝線維症を引き起こします3,4。 低酸素症は、細胞の酸化ストレス（OS）の増加、低酸素誘発因子（HIF）およびトランスフォーミング成長因子β1（TGF-β1）の上方制御と関連しており、これらは線維症の進行に顕著な影響を与えると報告されています5、6、7、8、9。 低酸素状態では、複合体 III の Qi または Qo 部位でスーパーオキシドが生成され、スーパーオキシド ジスムターゼ (SOD) によって急速に過酸化水素 (H2O2) に変換されます 9、10、11。 低酸素誘発 H2O2 は、HIF-1α の安定化と β-カテニンの調節における重要なメッセンジャーとして機能し、HIF-1α を介してヘッジホッグ経路を調節します 3,12。 一方、過剰な H2O2 はマクロファージを活性化する可能性があり、アクアポリン 3 (AQP3) トランスポーターを介して HSC の活性化に関与していると報告されています 13。 言い換えれば、低酸素と過剰な H2O2 が一緒になって線維化促進環境を構成し、それによって肝線維症の進行が加速されます 14。

カタラーゼ (CAT) は、過剰な H2O2 を酸素と H2O に分解する主要な酵素であり、哺乳動物の肝臓と赤血球で最も高い活性を示します 15。 CAT 活性の低下は、肝線維症 16、非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH)17、肝細胞癌 4 など、多くの臨床肝疾患で広く観察され、報告されています。 CAT 活性の喪失は肝疾患の重要な部分であり、通常、酸素の生成ではなく H2O2 の蓄積を伴い、それによって肝臓の低酸素症と OS がさらに促進されます 18,19。 過剰発現した CAT は、HSC 活性化を阻害することにより肝線維症を改善することが実証されています 20,21 が、複雑な作用と未定義のメカニズムのため十分な注目を集めていません。 プルシアンブルー (PB)22、酸化セリウム (CeO2)23、二硫化モリブデン (MoS2)24 などの CAT を模倣するナノザイムは、H2O2 を除去し、肝線維症治療用の酸素を生成するために利用されています。 CeO2 は脂質の過酸化を軽減し、酸化ストレスの軽減を通じて肝臓の再生を促進する可能性があります 25。 しかし、線維化肝臓における CAT 発現の減少の理由はまだ不明でした。 抗線維症治療効果の増強を確認するには、低酸素、H2O2、およびCATの減少の間の相互作用を理解する必要があります。

サイコサポニン b1 (Ssb1) は、漢方薬として広く使用されており、臨床肝疾患に役立つ radix bupleuri の主要な有効成分の 1 つです 26,27。 サイコサポニンは、HSC の活性化を軽減し、肝細胞を損傷から保護することが実証されています 28,29。 今回の研究では、肝硬変患者から得た臨床検体と肝線維症のマウスモデルを調査し、線維化領域におけるHIF-1αの上方制御、CAT活性の低下、H2O2蓄積を実証した。 マウス肝臓のRNA配列決定により、低酸素下でのCAT減少がTGF-β1と密接に関連していることを発見しました。 我々はさらに、低酸素が HSC における H2O2 生成と TGF-β1 発現を誘導する可能性があることを検証し、低酸素が TGF-β1 を介した CAT 活性と関連していることを示しました。 そこで、線維化肝臓の低酸素症とOSを改善し、抗線維化効果を高めるために、CAT様MnO2と抗線維化Ssb1を組み合わせた多機能ナノドラッグを開発しました。 MnO2 は過剰な H2O2 分解を触媒し、低酸素肝臓に酸素を供給し、Ssb1 の抗線維化効果を助ける可能性があります。 予想通り、結果は、低酸素状態の改善が確かに肝線維化の回復を促進し、肝臓の酸素と酸化還元バランスの正常化に寄与したことを示しました。

肝臓の低酸素症は活性酸素種 (ROS) の生成を増加させると報告されており、その結果生じる H2O2 は酸化還元バランスを維持するために CAT によって分解されると考えられています 12。 この研究では、肝硬変患者の臨床検体における低酸素症と CAT の減少を調べました。 図1aに示すように、正常組織と肝硬変組織をシリウスレッドで染色したところ、肝硬変肝臓ではコラーゲンの蓄積が継続的に増加していることがわかりました。 次に、正常組織および肝硬変組織のコラーゲン I、α-平滑筋アクチン (α-SMA)、HIF-1α、および CAT の発現を免疫蛍光染色に供しました。 正常組織と比較して、肝硬変組織ではコラーゲン I、α-SMA、および HIF-1α が高度に過剰発現され、CAT 発現は暗い領域を示しました。これは、肝線維化が低酸素を伴い、CAT 発現が低下していることを示しています。

a 適応患者の臨床サンプルにおけるシリウスレッド染色 (スケールバー、50 μm) およびコラーゲン I、α-SMA、HIF-1α、および CAT の免疫染色 (スケールバー、50 μm) の代表的な画像。 b 正常肝組織切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）およびマッソン染色（スケールバー、50μm）、α-SMA、HIF-1α（スケールバー、50μm）、CAT（スケールバー、10μm）の免疫染色マウス、および CCl4 で 5 または 8 W 処理したマウス。スケール バー: 50 μm。 c 正常マウス、および CCl4 で 5 および 8 W 処理したマウスからの肝臓 HIF-1α、CAT、α-SMA 発現の代表的なウェスタンブロット (WB) 分析 (n = 4、平均 ± SD) SD）。 d 正常なマウスおよびCCl4で5または8W処理したマウスの肝臓のH2O2含有量（n = 4、平均±SD）。 正常マウスと比較した場合、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 (対応のないスチューデント t 検定)。

さらに、動物肝線維症モデルにおける肝低酸素/H2O2 の変化を調査し、Balb/c マウスを CCl4 で 5 週間 (W) および 8 週間処理して、さまざまな程度の肝線維症を模倣しました。 図1b、cに示すように、CCl4処理5Wマウスと比較して、CCl4処理8Wマウスでは低酸素シグナルの増加が観察され、CAT発現の減少が見られた。 次に、肝臓組織の H2O2 濃度を検出しました (図 1d)。 予想通り、CCl4 処理 8 W マウスの H2O2 濃度は、グルタチオン (GSH) 欠失と CAT 欠損により、正常マウスの 2 倍以上でした 30,31。 H2O2 が線維症の生成に重要な役割を果たすことが実証されているため、CAT 触媒活性は線維症の回復に重要です 32。 さらなる検証のために、LX-2およびHSC-T6を5％O2で12時間および24時間処理したところ、LX-2およびHSC-T6細胞でCAT発現の大幅な減少が検出されました（図2d）。 これらの結果は、低酸素が CAT 減少の原因であり、H2O2 の蓄積を引き起こすという事実を示しています。

線維症マウスの肝臓における CAT および HIF-1α を含む GO 用語の GO 濃縮分析。 b 「低酸素への反応」GO 用語に関連するさまざまに発現される遺伝子を示すヒートマップ。 c CAT相関遺伝子の機能関連ネットワーク。分析は、タンパク質間相互作用を検索するためのSTRINGデータベースに基づいていました。 d HSC-T6およびLX-2細胞に対する異なる処理下でのHIF-1α、TGF-β1、CAT、およびα-SMAの代表的なWB分析。 e SIS3の存在下または非存在下でTGF-β1 10 ng/mLで24時間刺激したHSC-T6およびLX-2のFoxo3aおよびCATのWB分析。 f HSC-T6 および LX-2 における CAT mRNA 発現の RT-qPCR 分析 (n = 3、平均 ± SD、*p < 0.05、**p < 0.01; ***p < 0.001、スチューデントの t 検定による)。 g CLSM 画像と HSC-T6 細胞のミトコンドリア。 5% O2 低酸素処理下の HSC-T6 における Mito Tracker Deep Red FM および DCFH-DA 染色の代表的な共焦点画像。 スケールバー、10μm。 h フローサイトメトリー分析によって分析された細胞内 ROS レベル。 i H2O2によって誘導されるHSC-T6およびLX-2におけるTGF-β1発現。 j HSCの低酸素調節機構の概略図。

肝線維症における低酸素と CAT の間の相互作用をさらに確認するために、CCl4 処理 8 W マウスと正常なマウスの肝臓を RNA トランスクリプトーム解析に供しました。 CCl4処理マウスではCATの下方制御が統計的に有意に検出され、CATの減少には酸化還元酵素活性、酸化還元プロセス、低酸素症への応答などのGO用語が関与していた（図2a）。 GO 用語「低酸素への応答」では、低酸素に関連する Egln3、Hif-1a、および線維症関連遺伝子 (Mmp2、Mmp14、Tgfb1、Tgfb2、および Smad3) が線維症マウスで観察的に上方制御されているが、細胞の重要な抗酸化物質であることがわかりました。 CATやSod2などの酵素が減少しました（図2b）。 タンパク質間の相互作用はSTRINGデータベースに基づいて分析され、CAT相関ネットワークはCystscope（v.3.8.2）によって視覚化されました。 マスター線維形成促進性サイトカイン TGF-β1 は CAT に直接関連していました (図 2c)。

以前の研究では、TGF-β1 が気道平滑筋細胞の Smad3 を活性化することによって CAT mRNA を強力に抑制することが実証されています 33,34。 TGF-β1/Smad3 経路により Foxo3a (フォークヘッドボックス型 O3a) およびその後の CAT mRNA の発現が制御されることが、心線維症においてさらに証明されています 35。 TGF-β1がCAT調節に関与していることを確認するために、HSCを低酸素およびTGF-β1と連続してインキュベートし、CAT発現に影響を与える因子を検証しました（図2dおよび補足図1a、b）。 HSC-T6 および LX-2 細胞では、低酸素状態により TGF-β1 の有意な増加が誘導され、CAT 発現が低下することが観察されました。 TGF-β1 処理細胞は CAT の効率的な抑制を示し、低酸素によって TGF-β1 の上方制御が誘導され、したがって CAT 発現が減少したことが示されました。 Smad3 特異的阻害剤である SIS3 を使用して、TGF-β1 誘導性の Smad3 活性化を阻害しました（補足図 1c）。 図2eに示すように、TGF-β1で処理したHSCは効果的に活性化され、Foxo3aおよびCATの発現が下方制御されました（補足図1d）。 このプロセスは、Smad3活性化の阻害によりSIS3で顕著にブロックされ、SIS3で活性HSCを処理した後、CAT mRNA発現は高度に回復しました（図2f）。 さらに、Nrf2 (核因子 (赤血球由来 2) 様 2) は CAT36 のもう 1 つの重要な調節因子でした。 低酸素症および TGF-β1 活性化 HSC では、Nrf2 発現が減少しました（補足図 2a、b）。 Nrf2 shRNA を通じて Nrf2 はさらに沈黙し、対照群と比較して CAT 発現量が減少しました。これは、Nrf2 摂動が低酸素と TGF-β1 誘導の両方に応答する CAT 制御に寄与していることを示しています（補足図 2c-e）。 したがって、低酸素によって引き起こされるTGF-β1は、Foxo3aおよびNrf2の阻害を通じてCAT発現を減少させる可能性があり、これは肝臓における重度のH2O2蓄積を誘導し、抗線維症治療の重要な標的となる可能性がある。

その後、2,7-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）とMitoTracker Deep Redを共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で共染色して低酸素誘発H2O2生成を調べ（図2g）、フローサイトメトリーで定量しました（ FCM）分析（図2h）。 DCF の強度は正常酸素下では弱かった。 しかし、低酸素処理により、DCF 蛍光が増加し、ミトコンドリア領域と良好な共局在を示しました。 ROS の一種として、H2O2 は OS を増加させ、HSC の活性化筋線維芽細胞への移行を刺激する可能性があります 3。 次に、増加した濃度のH2O2（50μM）をHSC-T6細胞およびLX-2細胞とインキュベートし、H2O2誘発性のTGF-β1発現を図2iおよび補足図1e、fで調べました。 結果は、図2jに示すように、低酸素症とCATの間の考えられる経路の1つを示しました。 典型的な手順では、肝臓の低酸素症によりミトコンドリア呼吸を通じて H2O2 生成が増加し、その結果生じる OS によって TGF-β1 発現が活性化されます。 過剰発現した TGF-β1 は、Foxo3a および Nrf2 の下方制御を通じて CAT 発現を制御することができ、これにより H2O2 が分解から保護されます。 この悪循環は HSC に慢性的な刺激を与え、抗線維症薬物療法における主な障壁となっていました。

肝臓の H2O2 蓄積は HSC に慢性的な刺激を与え、正常な肝臓の微小環境を破壊しました。 したがって、過剰な H2O2 を分解して O2 を生成する CAT 様化合物 MnO2 を導入しました。これにより、OS と組織の低酸素状態が緩和される可能性があります 37,38。 本研究では、疎水性抗線維化薬 Ssb1 を担持した生分解性ポリ（乳酸共グリコール酸）（PLGA）ナノ粒子（NP）を含むナノ薬物を設計し、それを MnO2 シェルでコーティングしました（MnO2@PLGA/Ssb1 NP）（図） 3a)39,40。 注射および体循環後、ナノサイズの MnO2@PLGA/Ssb1 NP は血管透過性が向上して線維化肝臓に蓄積しました 41。 細胞の H2O2 はさらに触媒作用を受けて O2 となり、低酸素刺激が改善され、放出された Ssb1 の治療効率が相乗的に強化されました。

a 線維化微小環境の調節による肝線維症治療のためのカタラーゼ様 MnO2@PLGA/Ssb1 ナノシステムの図。 b さまざまなナノ粒子の代表的な走査型電子顕微鏡 (SEM) および透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像。 スケールバー、100 nm。 c さまざまなナノ粒子の平均サイズ分布 (n = 3、平均 ± SD)。 d さまざまなナノ粒子のゼータ電位 (n = 3、平均 ± SD)。 e Ssb1、PLGA、PLGA/Ssb1、およびMnO2@PLGA/Ssb1の紫外可視スペクトル。 f PLGA / Ssb1 および MnO2@PLGA / Ssb1 ナノ粒子にロードされた Ssb1 の HPLC スペクトル。 g PLGA/Ssb1 および MnO2@PLGA/Ssb1 ナノ粒子の薬物放出速度 (n = 3、平均 ± SD)。 h MnO2@PLGA/Ssb1 を添加した後のさまざまな H2O2 量の O2 生成 (Mn 濃度 = 233 μM)。 i 44 mM H2O2 を使用したさまざまな MnO2@PLGA/Ssb1 の O2 生成。 j 異なる pH 値のバッファーでの MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn 濃度 = 117 μM) および H2O2 (22 mM) の O2 生成。

Ssb1 を搭載した PLGA NP (PLGA/Ssb1 NP) は、以前の研究に従って合成されました 42。 そして、過マンガン酸カリウム（KMnO4）の酸化還元を介してPLGA/Ssb1 NPの表面にMnO2を成長させ、MnO2@PLGA/Ssb1 NPを構築しました43。 顕微鏡画像、特に走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像では、PLGA/Ssb1 NP 上への MnO2 のコーティングが成功していることが明らかになりました。 PLGA 上への MnO2 のコーティングが成功したことで、球状形態を維持するための硬い支持体が提供されました (図 3b)。 補足図3aは、MnO2@PLGA / Ssb1 NPのMnとCの元素マッピングを示しました。 C元素は選択領域の一部に集中し、Mn元素は選択領域全体に分散しました。 統合されたマッピング画像は、MnO2 が NP の表面に正常に形成されたことをさらに裏付けました。 PLGA/Ssb1 および MnO2@PLGA/Ssb1 NP の平均流体力学的直径とゼータ電位を動的光散乱 (DLS) によって測定しました。MnO2@PLGA/Ssb1 のサイズと電位値は PLGA/Ssb1 のサイズと電位値よりも高く、これは可能性があります。これは、PLGA/Ssb1 NP 上の MnO2 コーティングに起因し、良好な in vitro および in vivo 安定性をもたらしました (図 3c、d)44,45。

NP における Ssb1 負荷を紫外可視 (UV-vis) 吸収分光法によって分析しました。 270〜400 nm内のSsb1の特徴的なトリプルピークが観察され、PLGA / Ssb1およびMnO2@PLGA / Ssb1 NPの210 nmでのPLGAの吸収ピークも設計された構造と一致していることがわかりました（図3e）。 PLGA/Ssb1 および MnO2@PLGA/Ssb1 NP 中の Ssb1 含有量の正確な測定は、HPLC によって適用されました。 Ssb1の標準曲線が検出され（補足図3b）、PLGA / Ssb1およびMnO2@PLGA / Ssb1におけるSsb1のカプセル化効率は最大65％および52.5％に達しました（図3f）。 次に、pH 7.4 における NP の in vitro 薬物放出を調査しました。 NPは同様の放出速度を示し、pH 7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）中で28時間以内にカプセル化されたSsb1の約85％を放出しました（図3g）。

MnO2 は、H2O2 を H2O と酸素に触媒する CAT 様酵素を模倣することが知られており、ナノサイズの MnO2@PLGA/Ssb1 は、その高い表面積対体積比により、より高い触媒効率を示すと考えられています。 MnO2@PLGA/Ssb1 の H2O2 分解能力を溶存酸素計で測定しました。 H2O2 の濃度を 0 から 44 mM に増加させると、MnO2 ベースのナノプラットフォーム (MnO2@PLGA/Ssb1) は、満足のいく O2 生成効果をもたらしました。 図3hに示すように、H2O2濃度が増加すると、触媒反応が明らかに強化され、溶存O2は50秒以内に0.5 mg/Lから6.9 mg/Lに急速に増加しました。 その後、さまざまな濃度での MnO2@PLGA/Ssb1 の酸素生成効率も 44 mM H2O2 で調べました。 O2生成の増加はMnO2@PLGA/Ssb1触媒含有量と相関しており、結果はH2O2に対するMnO2@PLGA/Ssb1ナノドラッグの触媒能力を示しました（図3i）。 O2 生成速度に対する pH 値の影響をさらに調査しました（図 3j）。 pH 5.0 および pH 6.5 の緩衝液では、pH 7.2 の緩衝液よりも O2 生成がわずかに高く、これは弱酸条件下で MnO2 の触媒効率が高いことを意味します。

SSb1 は、bupleurum herb47 由来の疎水性抗線維化化合物です。 現在の研究では、その抗線維化効果がTGF-β1活性化HSC-T6 / LX-2細胞で実証されました（図4aおよび補足図4a〜c）。 効率的な線維化促進サイトカインとして、TGF-β1 は HSC を活性化して筋線維芽細胞にし、α-SMA 発現を上方制御するために適用されました 48。 全体として、15 μM Ssb1 は、TGF-β1 刺激された HSC における α-SMA およびコラーゲン I の発現を有意に阻害できました。 さらに、Ssb1 の細胞毒性は、活性化 HSC が静止 HSC よりも高濃度 Ssb1 に対して感受性が高いことを示しました。 さらに、アポトーシスタンパク質カスパーゼ 3 の発現を検出したところ、切断型カスパーゼ 3 が勾配依存的に増加することが示され、Ssb1 が活性化 HSC のアポトーシスを誘導できることが示されました。

a HSC-T6 細胞を TGF-β1 (10 ng/mL) に曝露し、Ssb1 (0 ～ 15 μM) で 24 時間処理しました。 コラーゲン I、α-SMA、およびカスパーゼ 3 の発現をウェスタンブロットアッセイによって測定しました。 b–e MnO2@PLGA/Ssb1の細胞抗線維化効率。 TGF-β1によるさまざまな処理を行ったHSC-T6細胞(b)およびLX-2細胞(c)のα-SMAおよびHIF-1α発現をWBによってアッセイした。 HSC-T6細胞(d)およびLX-2細胞(e)のα-SMAおよびHIF-1αの発現レベルを免疫蛍光染色により評価した。 f 細胞性 ROS は、5% O2 低酸素下でさまざまな処理を行った HSC-T6 細胞において CLSM によって検出されました。 スケールバー、50μm。 g、h MnO2@PLGA/Ssb1 は、低酸素誘発性の H2O2 と TGF-β1 を減少させる可能性があります。 低酸素症によるさまざまな治療を受けたHSC-T6 (g) およびLX-2 (h) のHIF-1αおよびTGF-β1発現レベルをWBによってアッセイした。

MnO2@PLGA/Ssb1 の抗線維化効率を、TGF-β1 活性化 HSC-T6/LX-2 細胞で調査しました。 活性化されたHSCではミトコンドリアの活性酸素種（ROS）が増加し、それによってHIF-1α49の安定した発現が誘導されました。 図4b、cに示すように、α-SMAおよびHIF-1αは、TGF-β1処理細胞において有意に上方制御された。 他のグループでは、Ssb1、MnO2、および Ssb1 を負荷した PLGA/Ssb1 NP は、活性化 HSC における α-SMA および HIF-1α の発現を阻害し、MnO2@PLGA/Ssb1 で処理した細胞は、MnO2 の相乗効果により最高の抗線維化効率を示しました。およびSsb1（補足図4d）。 MnO2 は HSC に対する低酸素と ROS 刺激を減少させ、それによって Ssb1 の抗線維化効果を高めました。 α-SMAおよびHIF-1αの発現を免疫蛍光染色法によってさらに評価し、WBと同様の結果が得られました（図4d、e）。

図2dの結果により、HSC-T6およびLX-2細胞の活性化を誘導するために、24時間の低酸素（5％O2）処理を適用しました。 低酸素下では、HSC 内でミトコンドリア H2O2 生成が増加し、TGF-β1 発現を誘導し、これにより HSC が筋線維芽細胞に再プログラムされました。 図4fおよび補足図5aでは、細胞ROSがCLSMおよびFCM分析によって最初に検出されました。 低酸素処理群と比較して、MnO2@PLGA/Ssb1 でインキュベートした細胞は H2O2 の分解により DCF 蛍光の減少を示し、MnO2@PLGA/Ssb1 が低酸素誘発 ROS を低減し、HSC の OS を回避できることを示しました。 次に、低酸素症およびさまざまな材料で処理された HSC の TGF-β1 発現が検出されました。 図4g、hに示すように、MnO2@PLGA / Ssb1は、HSC-T6およびLX-2細胞におけるTGF-β1およびHIF-1αの発現を効率的に減少させることができました（補足図4e）。 結果は、我々が設計した MnO2@PLGA/Ssb1 ナノドラッグが線維化促進因子の低減に成功したことを示し、抗線維症治療における潜在的な応用を示しています。 さらに、低酸素下でのH2O2の蓄積によれば、HSC-T6におけるH2O2誘発性のTGF-β1発現も検出されました（補足図5b）。 MnO2@PLGA/Ssb1 処理は、HSC における H2O2 によって誘発される OS の軽減により、TGF-β1 を効率的に減少させることができました。

NP は、光学イメージング (PLGA/DiR および MnO2@PLGA/DiR NP) のために、近赤外吸収シアニン色素 1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドトリカルボシアニン ヨージド (DiR ヨージド) で標識されました 50。 体内循環中の PLGA/DiR および MnO2@PLGA/DiR の in vivo 蓄積を、小動物蛍光イメージング システムを使用してモニタリングしました。 8時間の注射後、DiRの蛍光がマウスに蓄積されたように見え、その後主要な臓器が画像化されました（図5a、b）。 遊離の DiR と比較して、PLGA/DiR および MnO2@PLGA/DiR は主に肝臓と肺に集中しており、粒子サイズは約 200 nm でした。 この現象は、150 nm を超える球状粒子は体内循環後の肝臓と肺に主に捕捉される傾向があるという以前の報告と一致していました 41,51,52。

a iv 注射により DiR を担持したナノ粒子を投与されたマウスの代表的な in vivo 蛍光画像。 (n = 3、平均 ± SD、*スチューデントの t 検定による p < 0.05)。 b DiR を充填したナノ粒子の注射から 8 時間後の肝臓および他の重要な臓器の蛍光イメージング (H、Li、S、Lu、および Ki は心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓を表します)。 c 組織ホモジェネート中の Ssb1 の定量 (n = 6、平均 ± SD)。 d MnO2およびMnO2@PLGA / Ssb1ナノ粒子の静脈内注射後のMn元素の体内分布（n = 5、平均±SD）。

主要臓器における Ssb1 と MnO2 の体内分布は、抗線維症治療における用量決定のために、液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) および誘導結合血漿質量分析法 (ICP-MS) によってさらに定量化されました。 図5cに示すように、Ssb1は主に肝臓、肺、腎臓に分布していましたが、Ssb1のみ、PLGA / Ssb1、およびMnO2@PLGA / Ssb1の分布には有意な差はありませんでした。 図5dは、MnO2とMnO2@PLGA/Ssb1のマンガン濃度が主要臓器で類似しており、マンガン元素が肝臓と腎臓に特に集中していることを示しています。 Ssb1 および Mn の定量的結果は、DiR 標識された in vivo イメージングの結果と一致しており、したがって、次の治療用量の指針となる可能性があります。

線維症マウスは、40％CCl4を5W注射して確立され、その後WB、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）、およびマッソントリクローム染色で分析されました（補足図6a、b）。 マウス肝臓におけるSsb1およびMnO2の体内分布に基づいて、治療用量を計算し、週に1回静脈内注射しました（図6a）。 ３週間の治療後、抗線維症指数を測定するためにマウスを屠殺した。 SSb1処置マウスのRNA配列決定を行ったところ、差次的に発現する遺伝子のほとんどが「ECM-受容体相互作用」KEGG経路に富んでいた。 この経路のヒートマップでは、Col1a1、Col1a2、Col4a1、Col4a2、Col4a5、Col6a1、Col6a2、Col6a3 などのコラーゲン遺伝子が Ssb1 グループで大幅に減少していることが明らかであり、Ssb1 が線維化肝臓におけるコラーゲン発現を下方制御できることが示されました (補足図7)。

a 動物実験の全体手順（CCl4 誘発肝線維症）。 b 異なる治療を受けた肝臓の H2O2 含有量 (n = 3、平均 ± SD、# モデルと正常との比較、*他のグループとモデルとの比較)。 c肝臓のHIF-1α、コラーゲンI、TGF-β1、およびα-SMAの発現レベルをWBによって測定しました。 d 肝臓CAT、HIF-1αを免疫蛍光染色により評価した(スケールバー、50μm)。 e マウス組織切片のα-SMAおよびTUNEL染色（スケールバー、50μm）。 f 代表的な H&E およびマッソン染色肝臓組織切片。 マッソン染色切片の青い領域は、線維化肝組織におけるコラーゲンの沈着を示します (スケール バー、100 μm)。 g AST、ALT、TBIL、および ALP の血清レベルを生化学アッセイによって測定しました (n = 5、平均 ± SD)。 h 血清肝線維症の 4 つの指標 (HA、LN、PCIII、および IV-C) を ELISA によって測定しました (n = 5、平均 ± SD)。 (*p < 0.05、**p < 0.01; ***p < 0.001 (スチューデントの t 検定による)。

図6bに示すように、H2O2は未治療の線維化肝臓では高度に蓄積し、MnO2、PLGA / Ssb1、およびMnO2@PLGA / Ssb1治療グループでは減少しました。 H2O2 含有量の減少により肝臓の OS が低下し、それによって静止状態の HSC のさらなる活性化が回避されました 53。 MnO2@PLGA / Ssb1処理マウスにおけるHIF-1αおよびTGF-β1の発現は、H2O2の分解とO2生成により予想どおり大幅に減少しました（図6cおよび補足図6c）。 さらに、MnO2 と Ssb1 の相乗的調整により、線維性タンパク質 α-SMA とコラーゲン I も、MnO2、PLGA/Ssb1、MnO2@PLGA/Ssb1 処置マウスで減少しました。 肝臓組織をスライスし、免疫蛍光染色して、HIF-1α、CAT、およびα-SMAの組織発現をモニタリングしました（図6dおよび補足図6d）。 線維症マウスおよび Ssb1 治療と比較して、MnO2@PLGA/Ssb1 治療マウスでは低酸素症が効率的に改善され、肝臓における HIF-1α および α-SMA の下方制御が誘導されました。 TUNEL 染色は、α-SMA の共染色とともに実行されました。 図6eでは、ナノサイズのPLGA / Ssb1およびMnO2@PLGA / Ssb1は、Ssb1よりも効率的なアポトーシスを示し、ナノフォームでのSsb1の利用率が高いことを示しています。 H&E 染色およびマッソン染色した肝臓切片をさらに調査したところ、未治療マウスでは肝損傷により顕著な炎症性細胞凝集と十字型コラーゲン線維が誘発され、この現象は線維症回復のために MnO2@PLGA/Ssb1 治療マウスでは目に見えて軽減されたことが示されました (図.6f）。

追加の血液学的検査（図6g）により、TBIL、ALT、ASTを含む肝機能指数がMnO2@PLGA / Ssb1グループで大幅に回復したことが明らかになり、MnO2@PLGA / Ssb1が抗線維症治療に本当に有効であることが示されました。 マウス血清の 4 つの指標 (HA、LN、PIIINP、および IV-C) も、臨床検査指標とさらに一致するように酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) によって測定されました。 図6hに示すように、ラミニン（LN）、IV型コラーゲン（CIV）、およびPIIINPの血清レベルは、PBSを注射したマウスよりもMnO2@PLGA / Ssb1を注射した線維症マウスの方が大幅に減少しました。 これらすべての結果は、MnO2 と Ssb1 の組み合わせが抗線維症効率の向上を実際に達成したことを示しています。

Ssb1、PLGA/Ssb1、および MnO2@PLGA/Ssb1 の生物学的安全性は、材料の安全性を確保するために in vitro と in vivo の両方で調査されました。 静止状態の HSC-T6 および LX-2 細胞を、最初にさまざまな濃度の Ssb1、PLGA/Ssb1、および MnO2@PLGA/Ssb1 とインキュベートしました (図 7a、b)。 50 μM Ssb1 は HSC-T6 と LX-2 の両方で細胞生存率を妨げず、Ssb1 を負荷した PLGA/Ssb1 および MnO2@PLGA/Ssb1 は細胞増殖に余分な負担を示さなかったことから、この抗線維性ナノドラッグの良好な生体適合性が示されました。 次に、Balb/c マウスに対するナノドラッグの in vivo 急性毒性を 3 日間の連続注射で調査しました。 組織 (心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓) を収集し、H&E 染色によって分析しました (図 7c)。 図5bに示すように、PLGA / Ssb1およびMnO2@PLGA / Ssb1 NPは主に肝臓と肺に蓄積し、肝臓と肺の組織病理学的検査では炎症細胞浸潤や組織形態に有意性は示されませんでした。 血液学的検査でも、血中ALT、AST、およびALP値の間にほとんど差がないことが明らかになりました（図7d）。 これらの結果は、利用した Ssb1、MnO2、および Ssb1 負荷 NP の十分な生物学的安全性を明らかにしました。

異なる濃度の物質を使用した HSC (a) および LX-2 (b) 細胞の細胞生存率 (n = 4、平均 ± SD)。 1日8.25 mg/kg Ssb1を3日間注射したマウスの肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺を含む臓器のH&E染色画像（c）および血液生化学（d）（n = 5、平均±SD） 。 Ssb1ナノ粒子で処理したマウスからは、明らかな臓器損傷または病変は観察されなかった(スケールバー、100μm)。

TGF-β1 は、HSC の活性化を促進する古典的な線維化促進サイトカインであり、in vitro 線維化モデルの構築に広く使用されています 54。 以前の研究では、CAT に対する TGF-β1 の影響が気道平滑筋細胞で調査されましたが、それ以上の注目は集められませんでした 33。 肝臓/肺線維症における CAT 活性の低下 55 は過去数十年にわたって観察されており、これが細胞の酸化還元不均衡の原因であると報告されています 56。 本研究は、肝低酸素症が TGF-β1 発現の増加を誘導し、HSC における Foxo3a および Nrf2 の下方制御を通じて CAT 発現を効果的に阻害することを示しました。 肝臓の CAT 阻害の結果、線維化領域では H2O2 の蓄積が増加し、安定した HIF-1α が形成されました。 さらに、H2O2 と HIF-1α は TGF-β1 の上方制御をさらに刺激する可能性があり、これが悪循環を引き起こし、肝線維症治療の困難な障壁として機能します 13。

私たちは、肝臓の低酸素状態とOSがHSCに対して慢性的かつ継続的な刺激を与え、それによって線維症の回復に困難を与えていると提案しました。 線維化促進環境では、TGF-β1 は CAT 活性を低下させ、その後 H2O2 の蓄積を誘導しました。 過剰な H2O2 はさらに TGF-β1 を増加させ、悪循環を確立しました。 このため、円環を破るためのターゲットとして H2O2 が選択され、H2O2 分解に対する CAT のような活性を表すために MnO2 が適用されました。 MnO2 は、低酸素症と OS を改善することによって線維化微小環境を改造し、それによって原因からの線維化促進刺激を軽減しました。 Ssb1 と脱グリコシル化された代謝産物は、CYP3A457 を阻害することで肝臓の標的化を強化することが報告されています。 さらに、Ssb1 を含むサイコサポニンは、CCl4 誘発性肝損傷から肝臓を保護する可能性があります 58。 予想通り、Ssb1 単独治療は in vitro 実験で α-SMA 発現を阻害できましたが、Balb/c マウスの肝線維症を逆転させる効果はほとんどなく、MnO2@PLGA/Ssb1 は in vitro および in vivo 実験でより効率的な治療効果を示しました。

要約すると、肝臓の低酸素とOSが肝臓線維形成の重要な因子であり、低酸素誘発性のTGF-β1がHSCにおけるCAT発現を調節することを実証した。 構築された MnO2@PLGA/Ssb1 ナノドラッグは、肝臓の低酸素症と OS を軽減し、Ssb1 の抗線維化効率を高める能力を示しました。 したがって、それは肝線維症の治療への治療的アプローチとなり得る。 この戦略に基づいて、低酸素症と OS に対するより有望な解決策が、肺線維症や腎線維症などの他の線維性疾患にも適用される可能性があります。

すべての動物実験は浙江中国医科大学（中国杭州、プロジェクト番号SYXK（浙）2021-0012）の倫理委員会の承認を受けており、すべての動物は十分な管理を受けています。 パラフィン包埋ヒト肝臓組織は、貴州中医薬大学第一付属病院から入手し、貴州中医薬大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されました（プロジェクト番号 K2021-066）。

Ssb1 (Desit、成都、中国)、PLGA (ラクチド/グリコリド = 50/50; MW: 94,000 Da; MedChemExpress、米国)、ポリビニル アルコール (PVA; BBI Co., Ltd.、上海、中国)、2-( N-モルホリン)エタンスルホン酸 (MES; Heowns Biochem LLC、中国、天津)、KMnO4 (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.、上海、中国)、放射性免疫沈降アッセイ (RIPA) 緩衝液 (Solarbio、北京、中国)、フェニルメタンスルホニルフルオリド (PMSF、1:100、Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州、米国) および 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロミド (MTT; Solarbio、北京、中国) を購入しました受け取ったまま使用します。 TUNEL、DCFH-DA、およびヨウ化 DiR は Beyotime Ltd. (上海、中国) から購入しました。 ウシ胎児血清 (FBS)、トリプシン-EDTA 溶液 (0.25 %)、およびダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) は、Gibco (バーリントン、カナダ) から入手しました。 入手可能な最高純度の他の化学物質および試薬はすべて商業供給源から入手しました。

免疫蛍光染色は、メタノールとアセトンの混合物で固定された凍結切片（厚さ4μm）で実行されました。 切片を 5% ヤギ血清でブロックし、特別な一次抗体 (コラーゲン I、1:1000、14695-1-AP、Proteintech、α-SMA、1:1000、cs19245、Cell Signaling Technology (CST)、HIF) とインキュベートしました。 -1α、1:1000、cs36169、CST、および CAT、1:2000、66765-1-Ig、Proteintech) を 4 °C で一晩投与し、続いて Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 二次抗体を投与しました。抗体 (1:200、A0423、Beyotime)。 最後に、スライドを DAPI でマウントしました。 すべての切片は蛍光顕微鏡 (ZEISS、AXIO SCOPE.A1) で観察および分析されました。 パラフィン包埋ヒト肝臓組織を再水和し、シリウスレッド染色キット (RS1220、G-CLONE) を使用して染色し、コラーゲン分布をモニタリングしました。

ヒト HSC 株 LX-2 は、Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。 ラット肝星細胞株 HSC-T6 は、Su Tao 教授 (広州中医薬大学) の寛大なご提供により提供されました。 LX-2 および HSC-T6 細胞は、10% (v/v) FBS および 1% ペニシリン - ストレプトマイシンを添加した DMEM 中で、5% CO2 を含む加湿雰囲気下、37 °C で培養されました。

低酸素刺激のために、HSC を無血清培地で 24 時間インキュベートしました。 次に、培養プレートを、酸素分圧が 5% に低下するまで、5% CO2 と 95% N2 を含むガス混合物でフラッシュした低酸素インキュベーター チャンバー (Billups-Rothenberg、CA、USA) 内でインキュベートしました。 低酸素インキュベーターチャンバーを密閉し、37 °C でさらに 24 時間または 48 時間インキュベートしました。 対照群では、細胞を正常酸素下(21%酸素分圧)で培養し、TGF-β1(10ng/mL)でチャレンジした細胞を陽性対照として正常酸素下で培養した。

Smad3 の活性化は、特異的阻害剤 SIS3 (MACKLIN、s872443) を使用して阻害されました。 阻害実験のために、細胞を３μＭのＳＩＳ３とともに１時間インキュベートした後、ＴＧＦ－β１（１０ｎｇ／ｍｌ、２４時間）インキュベートした。 24 時間後、WB および PCR テキスト用に細胞を収集しました。

メーカー（Promega、中国）の指示に従って、Eastep Super Total RNA Extraction Kitを使用して、全細胞RNAを抽出しました。 RNA の定量と濃度は、NanoDrop™ 2000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用して測定しました。 Yfx Script First Strand cDNA Synthesis Kit (YIFEIXUE BIO TECH、中国) を使用して、1 μg の全 RNA から cDNA を合成しました。 リアルタイム PCR は、メーカーのプロトコールに従って、2x SYBR Green Fast qPCR Master Mix および Light Cycle 96 System (Roche) を使用して実行されました。 プライマー配列を以下に示す。ラットカタラーゼ I フォワードプライマー: 5'-CCCAGAAGCCTAAGAATGCAA-3'。 リバースプライマー: 5'-TCCCTTGGCAGCTATGTGAGA-3'; ラット b-アクチン フォワード プライマー: 5'-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3'; リバースプライマー: 5'-TCATCCATGGCGAACTGGTGG-3'; ヒトカタラーゼ I フォワードプライマー: 5'-CTTCGACCCAAGCAACATGC-3'; リバースプライマー: 5'-ATTTGGAGCACCACCCTGATT-3'; 相対発現レベルは、2-ΔΔCt 式を使用して計算されました。 すべてのテストは 3 つの生物学的反復で実行されました。

Nrf2 shRNA プラスミドは、Shanghai Genechem Co. Ltd. (上海、中国) から購入し、配列結果は補足データ 1 に記載されています。Nrf2 shRNA または対照としての空のプラスミドをトランスフェクションすることによって、Nrf2 をノックダウンしました。 簡単に説明すると、HSC-T6 細胞を 12 ウェル プレート上で 60 ～ 70% コンフルエンスまで増殖させました。 HSC-T6細胞を、リポフェクタミン3000トランスフェクションキット(Invitrogen、米国)に包まれたプラスミド(1μg)とともにインキュベートした。

DCFH-DA59の蛍光プローブを使用してROSの細胞内レベルをモニタリングした。 典型的な手順では、ガラス底ディッシュ内の 5 × 105 細胞/ウェルの密度の HSC を、異なる処理で正常酸素状態と低酸素状態 (5% O2) に曝露しました。 約24時間後、細胞を10μM DCFH-DAおよび100nM Mito Tracker Deep Red FMとともに作業溶液中で37℃、暗所で30分間インキュベートしました。 次に、培地を除去し、HSC細胞をPBSで3回洗浄した。 蛍光シグナルは、CLSM システム (Zeiss、LSM880、ドイツ) および CytoFlex フローサイトメトリー (Beckmancoulter、CytoFlex、米国) で分析されました。

Ssb1 をロードした PLGA NP (PLGA/Ssb1 NP) は、エマルジョン溶媒蒸発プロセスを通じて調製されました 43。 ＰＬＧＡおよびＳｓｂ１を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬの濃度でアセトンに溶解した。 次に、調製したアセトン溶液 1 mL を、マグネチックスターラーで 37 ℃、毎分 200 サイクルの速度で加熱した油浴中のポリビニル アルコール (PVA) 溶液 (10 mg/mL) 4 mL に滴下しました。 次いで、得られた溶液を６時間撹拌して、アセトン溶液を完全に蒸発させた。 最後に、NPを15,000×gで10分間遠心分離して過剰なPVAを除去し、超純水で2回洗浄して、精製Ssb1/PLGAコアを得た。

MnO2@PLGA/Ssb1 NP を調製するために、超音波条件下で 5 mM 過マンガン酸カリウムを 30 分間添加した後、酸化還元法によって MES バッファー (pH 5.9) 中で PLGA/Ssb1 NP の表面に層状酸化マンガンを形成しました。 次に、NP を 15,000 g で 10 分間遠心分離して、遊離酸化マンガン NP と MES を除去し、超純水で 2 回洗浄して、精製 MnO2@PLGA/Ssb1 NP を得ました。

NP の流体力学的サイズ分布と表面電位は、DLS (ZEN 3600 Zetasizer、Malvern) によって 25 °C で測定されました。 NP の表面形態を SEM および透過型電子顕微鏡で観察しました。 元素マッピングは透過型電子顕微鏡 (FEI Talos F200S) を使用して実施されました。 マンガン含有量は、ICP-MS システム (Thermo Fisher ICAP QC) で測定しました。

MnO2@PLGA/Ssb1 NP を最初にアセトニトリルに溶解し、超音波処理して Ssb1 を完全に溶解しました。 Ｓｓｂ１濃度は、以下の条件下でＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）により測定した。 HPLC カラムは XDB-C18 カラム (4.6 × 250 mm 5.0 μm、Agilent Technologies) であり、移動相はアセトニトリルと水で構成されていました。 カラム温度は 30 °C で、254 nm で検出されました。 流速は1.0mL/min、注入量は10μLであった。 薬物のカプセル化効率は、処方箋に含まれる全薬物に対するカプセル化効率 (EE) に基づいて推定されました。

in vitro 放出研究では、超純水に溶解した PLGA/Ssb1@MnO2 および PLGA/Ssb1 サンプルを透析膜バッグ (MWCO: 1000; Scientific Research Special) に入れ、2 mL の放出媒体 PBS (0.01 M) に懸濁しました。 pH7.4。 放出アッセイは、37.0 ± 0.5 °C、150 rpm/分の撹拌速度で実施されました。 所定の時間間隔で透析バッグの外側の溶液から溶解媒体１ｍＬを取り出した後、同量の対応する放出媒体溶液を補充した。 NP から放出媒体中に放出された Ssb1 の濃度は、UV-vis アッセイを使用して定量されました。

発生するO2は、流動パラフィン3mLで密閉し空気を遮断した環境下で、溶存酸素計JPSJ-605Fを用いて測定しました。 検査前に、溶存 O2 をバブリング窒素を通して値が 0.5 mg/L に減少するまで排出しました。 さまざまな濃度（0、11、33、および 44 mM）の H2O2 を含む溶液（10 mL）を MnO2@PLGA/Ssb1（Mn 濃度: 233 μM）に添加して、O2 を生成しました。 溶存酸素計の読み取り値を 10 秒ごとに 50 回記録しました。 異なる濃度の MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn 濃度: 0、58、176、および 233 μM) を 44 mM H2O2 で検出し、溶存 O2 を上記と同じ方法で記録しました。 その後、pH 5.0、pH 6.5、および pH 7.2 緩衝液中の H2O2 (22 mM) の MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn: 117 μM) 触媒作用が、溶解した O2 を通して検出されました。

MTT を使用して、休止状態および TGF-β1 活性化 HSC-T6/LX-2 細胞に対する Ssb1 の細胞毒性を測定しました。 HSC-T6細胞とLX-2細胞を96ウェル培養プレートに1×104細胞/ウェルの密度で別々に播種し、37℃でインキュベートしました。 12 時間後、静止 HSC の場合は細胞を無血清 DMEM に移し、活性化 HSC の場合は 10 ng/mL TGF-β1 で 30 分間処理しました。 次に、細胞をさまざまな濃度の Ssb1 で処理し、24 時間共培養しました。 次いで、２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、４時間インキュベートした。 ホルマザンが形成された場合、培養物を除去し、150μLのDMSOを加えてホルマザンを溶解した。 光学濃度値は、マイクロプレートリーダー(Bio-Rad)を使用して570nmで測定した。

HSC-T6 細胞と LX-2 細胞を 5 × 105 細胞/ウェルの密度で 6 ウェル培養プレートに播種し、37 °C でインキュベートしました。 12時間後、細胞を無血清DMEMに移し、10ng/mLのTGF-β1で30分間処理し、その後、5、10、15μMのSsb1を24時間添加した。 コラーゲン I、α-SMA、およびカスパーゼ 3 の発現は、WB を使用して定量化されました。

さまざまな Ssb1 含有製剤の抗線維化効果をテストするために、HSC-T6 および LX-2 細胞を 5 × 105 細胞/ウェルの密度で 6 ウェル培養プレートに播種し、37 °C でインキュベートしました。 12時間後、細胞を無血清DMEMに移し、10ng/mLのTGF-β1で30分間処理し、その後、異なる配合物(15μM Ssb1)を24時間添加した。 薬物介入の前に、細胞を無血清DMEM中で24時間同期させた。 HSC-T6 および LX-2 細胞の場合、培地をさまざまな溶液に置き換えました: (1) 無血清 DMEM、(2) 10 ng/mL TGF-β1 を含む無血清 DMEM、(3) 無血清 DMEM 10 ng/mL TGF-β1 および 15 μM Ssb1 を含む、(4) 10 ng/mL TGF-β1 および MnO2 NP を含む無血清 DMEM (9.9 μM Mn を負荷)。 （５）１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１およびＰＬＧＡ／Ｓｓｂ１を含む無血清ＤＭＥＭ（１５μＭのＳｓｂ１を負荷）。 (6) 10 ng/mL TGF-β1 および MnO2@PLGA/Ssb1 を含む無血清 DMEM (15 μM Ssb1、9.9 μM Mn を負荷)。 24 時間の処理後、細胞を使用して、WB および免疫蛍光染色分析を使用して線維症関連タンパク質の発現を評価しました。 さらなる実験のために、細胞を24時間の低酸素または50μM H2O2処理に供し、他の切片は未処理のままにした。

NP の組織分布は、Ssb1 負荷 NP の代わりに DiR 負荷 NP を使用して決定されました 50,60。 マウスを麻酔し、遊離 DiR、PLGA/DiR、および MnO2@PLGA/DiR (DiR/体重 = 2.5 mg/kg、100 μL) をマウスに静脈内注射しました。 注射の 0.5、1、4、および 8 時間後に、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、in vivo イメージング システム (AniView600) を使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ 745 nm および 800 nm で in vivo 蛍光イメージングを行いました。 8 時間後、マウスを屠殺し、同じシステムを使用した ex vivo イメージングのために心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓を取り出しました。

体内分布測定のために、健康な Balb/c マウスに Ssb1、MnO2、および PLGA/Ssb1 を静脈内注射しました (マウスあたり 100 μL、Ssb1 重量濃度で用量 = 8.25 mg/kg)。 対照群には100μLのPBSを静脈内注射した。 １グループ当たり６匹のマウスを使用した。 心臓 (H)、肝臓 (L)、脾臓 (S)、肺 (Lu)、腎臓 (K) を含む主要な臓器を注射の 8 時間後に採取しました。 臓器の重量を測定した。 組織をPBS中でホモジナイズした。 Ssb1 はタンパク質沈殿によって組織から抽出されました。 約200μLのホモジネートを400μLのアセトニトリル(4℃)で処理し、3分間ボルテックス混合した。 混合物を15,000×gで5分間(4℃)遠心分離した。 上清を収集し、分析した。

さまざまな配合物中の Ssb1 の分布を LC-MS/MS によって分析しました。 ネガティブモードは、Waters Xevo G2-XS QTOF 質量分析計 (Waters、英国マンチェスター) で操作し、Acquity I クラス UPLC システム (Waters、米国ミルフォード、Acquity HSS T3 カラム) と組み合わせました。 質量分析装置は、高速 DDA の場合は 0.1 秒のスキャン時間でフルスキャンで 50 ～ 2000 Da の質量範囲をスキャンし、MS/MS の場合は同じスキャン時間で m/z 150 ～ 1300 の質量範囲をスキャンしました。 LockSpray は、10 ng/L ロイシン-エンケファリン溶液を用いて 10 μL/分の流速で実施されました。 分離のための UPLC 溶出勾配は次のとおりでした。0 分で 20% の溶媒 B (アセトニトリル)。 12分で溶媒Bの52%。 22 分で溶媒 B が 90%。 30分で20%の溶媒B。 流速は０．３ｍＬ／分であった。 データ分析は、MassLynx V4.1 ソフトウェア (Waters、ミルフォード、米国) を使用して実行されました。 分析証明書は、ACQUITY UPLC® HSS T3、1.8 μL (Waters、マンチェスター、英国) で実行されました。

Ｍｎの含有量はＩＣＰ−ＭＳにより測定した。 臓器 (50 μL) をシンチレーションバイアルに移しました。 硝酸 (100 μL) を加え、バイアルを密閉し、臓器を 37 °C で 20 時間放置して消化させました。 100 µL の臓器消化物を 1 mL の超純水で希釈した後、各動物に使用した注射量に基づいて ICP を使用して Mn 含有量を計算しました (マウスあたり 0.16 ～ 0.22 µmol、平均で、投与された MnO2 用量は 10 µmol/kg、0.2 µmol でした) /ねずみ）

すべての実験手順は、浙江中国医科大学（中国杭州）の動物の管理と使用に関する施設および地域委員会の承認を受けました。 国立衛生研究所のガイドラインに従って、動物全体に人道的なケアが施されました。 体重約 18 ～ 22 g の雄の Balb/c マウスを、浙江中国医科大学 (中国杭州) の実験動物センターから購入しました。 マウスは 25 °C で飼育され、湿度 40 ～ 60%、明暗サイクル 12 時間の環境に置かれ、特に指定がない限り水と実験用飼料を自由に摂取させました。 実験を開始する前に、すべてのマウスを 1 週間環境に適応させました。 オリーブ油中の CCl4 (0.06 mL/体重 20 g) の混合物 (2:3 (v/v)) を利用して、週 2 回、5 週間 (W) または 8 W にわたって皮下注射することにより、マウスの肝線維症を誘発しました。未治療群には健康対照群と同量のコーン油を投与した。

治療研究のために、40% CCl4 を 5 回投与した後、雄の Balb/c マウスをランダムに 7 つのグループに分けました (1 グループあたり 5 匹のマウス)。 次に、マウスを以下の溶液で週に 1 回 3 回治療しました: グループ 1、対照グループ。 グループ 2、尾静脈注射による PBS。 グループ 3 ～ 6、線維症マウス (Ssb1/体重 = 10:1 mg/kg) に、それぞれ 100 mL の滅菌 PBS に懸濁した遊離 Ssb1、MnO2、PLGA/Ssb1、および MnO2@PLGA/Ssb1 を静脈内注射しました。 グループ 2 ～ 6 のマウスには CCl4 を週に 1 回 6 ～ 8 W 皮下注射し、対照グループには同量のオリーブオイルを投与しました。

最後の注射から 1 日後、すべてのマウスが処刑され、血液と肝臓が採取されました。 アルカリホスファターゼ (ALP)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)、およびアラニン アミノトランスフェラーゼ (ALT) の血清レベルを自動生化学分析装置で測定しました。 血清肝線維症の 4 つの指標 (HA、LN、PIIINP、および IV-C) を ELISA キットで分析しました。 肝臓組織を解剖し、その後の組織学的分析のために 10% ホルマリン中で保存しました。 肝臓の一部は、その後のウェスタンブロット分析のために液体窒素中に保存されました。

H2O2 蓄積は、H2O2 アッセイキット (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute、中国) を使用して測定しました。 瞬間凍結した肝臓組織を生理食塩水でホモジナイズしました。 次いで、製造業者の指示に従ってＨ ２ Ｏ ２ 濃度を測定した。

MnO2@PLGA/Ssb1、PLGA/Ssb1、および Ssb1 の in vitro 細胞毒性評価は、MTT アッセイによって実施されました。 HSC-T6 および LX-2 細胞を 1 ウェルあたり 1 × 104 細胞の密度で 96 ウェル プレートに播種し、10% (v/v) FBS を補充した 100 μL の培地で増殖させました。 37℃で24時間後、培地を除去し、細胞をさまざまな濃度のPLGA/Ssb1@MnO2、PLGA/Ssb1、または遊離Ssb1溶液を含む新鮮な培地200μLで24時間インキュベートしました。 次に、20 μL の MTT 溶液 (5 mg/mL) を各ウェルに添加し、さらに 37 °C で 4 時間インキュベートしました。 最後に、MTT を含む培地を除去し、150 μL の DMSO を加えてホルマザン結晶を溶解しました。 OD570 nm はマイクロプレートリーダー (Synergy H1, Biotek, USA) で測定しました。 すべての実験は 4 回繰り返して行われました。 未処理の細胞を対照として使用した。

ナノシステムの生物学的安全性を確保するために、急性毒性が評価されました。 Balb/c マウスをそれぞれ、PBS (未処理)、Ssb1、MnO2、PLGA/Ssb1、および MnO2@PLGA/Ssb1 の 5 つのグループ (n = 5) に分けました。 すべてのグループのマウスに、異なる溶液 (0.1 mL; 同等の Ssb1 濃度 1.65 mg/mL を含む) を 1 日 1 回、連続 3 日間局所静脈内注射しました。 最後の注射から 24 時間後にマウスを屠殺し、主要臓器 (心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓) を解剖し、その後の H&E 染色のために 10% パラホルムアルデヒド中に保存しました。 血液を採取し、AST、ALT、ALP を分析して、in vivo の急性毒性を評価しました。

フェニルメタンスルホニルフルオリド (PMSF、8553、CST) を添加した放射性免疫沈降アッセイ (RIPA) バッファー (R0010、Solarbio) を使用して、細胞から総タンパク質を抽出しました。 タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキット(P0011、Beyotime)を用いて測定した。 タンパク質をSDS-PAGEゲル（ドデシルポリアクリルアミドナトリウムゲル電気泳動）にロードし、エレクトロブロッティングによってポリ二フッ化ビニリデン（PVDF）膜（IPVH00010 Merck Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）に転写しました。 膜は、５％スキムミルクを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水中で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートすることによってブロックされた。 次に、これらをまず適切な一次抗体、a-SMA (1:1000、14395-1-AP、Proteintech)、CAT (1:2000、21260-1-AP、Proteintech)、HIF-1α (1:1000) とインキュベートしました。 、AF1009、アフィニティ)、カスパーゼ-3 p12 (1:1000、ab179517、アブカム)、TGF-β1 (1:1000、ab215715、アブカム)、コラーゲン I (1:1000、14695-1-AP、プロテインテック)、コラーゲンI (1:1000、ab34710、アブカム) GAPDH (1:5000、AF1186、Beyotime)、α-チューブリン (1:5000、11224-1-AP、プロテインテック)、Foxo3a (1:1000、AF7624、アフィニティー)、CAT (1:2000、66765-1-Ig)、Nrf2 (1:1000、16396-1-AP)、および β-アクチン (1:5000、66009-1-Ig) を含む一次抗体希釈液 (P0023A、Beyotime)一晩で4℃。 その後、メンブレンを HRP 結合抗ウサギ IgG (1:5000、ab97051、Abcam) または抗マウス IgG (1:5000、BA1050、Boster) 二次抗体とともに室温で 1 時間インキュベートしました。 免疫反応性バンドは、ChemiDoc™ Touch 画像システム (ChemiDoc™ Touch、Bio-Rad、カリフォルニア州、米国) を使用して視覚化しました。 一部の実験では、以前の一次抗体と二次抗体をストリッピングバッファー (SW3022、Solarbio) を使用して 30 分間 PVDF 膜から剥離しました。 再ブロックした後、メンブレンを別の一次抗体とともに 4 °C で一晩再インキュベートしました。 次の手順は上記と同じです。 ImageJ ソフトウェアを使用して濃度測定により定量化し、タンパク質発現レベルを GAPDH に対して正規化しました。

肝臓組織を 10% ホルマリンに浸し、パラフィンに包埋しました。 得られた組織を前処理し、脱水し、パラフィンに包埋した。 パラフィン包埋肝臓組織を 4 μm の切片に切断しました。 脱パラフィンおよび水和後、切片を染色した。 組織構造に応じた病理学的評価には H&E が使用されました。 マッソン染色を使用してコラーゲンを評価した。 顕微鏡 (ZEISS Axio Vert. A1) を使用して、これらの染色切片の写真をランダムな視野で撮影しました。

すべての結果が正確であることを確認するために、すべてのテストが 3 回以上繰り返されました。 定量的データは、平均±標準偏差 (SD) として表されました。 データは平均値として表示され、2 つのグループの比較のためにそれぞれ Student の t 検定または Mann-Whitney U 検定によって分析されます。 すべてのグラフは、GraphPad prism 8 バージョン ソフトウェアを使用して描画されました。 P < 0.05 は統計的に有意であると認識されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文およびその補足情報ファイル (補足情報および補足データ 1 ～ 3) 内で、または合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 トランスクリプトーム配列データは、BioProject 番号 PRJNA916271 で Sequence Read Archive (SRA) データベースに提出されています。

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ラット肝星細胞株 HSC-T6 をサポートしてくださった Tao Su 博士に感謝します。 この研究は、中国国家自然科学財団 (番号 52003246、81922073、および 81973481) によって財政的に支援されました。 浙江省伝統的中医学重点科学研究基金プロジェクト（番号2018ZY004、2022ZQ032、2021ZZ009）。 および浙江中国医科大学の青少年自然科学プログラム (2021JKZKTS007A)。

これらの著者は同様に貢献しました: Mengyun Peng、Meiyu Shao。

浙江中国医科大学薬学部、310053、杭州、中国

Mengyun Peng、Meiyu Shao、Hongyan Dong、Xin Han、Min Hao、Qiao Yang、Qiang Lyu、Kuilong Wang、Haodan Kuang、Gang Cao

科学教育部、貴陽中医薬大学第一附属病院、550001、貴陽、中国

唐東信

浙江大学医学部第一附属病院消化器科、310003、杭州、中国

ゼ・シェン

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MP と GC がこの研究を発案し、著者全員が実験計画に関与しました。 QL、MH、および KW が HPLC および LC-MS 実験を担当しました。 MS、HD、および XH が in vitro 実験を管理しました。 QY は動物モデルの構築と静脈注射を支援しました。 HK は専門的な支援を提供しました。 DT と ZS は臨床サンプルを提供しました。 MP と MS がこの原稿を書き、GC が原稿を修正しました。

姜操への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Robert DeLong と Joao Valente。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Peng, M.、Shao, M.、Dong, H. 他ナノドラッグは、H2O2 枯渇とサイコサポニン b1 徐放による相乗療法によって肝線維症を救出します。 Commun Biol 6、184 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04473-2

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受信日: 2022 年 6 月 13 日

受理日: 2023 年 1 月 11 日

公開日: 2023 年 2 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04473-2

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