上部腸管に沿ったヒトのメタボロームの変動

Nature Metabolism volume 5、pages 777–788 (2023)この記事を引用

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人間の食事のほとんどの処理は小腸で行われます。小腸内の代謝産物は、宿主の分泌物に加えて、摂取されたエクスポソーム 1 および微生物の変化に由来します。今回我々は、15人の健康な男性と女性の参加者を対象に、日常的な毎日の消化中の上部腸管腔内容物の時空間的変動を調査した。このために、我々は非侵襲性の摂取可能なサンプリング装置を使用して、5 つの質量分析アッセイ 2、3 および 16S rRNA シーケンスを組み合わせることにより、274 個の腸サンプルと 60 個の対応する便ホモジネートを収集および分析します。スルホノール脂質やヒドロキシ脂肪酸脂肪酸エステル (FAHFA) 脂質など、1,909 個の代謝産物を特定しました。私たちは、便と腸のメタボロームが大きく異なることを観察しました。食物代謝物は、食事バイオマーカーの傾向、腸管に沿ったジカルボン酸の予期せぬ増加、および管腔内ケト酸と果物摂取との間の正の関連性を示します。食事由来および微生物に関連した代謝産物は、個人間の差異が最も大きい原因となります。特に、サンプリング前6か月以内に抗生物質を服用した2名は、生理活性FAHFA、スルホノリピド、およびその他の微生物関連代謝物のレベルに大きなばらつきを示しています。個体間の変動から、我々は Blautia 種が FAHFA 代謝に関与する候補であることを特定しました。結論として、生理学的条件下でのヒトの小腸および上行結腸の非侵襲的生体内サンプリングは、食事、宿主および微生物の代謝の間の関連性を明らかにする。

私たちは、15 人の健康な個人の上部腸管からの管腔サンプル間のメタボロームの違いを包括的に研究し、空間的および時間的変動の範囲をより深く理解し、メタボロームとマイクロバイオームのデータを統合する見通しを評価することを目的としました。関連する出版物 4 では、これらの装置を使用して腸内微生物叢の組成、プロファージ誘導、宿主プロテオーム、および胆汁酸の微生物による修飾の変動を研究しています。ボランティアは、サンプリング時点ごとに 4 つのサンプリング装置のセットを飲み込みました。これらの摂取可能なサンプリング装置は、pH 感受性コーティングを施したカプセル内の、一方向バルブで蓋をされた折りたたまれた収集袋で構成されています。 4 種類のデバイスは腸溶コーティングのみが異なり、pH 5.5 (タイプ 1)、pH 6 (タイプ 2)、pH 7.5 (タイプ 3 および 4) で溶解します (図 1a)。コーティングの厚さと pH 応答性により、胃内容排出後の腸管の特定の場所でのサンプリングが可能になりました。これらのデバイスには、追跡目的のパッシブ無線周波数識別チップ以外の電子機器は含まれていませんでした。コーティングが溶解すると、弾性収集袋が拡張し、真空吸引により最大 400 μl の管腔内容物を収集しました。一方向バルブにより、サンプルの損失や下流の流体からの汚染が防止されました。便サンプルは -20 °C で凍結され、分析前にすべてのデバイスが便から回収されました。液体内容物は、皮下注射針を使用してデバイスから回収されました。生サンプルのアリコートを 16S リボソーム RNA マイクロバイオーム分析に使用し、遠心分離したサンプルからの上清をメタボロミクス研究に使用しました。ここでは、同じサンプルのメタボロームの綿密な分析を実行し、これまでヒトサンプルで検出されたことのない代謝物、食事の主要なバイオマーカー、参加者間および参加者内での化学プロファイルの比較を報告します（補足表1および2）。

a、上部腸管調査のための研究デザイン。 4 種類の腸サンプリング装置を使用して、腸上部の近位から遠位までのサンプリングを行いました。 15 人の人間の参加者が、1 日目の最初のテスト後、昼食後と夕食後の 2 日間にわたって少なくとも 16 個のデバイスを飲み込みました。デバイスはターゲットおよび非ターゲットの LC-MS/MS および GC-MS メソッドによって回収および分析されました。 b. サンプルの分析に使用された 5 つのメタボロームアッセイから特定された代謝物。化学クラスの分画は、自動化された ClassyFire 化学分類に基づいて含まれます。 c、上部腸管領域間の差異の有意性は、LMMを使用して計算されました。水平の一点鎖線は、有意性閾値 P < 0.05 (n = 1,182 代謝物) を表します。 FDR 補正後の丸は有意でないことを示し、ひし形は有意 (P < 0.05) を示します。腸サンプルの >50% で検出された代謝物のみがこの分析に含まれました (n = 1,182)。効果量係数は、LMM によって推定された傾きであり、正 (負) の係数は、近位の上部腸と比較して遠位のレベルが高い (低い) ことを示します。縦の一点鎖線は±0.2のエフェクトサイズ係数です。

デバイスタイプ 1 ～ 4 の管腔内容物の測定 pH は、十二指腸、空腸、回腸、および上行結腸をカバーする腸管 4,5 にわたる予想される pH 勾配と一致していました (図 1a)。タイプ 1 および 2 のデバイスの pH は、タイプ 3 および 4 のデバイスとは大きく異なりました (拡張データ図 1a および補足表 3; Wilcoxon 二元配置順位和検定、P = 2.4 × 10−14)。一方、pH は異なりませんでした。タイプ 1 とタイプ 2 のデバイス間、またはタイプ 3 とタイプ 4 のデバイス間で大きく異なります (拡張データ図 1a)。したがって、我々はタイプ 1/2 および 3/4 のデバイスを、それぞれ上部腸管の近位 (十二指腸および空腸) および遠位 (回腸および上行結腸) 領域と関連付けました。

我々は、5 つの質量分析アッセイを使用して、これらのカプセル装置によって捕捉された管腔内容物および関連する便サンプルを分析しました。クロマトグラフィーの保持時間、正確な前駆体質量、および質量分析によるフラグメンテーション (MS/MS) を MassBank.us パブリックおよび NIST20 認可ライブラリーと照合することにより、腸内腔および便内容物からの 1,909 個の化学物質にメタボロミクス標準化イニシアチブの信頼レベル 1 ～ 3 で注釈を付けました (補足表) 1)6、品質管理 (QC) および定量化の目的で使用される 155 の内部標準を含みます。さらに、メソッドブランクのレベルを超えて、12,000 を超える未知のクロマトグラフィー特徴が確実に検出されました (補足表 2)。 ClassyFire ソフトウェア 7 を使用して、構造的に注釈が付けられた代謝物は 61 の化学サブクラスに分類されました (補足表 1)。親水性および親油性代謝産物に焦点を当てた 2 つの非ターゲット高分解能液体クロマトグラフィー (LC) MS/MS アッセイにより、1,612 個の同定を含む注釈付き化合物のほとんどが得られました。非ターゲットガスクロマトグラフィー (GC)-MS では 119 個の一次代謝産物が追加され、6 つの短鎖脂肪酸 (SCFA) のターゲットと 17 個の胆汁酸のターゲット LC-MS/MS アッセイによって補足されました (図 1b)。総代謝分散の QC 分析により、プールされた品質管理サンプルが強力にクラスター化されており、便サンプルと腸サンプルが分離されていることが明らかになりました (拡張データ図 1b)。

メタボロームの結果により、便サンプルと腸サンプルの間 (拡張データ図 2)、および腸管サンプル間 (拡張データ図 3) に顕著な違いが明らかになりました。腸全体の空間的な違いを明らかにするために、サンプリング位置（近位または遠位）および他の変数を考慮した線形混合効果モデル（LMM）を適用しました（補足表3および4）。具体的には、デバイスサンプルの 50% 以上で検出された 1,182 個の最も一般的な代謝物を調査しました。これらのうち、630個（54％）は遠位上部腸と比較して近位上部で有意に異なり（偽発見率（FDR） P < 0.05; LMM）（図1cおよび補足表4）、473個の代謝物が遠位上部腸のより高いレベルであった。遠位上部腸と比較して近位では157の化合物が含まれており、遠位上部腸と比較して近位ではより低いレベルで157の化合物が含まれていました（図1c）。 SCFA8、9、二次胆汁酸10、一部の微生物結合胆汁酸11、12を含む既知の微生物生成化学物質は、腸上部の近位から遠位にかけて増加しました（拡張データ表1および図1c）。検出された11個のアセチル化アミノ酸のうち、7個は腸の近位から遠位上部にかけて増加しました（生のP < 0.05; LMM）（拡張データ表1および図1c）。また、腸サンプルの 50% 以上で検出された 9,317 個のシグナルに注目し、化学的に注釈のない 12,346 個の代謝産物シグナルを調べました (補足ファイル 1)。全体として、3,594 (38%) の特徴が近位上部腸と遠位上部腸の間で有意に異なり、1,937 の特徴が遠位上部腸と比較して近位のより高いレベルにあり、1,657 の特徴が遠位上部腸と比較して近位の低レベルにありました (FDR P) < 0.05; LMM) (拡張データ図 4)。

場所間の一般的な代謝の違いを調べるために、化学濃縮統計を使用しました。ジペプチドおよびトリペプチドは、腸上部の近位から遠位にかけて最も顕著に減少したクラスの一つでした（拡張データ表 1 および拡張データ図 5）。測定された 333 個のジペプチドおよびトリペプチドのうち、262 個は腸上部の近位から遠位にかけて量が大幅に減少しました (生の P < 0.05; LMM) (拡張データ表 1)。糖、糖アルコール、ヌクレオシド、カルニチンおよびセラミドも、遠位サンプルと比較して近位腸管サンプルで有意に高いレベルを示しました（拡張データ表 1 および拡張データ図 5）。腸内のこれらの空間的違いは、ジペプチドおよびトリペプチド 14 およびアシルカルニチン 15,16 の古典的な消化と吸収 13、さらに腸内での摂取前にスフィンゴシンと遊離脂肪酸に加水分解されるセラミド 17 を反映しています。対照的に、SCFA は遠位領域でレベルの増加を示しました (拡張データ表 1 および図 1c)。これはおそらく微生物による SCFA の産生によるものと考えられます 8,9。クローン病と関連しているアセチル化アミノ酸 18 も、近位腸上部と比較して遠位腸上部で高レベルでした（拡張データ表 1 および図 1c）。これはおそらく、非アセチル化アミノ酸と比較してアセチル化アミノ酸の吸収が遅いためであると考えられます 19 、20。胆汁酸は微生物によって広範囲に変換され、腸に沿って二次胆汁酸のレベルが増加します4。これらの観察は、カプセルデバイスが意図された場所からサンプリングしたという概念を裏付けています。特定のタイプのデバイス全体の平均 pH レベルも上部腸管全体で予想される傾向に従いましたが、各デバイスタイプで観察された個人内での pH の変動は、遠位領域と近位領域にわたるメタボローム変化と相関していませんでした。

腸上部の近位から遠位にかけて増加した 28 個のフェノール代謝物を測定しました (補足表 4)。これらの傾向は、微生物酵素による植物細胞および細胞壁成分の脱グリコシル化や遅延分解などの酵素変換 21,22 を含む要因の組み合わせによって引き起こされる可能性があります 23,24,25。例えば、亜麻仁関連リグナンであるセコイソラリシレジノールは、おそらくバイオアベイラビリティ 26 と脱グリコシル化 27 の両方により、近位サンプルと比較して遠位サンプルで最も顕著に濃縮されました。

ジカルボン酸も、腸上部の近位から遠位にかけて濃度が増加しました（拡張データ表 1 および図 1c）。実際、腸の近位上部と遠位上部の間で最も顕著に増加した代謝産物の上位 6 つのうち 3 つはジカルボン酸 (ヘキサデカン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸) でした (図 1c)。ジカルボン酸は、ヒトの細胞 28、植物 29、微生物 30、31 で起こる脂肪酸の異化（オメガ酸化）中に生成されます。主要な化合物であるヘキサデカン二酸は、他のジカルボン酸、植物代謝産物、胆汁酸、および微生物によって生成される既知の化合物と最も強く相関していました（補足表5）。上皮細胞には、上皮のバリア機能を維持するために不可欠なオメガヒドロキシル化脂質が含まれており 32、リパーゼによって切断されてジカルボン酸を形成します。我々は、腸上部に沿ったジカルボン酸の一貫した有意な増加は、ヒト上皮脂質の異化によるものであると仮説を立てています。

腸サンプルの化学プロファイルは、便の化学プロファイルとは大きく異なりました (拡張データ図 2)。 31 の代謝産物は、便と比較して腸内で平均して 100 倍以上豊富でした。これらの代謝産物は、グリシン化脂質、糖、植物天然産物、カルニチン、微生物結合胆汁酸、および S-スクシニルシステインで構成されていました (補足表 6)。また、腸サンプルと比較して、特に近位腸と比較した場合、便サンプル中のペプチドは一般にはるかに低レベルでした (拡張データ図 2)。また、腸サンプルと比較して便中に100倍以上豊富に存在する100以上の代謝産物も特定しました（補足表6）。これらの代謝産物の大部分は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどの極性脂質、および特定の FAHFA でした。便サンプル中の膜脂質の存在量が多いのは、腸上部からの管腔サンプルと比較して、便中の細菌細胞物質の量が多いためであると考えられます。

次に、LMM を使用して、参加者によって記録された食物摂取ログと腸管代謝産物のレベルとの関連性をテストしました。カプセルデバイスを飲み込む6時間前に摂取した果物、アルコール、デザート、動物性タンパク質、野菜、穀物、コーヒー/紅茶、乳製品の種類の摂取についてテストしました（補足表3）。複数の仮説検定を補正した後、一部の食品の種類には有意に関連する代謝物はありませんでしたが、これは当然のことながら、一部の食品の種類ではサンプルサイズが小さく、1,182 個の代謝物の検査を説明する強力な FDR 補正があったためです（表 1、図 2a ～ d および補足表） 4)。この研究は参加者 15 名という小規模な研究でしたが、これまで血液中に存在し、果物 33 およびアルコール 34 の摂取と相関関係にあった一連の食事バイオマーカーを検証することができ、さらにこれまで同定されていなかった他のバイオマーカーを発見することができました。

a、b、d、火山プロットは、LMM によって計算された果物 (a)、アルコール (b)、デザート (d) の食品の種類に対する各代謝物の重要性を示します。摂取量は、サンプルデバイスを飲み込んでから 6 時間以内に食べられた食物として定義されます。 P < 0.05 (n = 1,182 代謝物) の有意性は、下の一点鎖線の水平線で区切られています。丸は FDR 補正後の非有意性を示し、ひし形は FDR 補正後の有意性 (P < 0.05) を示します (n = 1,182)。この分析には、腸サンプルの >50% で検出された代謝物が含まれていました。効果量係数は、LMM によって計算された傾き推定値であり、正 (負) の係数は、食物摂取後に代謝産物が高い (低い) ことを意味します。縦の一点鎖線は±0.2のエフェクトサイズ係数です。 c、化学濃縮統計（ChemRICH）分析により、化学的親油性（logP）および化学クラス有意水準-log10（P）によってクラスを分離することによって視覚化された、果物消費後の重要な化学クラスが明らかになりました。赤い丸は果物の摂取後に化学クラスが増加したことを示し、青い丸は果物の摂取後に化学クラスが減少したことを示します。円の大きさは化学クラスのサイズを示します。 e、テオフィリンおよびテオブロミンのレベルはカフェインのレベルと強く関連しています。円は、両方の代謝物が検出された各サンプルの測定レベルを表します。 f、カフェインと既知の代謝経路の化学図。検出された代謝物の構造と各構造のスピアマン順位相関係数（rs）を示します（すべての代謝物について P < 1.0 × 10−13; n = 1,182 代謝物）。

±0.2のエフェクトサイズの差および生のP <0.05を使用すると、果物の摂取は、濃度が増加した場合は20の化合物、濃度が低下した場合は17の代謝物と有意に関連しました（図2a）。 N-メチルプロリンとスタヒドリンを含むいくつかの代謝産物は、厳密にFDR補正されたP < 0.05であっても果物消費と直接関連していました（図2a）。これらの両方は、以前に非対照食事研究で血漿の果物消費バイオマーカーとして報告されていました33。フルーツジュースの既知成分であるベトニシン 35 も、生の P < 0.05 で果物を摂取した後に増加しましたが (図 2a)、FDR 有意閾値には達しませんでした。同様に、3 つのケト酸 (4-メチル-2-オキソ吉草酸、ケトイソ吉草酸、3-メチル-2-オキソ吉草酸) も、生の P < 0.05 で果物の摂取に反応して大幅に増加しました (図 2a)。代謝産物は互いに独立しているのではなく、食品組成、微生物および酵素の経路を介して結びついています。したがって、ChemRICH 化学セット濃縮統計を使用して、大幅に変更された代謝産物のクラスターを特定しました (図 2c)。この戦略により、ケト酸が果物に対して最も顕著な反応を示す化学クラスであることが明らかになり（図2a、c）、ヒトの腸内での果物のバイオマーカーとしてのケト酸が強調されました。ケト酸はアミノ酸の酵素的脱アミノ化によって形成され、一部は腸内細菌によって行われます 36。特に、ChemRICHは、酢酸フェニルやフェノール系天然産物などの典型的な果物成分が果物の摂取量と正の相関があることも明らかにしました（図2c）。

アルコール消費は、アルコール消費の既知の血漿バイオマーカーである硫酸エチルと最も有意に関連していました (FDR P < 0.05) (図 2b)。スタヒドリンは果物とアルコールの摂取の両方と関連していました (FDR P < 0.05)。 FDR補正後のアルコール摂取に伴い、Trp-Lysは大幅に減少しました（図2b）。合計で、ChemRICH クラスター P = 8.8 × 10−18 で、アルコール消費に伴って 40 個のジペプチドおよびトリペプチドが減少しました (生 P < 0.05) (補足表 4 および補足図 1 および 2)。アルコール摂取後のジペプチドおよびトリペプチドの減少は、トリプシンとキモトリプシンが20％エタノール溶液中でも活性であるため、直接阻害ではなくおそらく膵臓分泌障害による可能性があり、総プロテアーゼ活性の低下を示唆しました37,38。「デザート」は、ソーダ、ケーキ、アイスクリームなどの高脂肪/高糖分の食品の摂取と定義されました。 2つの置換安息香酸、3-ヒドロキシ-4-メトキシ安息香酸と3,4-ジヒドロキシ安息香酸は、デザートと関連していました（生のP < 0.05）（図2d）。これらの化合物は、バニリンとイソバニリン40の分解における代謝中間体です。ネオクロロゲン酸はデザートとも有意に関連していました (生 P < 0.05)。ネオクロロゲン酸は、サクランボ 42 やモモ 43 など、さまざまな果物やベリー 41 に含まれています。混合効果モデルに含まれる他の食品の種類にも、有意に関連する代謝物がありました (補足表 4 および補足図 1 および 2)。

大部分のサンプルでカフェインが検出されました (補足表 1)。注目すべきことに、カフェインは実験期間中にコーヒーまたは紅茶の摂取と有意な相関はなかった(FDR P = 0.87)(補足表4)。これはカフェインが経口摂取後1時間以内に急速に吸収され、平均半減期が血流中で 4.5 時間 (範囲 2.7 ～ 9.9 時間)44。ただし、カフェインの代謝経路は、スピアマン順位相関分析によって容易に識別されました。 FDR P < 10-13でカフェインと最も強く相関した6つの代謝物は、テオフィリンやテオブロミンを含む既知のカフェイン異化物45、46、47でした（図2e、f）。カフェインは代謝され、尿 48 や胆汁 49 などのいくつかの経路を通じて排泄されます。飲料の摂取とデバイスのサンプリングの間には数時間が経過しているため、この研究で測定されたカフェインの起源は胆汁であると予想されます。テオブロミンはチョコレートに含まれることが知られていますが、デザートの摂取とは関係がなく、カフェインの代謝にのみ関係していました。したがって、上部腸管代謝産物の相関関係により、エクスポソーム代謝の微生物経路と酵素経路の再構築が可能になる可能性があります。特定の食品バイオマーカーを関連付けるには、食事介入を使用した多様な集団を対象とした専用の研究が必要となるでしょう。さらに、このデバイスは細菌の生存率を大幅に保存するため 4、デバイスから得られた培養分離株を使用して、個々の食品メタボロームと細菌の相互作用を確認することができます。

食事性代謝物は、この研究の 2 日間および 4 回のサンプリング時点での時間的差異と関連していました。サンプリング時間とサンプリング領域のどちらが上部腸の代謝物に大きな影響を与えるかを調査するために、分散分析 (ANOVA) を使用して、参加者ごとの 4 つのデバイスタイプ間、または 4 つのサンプリング時点間で有意に異なる代謝物の数を計算しました (各食後）参加者による。近位サンプリング領域と遠位サンプリング領域の間の代謝物レベルの大きな違いは、多くの場合、時点間の代謝の差によって置き換えられ、15 人中 12 人の参加者が腸領域 (デバイスの種類) 間よりも食事間 (時点) で統計的に異なる代謝物を有していたことを示しました (拡張)データ図6a、b)。これらの違いに寄与した化合物クラスを詳しく調べたところ、ジペプチドとトリペプチド (カルボン酸の化学クラス内) がデバイスの種類を区別する最大の化学クラスであり、5 人の参加者におけるすべての有意に異なる代謝物の > 70% を占めていることがわかりました。さらに 7 人の参加者では >40% (拡張データ図 7a)。サンプリング時点を区別した代謝産物では、参加者 15 人中 13 人で糖類 (有機酸素化合物) が豊富でした (拡張データ図 7b)。同様に、より有意に異なるイミダゾピリミジン、インドール、イソフラボノイドは、腸領域よりもサンプリング時点を区別することが判明しました（拡張データ図7）。これらのクラスは、異なる食事中に摂取される食品の種類の違いによって異なる食事代謝物を示しますが、腸の領域を区別するのにはそれほど役立ちませんでした。

私たちのデータセットは大きな個人差を示しました (拡張データ図 7)。参加者には特定の食事が処方されていなかったため、食事ベースのバリエーションが参加者と時点を区別することが期待されました。多変量判別分析（PLS-DA）を使用して、近位腸と遠位腸（デバイスタイプ）を区別するのに最も重要な代謝産物の割合の違いを、15人の参加者間で特定しました（拡張データ図6b）。サンプル間の全体的な差異が大きいため、参加者、デバイス、または時点に基づいた PLS-DA の明確な視覚化が不明瞭になりました。それにもかかわらず、多変量識別に最も寄与した100の代謝物は、コショウ化合物であるカプサイシン、亜麻仁化合物であるセコイソラリシレジノールおよび微生物によって生成される酪酸を含む、植物および微生物起源の代謝物によって最もよく説明される参加者固有の傾向を明らかにした（拡張データ図6b）。酸およびプロピオン酸（補足表 7）。 N-メチルヒスタミン、フェネチルアミン、フェニルアセトアルデヒド、コハク酸など、参加者固有の変動を示した他の代謝産物は、ヒト、食事、または微生物の要因の組み合わせに依存する可能性があります。注目すべきことに、階層的クラスタリングでは便サンプルが参加者ごとに分離されましたが、腸サンプルは参加者ごとに強くクラスター化されませんでした（補足図3）。これはおそらく、近位腸と比較して便中の個人固有の腸内細菌の存在量がより多かったためです。食事成分の変動によって支配されます。

PLS-DA 投影ですべてのデータを使用する場合、全体的な変動が大きいため、個人間の差異を直接視覚化することが困難になりますが、特定の化合物は個人間で非常に大きな濃度差異を示しました (図 3)。たとえば、ヒトヘム由来胆汁色素のビリベルジンとビリルビン、および微生物によって生成されるウロビリンとステルコビリンは、一部の参加者のデバイス間で大きく異なり、また、参加者 10 と 15 のステルコビリンなど、特定の参加者では大幅に減少または欠如していました (図 3)。）。二次胆汁酸の生成には、ステルコビリン生成と同様の酵素経路を使用することが提案されており 50,51、ステルコビリンレベルが低かった 2 人の参加者も二次胆汁酸であるデオキシコール酸濃度の低下を示しました (図 3)。胆汁色素の同じ参加者固有のプロファイルが便サンプルでも観察されました (拡張データ図 8)。注目すべきことに、研究前の 6 か月間で抗生物質の使用を報告したのは、これら 2 人の参加者 (10 名と 15 名) だけでした。これらの人々は、ステルコビリン、デオキシコール酸、FAHFA のサブセット、およびスルホノリピドのレベルが非常に低いことが特徴であり (図 3)、これらはすべて以前から腸内細菌叢と関連付けられていました 10、51、52、53。経口抗生物質は、治療後 1 年以上腸内細菌叢に影響を与える可能性があります 54。これらのデータは、代謝プロファイルが特定の経路の微生物活動の違いを反映しているという仮説を裏付けています。統計力が限られていたため、16S rRNA 遺伝子の定量化からの微生物種の存在量とステルコビリンレベルとの間に有意な関連性は確認されませんでしたが、FAHFA とスルホノリピドの存在は、特定の微生物種の存在量の違いと関連していました。

代謝産物には、胆汁色素、ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル (FAHFA および AAHFA)、SCFA、スルホノリピド (SL)、および二次胆汁酸が含まれます。サンプルは参加者ごとに整理されており、抗生物質の摂取量は、この研究の 1 か月前と 5 か月前に抗生物質を摂取した 2 人の参加者について示されています。ヒートマップの色は、胆汁酸の代謝物の存在量 (ピークの高さ) または濃度 (ミリリットルあたりナノグラム単位) の低 (青) から高 (赤) までの範囲です。最小値と最大値は、各代謝物 (各行) のカラースケールを設定するために使用されます。

FAHFA は 10 年前に初めて特定されました。それらは生物学的に活性であり、生理機能を調節します55,56。アシルα-ヒドロキシル脂肪酸（AAHFA）は、わずか 2 年前に発見された、α-脂質結合を持つ FAHFA の特定のサブセットです53。この研究では 88 の FAHFA を特定しました (補足表 1)。特に、4 つの特定の FAHFA は参加者間で非常に一貫した差異を示し、これらの FAHFA はすべて、C3 または C4 の短鎖部分でエステル化された長鎖ヒドロキシル脂肪酸骨格の結合です。これらの生理活性脂質のうち 3 つはα位でエステル化されており (AAHFA 4:0/22:0、AAHFA 3:0/22:0、AAHFA 3:0/24:0)、1 つは主鎖の他の場所でエステル化されています (FAHFA) 3:0/23:0）。 9 人の参加者は高レベルのこれらの FAHFA を頻繁に示しましたが、6 人の参加者は非常に少量または検出できない量しか生成しませんでした (図 3)。検出不可能なレベルは ANOVA 統計に使用できないため、有意性検定は実行しませんでした。同じ個人固有の傾向が便サンプルでも観察されました (拡張データ図 8)。他に頻繁に検出される C3 または C4 側鎖と長鎖脂肪酸を持つ FAHFA は AAHFA 16:0/4:0 のみで、これは上記の 4 つの FAHFA と同じ個人固有の傾向に従いませんでした。注目すべきことに、長鎖脂肪酸またはSCFA基質であるプロピオン酸（C3:0）と酪酸（C4:0）のレベルが低いことは、腸または便のサンプル中で観察されたこれらの短鎖FAHFAの違いを説明しませんでした（図1）。 3および拡張データ図9)。したがって、我々は、特定の細菌が対象の 4 つの FAHFA の有無と関連しているかどうかを調査しました。系統発生的にBlautia obeumおよびBilophila wadsworthiaに関連するプロテオバクテリアに最も近縁なBlautia属の種である2つの分類群は、これらのFAHFAの検出と有意に関連していた(補足表8)。 B. obeum は既知の SCFA 生産者であり 57、短鎖脂肪酸アシル構成成分の生産が個人特異的な FAHFA 生産のドライバーである可能性があることを示唆しています。しかし、FAHFA 4:0/16:0 は同じ個体固有の傾向を示さなかった。これは、Blautia 種がヒドロキシル化された超長鎖脂肪酸アシルのプロピオン酸エステルおよび酪酸エステルを含む FAHFA を特異的に生成する可能性があることを示唆している（22:0 および 23 :0) 最も豊富な脂肪酸である C16 ～ 18 のヒドロキシル型ではありません。化学的に関連したグループの FAHFA は、グルコース恒常性を改善し、インスリン感受性を刺激し、抗炎症効果があることが示されています 55。したがって、我々の発見は、ヒトの腸内化学とFAHFAレベルとの関連性を提供することに加えて、潜在的な健康への影響をもたらす。

ここでは、ヒトサンプル中のスルホノリピドの検出について報告します。これらの脂質はリピドミクスライブラリーに最近追加されたばかりであり 58、それらがマウスの腸管で微生物によって産生され、炎症誘発性および抗炎症性表現型の両方に関連していることが発見されました 59,60,61。腸管器具サンプルでは、サンプリング時点 (食事) に関係なく、強い個体間傾向を持つスルホノリピドが検出されました。これは、スルホノリピドが一部の個体では微生物によって生成されたが、他の個体では生成されなかったことを示唆しています。以前に抗生物質の投与を受けていた2人の参加者は、他のすべての人よりもはるかに低いレベルのスルホノリピドを示し(図3)、これは抗生物質治療により微生物生産者が排除された可能性があることを示唆しています。注目すべきことに、スルホノリピドは他の参加者の特定のサンプルにも存在しなかったため、スルホノリピドと細菌分類群との関連を調べるよう促されました。潰瘍性大腸炎に関連する科であるデスルホビブリオン科 (補足表 8) のメンバーを含む、10 の分類群がスルホ脂質含有サンプルに著しく富んでいました 62。また、既知のスルホノリピド生産体を含む門であるバクテロイデス属の 2 つのメンバーも濃縮されました 60。ヒトにおけるスルホノリピドレベルの健康への影響は十分に理解されていません。スルホ脂質はマクロファージの炎症反応を増加させるが、リポ多糖の存在下では炎症を減少させることが最近示されました 63。スルホノリピドと人間の健康との関係を明らかにするには、さらなる調査が必要です。

この研究は、非侵襲性の摂取可能なサンプリング装置を使用した、健康な人間の参加者の上部腸管におけるメタボロームの違いについての報告を提供します。私たちの結果は、消化と腸疾患に関する将来の詳細な生体内研究への扉を開きます。予想通り、便のメタボロームは腸のメタボロームとは非常に異なっていました。したがって、便は腸管の代用としては機能せず、（せいぜい）結腸内容物の代用としてのみ機能します。腸管内であっても、注釈付き代謝産物の >50% は、近位位置と遠位位置の間で著しく異なるレベルを示しました。今後の研究の重要な目標は、腸内のスルホノリピド、ステルコビリン、および長鎖 AAHFA 産生細菌に対する抗生物質の影響と、そのような混乱が健康と病気に及ぼす影響を特徴付けることです。抗生物質によるこれらの細菌の破壊は、炎症、糖尿病、炎症性腸疾患の発生率と病因に関連している可能性があります55、60、63。したがって、抗生物質で治療された個体にこれらの微生物が再増殖する動態とメカニズムを明らかにすることが重要となる。

関連する研究4では、同じデバイスサンプルを使用して、いくつかのオミクスアプローチを使用して腸内環境の変動を幅広く研究しました。この研究で報告されたメタボロームに関する所見と同様に、腸サンプルでは便と比較してより顕著なプロファージ誘導が見られ、宿主のプロテオームと胆汁酸のプロファイルは腸に沿って変化しており、便のプロファイルとは非常に異なっていることがわかりました4。ここで報告した腸の近位位置と遠位位置の間のペプチドとアミノ酸の大きな違いを補完するものとして、我々の関連研究では、微生物が結合した胆汁酸濃度が便では明らかではないアミノ酸依存の傾向を示すことを示した。これらの研究を総合すると、腸から直接サンプリングすることの有用性が示されており、これによりヒト宿主とその共生微生物との密接な関係についての理解が深まるはずです。

パイロット研究として、私たちの研究にはいくつかの制限があります。第一に、ヒト集団内およびヒト集団全体にわたる腸内代謝の範囲について結論を出すには、より多くの参加者が必要であり、より大規模な研究では、特定の細菌または細菌ファミリーと代謝変換とのより詳細なマイクロバイオーム全体の関連性も考慮できる可能性がある。第二に、抗生物質の使用を報告した参加者は 2 人だけであったため、抗生物質の使用とスルホノリピドおよび FAHFA 代謝の阻害との間の潜在的な関連性は、今後の研究で強化する必要があります。第三に、時間的変動の分析は連続する 2 日間の 1 日あたり 2 時点に限定されていたため、経時的な代謝または微生物組成の変化は完全には評価されませんでした。第 4 に、上部腸内細菌叢の組成と小腸細菌の異常増殖などの疾患状態の変動性との関連性については、特別な個別の調査が必要となるでしょう。これらの制限にもかかわらず、私たちの研究結果は、非侵襲的サンプリング装置をメタボロミクスやゲノミクスと組み合わせて使用することで、栄養学研究やヒトの病気に対処するためのより正確な介入や予防戦略を可能にする大きな可能性があることを示しています。

関連する出版物 4 では、同じテキストを使用してカプセルサンプリングデバイス (CapScan、Envivo Bio) について説明しました。 CapScan は、一方向バルブで蓋がされた中空の弾性収集ブラダーで構成されています4。デバイスを包装する準備として、収集袋を真空にし、半分に折り、腸溶性コーティングが塗布された直径 6.5 mm、長さ 23 mm の溶解可能なカプセル内に包装します。カプセルと腸溶性コーティングは、摂取中の口腔咽頭および胃の微生物による収集膀胱の汚染を防ぐように設計されています。腸溶性コーティングとカプセルは、デバイスがターゲット pH (タイプ 1 では pH 5.5、タイプ 2 では pH 6、タイプ 3 とタイプ 4 では pH 7.5) に達すると崩壊します。タイプ 4 には、収集を偏らせるための時間遅延コーティングもあります。上行結腸に向かって。腸溶性コーティングが崩壊すると、収集袋が展開して直径 6 mm、長さ 33 mm のチューブになり、一方向バルブを介して最大 400 μl の腸内腔内容物が引き込まれます。収集膀胱内に収集されたサンプルの完全性は、デバイスが結腸内を移動して便にさらされる間、一方向弁によって維持されます。

関連する出版物 4 では、同じテキストを使用して研究デザインを説明しました。各参加者は、小腸の近位から内側領域（コーティングタイプ 1 および 2）およびより遠位領域（コーティングタイプ 3 および 4）をターゲットとするための異なるコーティングが施された 4 つのデバイスのセットを同時に摂取しました。サンプリング後、デバイスは便に含まれて検体収集容器に移され、すぐに凍結されました。採取後、便は解凍され、研究スタッフが器具を回収した。サンプルを除去するために、弾性収集膀胱を 70% イソプロピルアルコールですすぎ、1 ml 注射器に取り付けられた滅菌皮下注射針で穿刺しました。サンプルを微量遠心管に移し、InLab Ultra Micro ISM pH プローブ (Mettler Toledo) で pH を測定しました。メタボロミクス分析では、40 µl アリコートを 10,000 g で 3 分間遠心して上清を収集しました。残りのサンプルは、DNA 抽出のために解凍するまで凍結されました。

関連する出版物 4 では、同じテキストを使用して研究デザインを説明しました。この研究は、WIRB-Copernicus Group Institutional Review Board (研究番号 1186513) によって承認され、各参加者からインフォームドコンセントが得られました。健康なボランティアは、データの取得と解釈を妨げる可能性のある臨床的に検出可能な胃腸の状態または疾患を患っている参加者を除外するために選択されました。

参加者は、研究に参加するための以下の基準をすべて満たしていました。(1) 18 歳から 70 歳までの個人。 (2) 米国麻酔科医協会の身体状態クラスのリスクは 1 または 2。 (3) 妊娠の可能性のある女性の場合、スクリーニング来院後 7 日以内の尿妊娠検査が陰性であり、研究期間全体を通じて避妊を行う意思がある。 (4) 英語に流暢であり、研究プロトコールを理解し、研究要件を遵守するとともに、書面によるインフォームドコンセントを提供できること。

以下の症状または特徴のいずれかを持つ参加者は研究から除外された：（1）以下のいずれかの病歴：ラップバンディングまたは肥満手術を含む胃または食道の手術歴、腸閉塞、胃出口閉塞、憩室炎、炎症性腸疾患、回腸瘻造設術または結腸瘻造設術、胃がんまたは食道がん、アカラシア、食道憩室、活動性嚥下障害または嚥下痛、またはあらゆる胃腸疾患に対する積極的な薬剤の使用。 (2) スクリーニング受診または授乳後 30 日以内の妊娠または妊娠予定。 (3) あらゆる形態の活性物質の乱用または依存（薬物乱用またはアルコール乱用を含む）、不安定な医学的障害または精神障害、または研究者の意見では研究の実施を妨げる可能性がある慢性疾患。または (4) 研究者の判断により、研究に参加している間に個人に健康上のリスクを引き起こす可能性がある臨床症状。

15 人の健康な個人がこの研究に登録され、それぞれが 3 日間で少なくとも 17 個のデバイスを飲み込みました。サンプルサイズは、ヒトの腸管全体の一般的な変動を評価するために選択されました。毎日の指示には次のガイドラインが含まれていました。 1 日を通してすべての食べ物とそれらを摂取した時間を記録します。運動する場合は午前中に行います。いつものように朝食と昼食を食べる。昼食の 3 時間後に、4 つのデバイスのセットを最大 3 分の 2 カップの水と一緒に飲み込みます。デバイスを飲み込んだ後、少なくとも 2 時間は何も食べたり飲んだりしないでください。 2 時間後にお腹が空いたら、軽く間食します (最大 200 カロリー)。昼食後は翌朝までカフェイン入りの飲み物を飲まないでください。このセットの器具を飲み込んでから 6 時間後から次のセットの器具を飲み込んでから 48 時間後まで、すべての便を収集します。夕食は昼食から少なくとも6時間後にいつも通りに食べてください。夕食の 3 時間後に 4 台の CapScan デバイスのセットを 3 分の 2 カップの水と一緒に飲み込みます。このセットを飲み込んだ後は、朝まで何も食べたり飲んだりしないでください。飲酒量や食事内容には制限はありませんでした。摂取されたデバイスはすべて回収され、研究中に有害事象は報告されませんでした。合計 274 個のカプセルデバイスがメタボロミクス分析に十分な材料を提供し、225 個のカプセルデバイスがゲノム分析に十分な量または数のシーケンスリード (>2,500) を提供しました。研究中のすべての排便は、参加者によって即座に-20°Cで凍結されました。参加者 1 は、再現性の評価のために追加のサンプルを提供しました。合計 333 の腸と便のサンプルがメタボロミクス手法で分析されました。

サンプル調製は、水、メタノール、およびメチル tert-ブチルエーテル (MTBE) を使用した二相抽出 64 を使用して実行され、極性代謝産物と非極性代謝産物を分離しました。デバイスサンプルは液体であり、便サンプルは固体であるため、カプセルデバイスの上清と便サンプルは別々に調製されました。各上清サンプルについて、あらかじめ決められたランダムな順序で、深いサンプル調製用 96 ウェルプレートの 1 つのウェルに 10 μl が分注されました。サンプルは一度に 1 枚の 96 ウェルプレートから抽出され、特に指定がない限り、すべてのステップは 4 °C で実行されました。 10 個の実験サンプルごとに、メソッドブランクと外部 QC サンプルを準備しました。ブランクにはサンプルの代わりに 10 μl LC-MS グレードの水を使用し、QC サンプルには無関係な研究からのヒト消化管内容物のプールされたサンプル 10 μl を使用しました。次に、SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard (Avanti) を含むメタノール 170 μl を各ウェルに加え、プレートをホイルでヒートシールし、室温で 30 秒間激しく振盪し、封を切り、MTBE 490 μl を加えました。次に、プレートを再度ヒートシールし、室温で 30 秒間激しくボルテックスし、オービタルシェーカーで 5 分間振盪しました。ホイルシールを取り外し、150 μl の LC-MS グレードの水を各ウェルに加えました。プレートを室温で30秒間ボルテックスし、708gで12分間遠心分離した。ディープウェルプレートからホイルを除去し、12 チャンネルピペットを使用して上相の 2 つの 180 μl アリコートを 2 つの 96 ウェル Vanquish LC プレートに移しました。次に、水相の 2 つの 50 μl アリコートを、他の 2 つの 96 ウェル Vanquish LC プレートに移しました。すべての 96 ウェルプレートを室温、真空下で完全に乾燥させ、ホイルでヒートシールし、さらなる分析まで -80 °C で保存しました。各便サンプルはスパチュラで混合することによって調製され、5 ± 1 mg が 2 ml 微量遠心管に移されました。次に、SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard (Avanti) を含むメタノール 225 μl をすべての微量遠心管に加え、チューブを室温で 10 秒間ボルテックスしました。 2 つの 3 mm ステンレス鋼ボールと 750 μl MTBE を各チューブに加え、サンプルを Geno/Grinder (SPEX) で 1,500 Hz で 1 分間均質化しました。その後、188 μl の水を各チューブに加え、各チューブを室温で 30 秒間ボルテックスしました。チューブを室温、14,000gで2分間遠心分離しました。有機相 180 μl の 2 つのアリコートを 2 つの 96 ウェルプレートに移しました。水相の 2 つの 50 μl アリコートを 2 つの 96 ウェルプレートに移しました。すべてのプレートをロータリー真空エバポレーターで完全に乾燥させ、ホイルでヒートシールし、さらなる分析まで-80 °Cで保管しました。

サンプル調製の水相アリコートからのサンプルを-80 °C から取り出し、CUDA65 を含む 29 種類の同位体標識および合成内部標準を含む 8:2 アセトニトリル:水 35 μl を各ウェルに加えました。次いで、96ウェルプレートをホイルで密封し、室温で30秒間激しくボルテックスし、室温で水浴中で5分間超音波処理し、708gで15分間遠心分離した。プレートは、分析までオートサンプラー内で 4 °C で保管されました (オートサンプラー内の最大保管時間は 48 時間でした)。 LC-MS/MS は、QExactive HF+ 軌道イオントラップ質量分析計 (Thermo Scientific) に接続された Vanquish LC (Thermo Scientific) を使用して実行されました。クロマトグラフィー分離は、5 mm プレカラム (長さ 5 mm × 内径 2.1 mm、粒子サイズ 1.7 µm) を備えた Waters Acquity UPLC BEH Amide カラム (長さ 150 mm × 内径 (id) 2.1 mm、粒子サイズ 1.7 µm) を使用して実行されました。粒子サイズはμm）。移動相 A は 100% 水、B は 95:5 のアセトニトリル:水でした。両方の移動相を 10 mM ギ酸アンモニウムと 0.125% ギ酸で修飾しました。流速は 400 μl min-1、カラム温度は 45 °C、注入量は 3 μl でした。 LC グラジエントは、0 ～ 2 分まで 100% 移動相 B、7.7 分までに 70% B、9.5 分までに 40% B、10.25 分までに 30% で、12.75 分までに 100% B に戻し、17 分まで再平衡化しました。。すべての移動相グラジエントシフトは直線的でした。サンプル注入の前後に、アセトニトリル:水 1:1 をニードル洗浄溶媒として使用しました。加熱エレクトロスプレーイオン化 (HESI) ソースの条件は次のとおりです: シースガス流量 50、補助ガス流量 13、スイープガス流量 3、キャピラリー温度 263 °C、S レンズ RF レベル 50、補助ガスヒーター温度 425 °C、およびニードル電圧正イオン化モードの場合は 3,500 V、負イオン化モードの場合は -3,500 V。上位 4 つのイオンについて、データ依存型 MS/MS 取得 (DDA) を使用してスペクトルを収集しました。 MS スキャンは、60 ～ 900 m/z の 60-k 分解能、AGC ターゲット 106 イオン、および最大蓄積時間 100 ms で収集されました。 MS/MS スペクトルは、15 k の分解能、1 Da 分離ウィンドウ、50 ms の最大蓄積時間、3 秒の動的排除ウィンドウ、断片化のための 20、30、および 60 の段階的 (N)CE、および 8 × で収集されました。 103 AGC ターゲット。すべてのスペクトルはセントロイドモードで保存されました。プールされた各 QC サンプルについて、3 ラウンドの反復排除 MS/MS を取得しました。分析後すぐに、プレートを真空下で乾燥させ、ホイルで密封し、-80 °C で保管しました。

有機相アリコートからのサンプルプレートを-80℃から取り出し、50μlの9:1アセトニトリル/トルエンを各ウェルに添加した。次にプレートをホイルで密封し、室温で 30 秒間激しくボルテックスし、室温で 5 分間ウォーターバスで超音波処理し、708g で 15 分間遠心分離し、分析まで 4 °C に保ったオートサンプラーに移しました（最大保存分析前のオートサンプラーでの時間は 48 時間でした）。リピドミクス LC-MS/MS 分析では、Thermo Scientific QExactive HF+ 軌道イオントラップ質量分析計と組み合わせた Thermo Scientific Vanquish LC システムを使用しました。クロマトグラフィー分離には、プレカラム (長さ 5 mm × 内径 2.1 mm、粒子サイズ 1.7 μm) を備えた Waters Acquity UPLC CSH C18 カラム (長さ 100 mm × 内径 2.1 mm、粒子サイズ 1.7 μm) を使用しました。移動相 A は 9:1 アセトニトリル:水、B は 8:2 IPA:アセトニトリルでした。ポジティブモードエレクトロスプレーイオン化 (ESI) の場合、移動相は 10 mM ギ酸アンモニウムと 0.1% ギ酸で修飾されました。ネガティブモード ESI の場合、移動相は 10 mM 酢酸アンモニウムで修飾されました。流速は 600 μl min-1、カラム温度は 65 °C、注入量は 5 μl でした。移動相の勾配は、0 ～ 0.6 分で 15% B、2 分で 30% B、2.5 分で 48% B、11 分で 82% B、11.5 ～ 12 分で 99% B、および 12.1 ～ 12 分で 15% B でした。 14.2分 HESI ソース条件は次のとおりです: シースガス流量 55、補助ガス流量 15、スイープガス流量 3、キャピラリー温度 275 °C、S レンズ RF レベル 50、補助ガスヒーター温度 450 °C、ニードル電圧 3,500 V および -3,500 V V はそれぞれ正イオン化モードと負イオン化モードを表します。 DDA MS/MS スペクトルは、上位 4 つのイオンについて取得されました。 MS スキャンは、120 ～ 1,700 m/z の 60-k 分解能、AGC ターゲット 106 イオン、最大蓄積時間 100 ms で収集されました。 MS/MS スペクトルは、15 k 分解能、1 Da 分離ウィンドウ、20、30、および 60 の正規化衝突エネルギー、2 秒の動的排除ウィンドウ、8 × 103 AGC ターゲット、および 50 ミリ秒の最大蓄積時間で収集されました。スペクトルはセントロイドモードで保存されました。プールされた各 QC サンプルについて、3 ラウンドの反復排除 MS/MS を取得しました。すべてのサンプルを分析した直後に、プレートを真空下で乾燥させ、ホイルで密封し、-80 °C で保管しました。

上記の乾燥水相サンプルを-80℃から取り出し、ピリジン中の40 mg ml-1 メトキシアミン塩酸塩10 μlを各ウェルに加えました。プレートを密閉し、30℃で90分間振盪した。ホイルを除去し、90μlのN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド(C8-C30脂肪酸メチルエステルの内部標準を含む)を各ウェルに添加し、プレートを37℃で30分間振盪した。次いで、プレートを室温、2,400gで15分間遠心分離した。ホイルを除去し、90μlの上清をガラス製インサートを備えたガラス製クリンプトップバイアルに移し、圧着して閉じた。誘導体化後 48 時間以内にサンプルを分析しました。 GC-MS 分析は前述のように実行されました 66。簡単に説明すると、RTx-5Sil MS カラム (内径 30 m × 0.25 mm、0.25 μm 95:5 ジメチルジフェニルポリシロキサンフィルム) を備えた Agilent 6890 GC を使用して、0.5 μl をスプリットレスモードで分析しました。クロマトグラフィーには、1 ml min-1 のヘリウムと 50 °C ～ 275 °C の温度勾配を使用しました。 MS 分析は、Leco Pegasus III TOF 質量分析計を使用して実行されました。スペクトルは、70 eV EI で 1 秒あたり 17 スペクトルで収集されました。データファイルは Leco ChromaTOF ソフトウェアで前処理され、スペクトルと保持時間のマッチングのために FiehnLib を備えた自動 GC-MS データ処理パイプライン BinBase67 を使用してさらに分析されました。

胆汁酸は、以前に報告されているように標的化され、定量化されました4。簡単に説明すると、親水性相互作用クロマトグラフィー (HILIC) ESI+ 分析で得られた乾燥した水相サンプルプレートを、-80 °C の冷凍庫から取り出し、60 μl の胆汁酸実行溶媒 (5 つの同位体 100 ng ml-1 を含む 1:1 ACN メタノール) に溶解しました。標識胆汁酸内部標準）。プレートを30秒間ボルテックスし、水浴中で5分間超音波処理した。すべてのサンプルを胆汁酸実行溶媒で 30 倍に希釈しました。すべてのプレートを 708 g、4 °C で 15 分間遠心分離し、分析まで Vanquish オートサンプラーに 4 °C で保存しました。 9 点標準曲線を 0 ～ 1,500 ng ml-1 の間で作成し、サンプルを使用して分析しました。 Vanquish UPLC および Altis QqQ 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) をターゲット LC-MS/MS 分析に使用しました。 Acquity BEH C18 カラム (100 mm × 内径 2.1 mm、粒径 1.7 µm、Waters) を、水の移動相 A とアセトニトリル B で使用し、どちらも 0.1% ギ酸を添加しました。 Skyline ソフトウェアとカスタム R スクリプトを使用して胆汁酸分析物の処理と定量を行いました。

SCFA の定量化は、以前に報告されたプロトコル 68 に基づいて、N-tert-ブチルジメチルシリル-N-メチルトリフルオロアセトアミド (MTBSTFA) による誘導体化を通じて実行されました。簡単に説明すると、10 μl の腸上清を、重水素標識 SCFA 内部標準を含む 50 μl LC-MS グレードの水と 10 μl の 37% 塩酸をあらかじめ満たした氷上の 1.5 ml 微量遠心管に移しました。次に、重水素標識SCFA内部標準も含むMTBE 100μlを各チューブに添加し、チューブをロータリーシェーカープレート上で室温で30分間振盪した。チューブを 14,000 g で 2 分間遠心分離し、20 μl MTBE (上層) を低回収インサートを取り付けたクリンプトップ GC-MS バイアルに移しました。次に、5μlのMTBSTFAを各バイアルに添加し、次いで密封した。バイアルをオービタルシェーカープレート上で 80 °C で 30 分間振盪し、室温まで冷却し、GC-MS で分析しました。 Leco Pegasus IV TOF 質量分析計に接続された Agilent 6890 GC を、DB5 DuraGuard (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) キャピラリーカラムとともに使用しました。その後、1:10 スプリットモードを有効にし、ヘリウム流量 1.2 ml min-1、温度を 20.8 分かけて 50 °C から 290 °C まで上昇させ、スキャン速度 50 ～ 550 の 1 分あたり 17 スペクトルで 1 μl を注入しました。 m/z。 1 ～ 100 μg ml-1 の 6 点標準曲線を 80 サンプルごとに分析し、ブランクサンプルを 10 実験サンプルごとに分析しました。サンプルと標準曲線ミックスは、GC-MS 分析の 24 時間以内に調製されました。データは Agilent (.d) 形式に変換され、Agilent MassHunter Quant vB09.00 を使用して処理されました。分析物と内部標準の比率を使用した直線 6 点標準曲線を使用して、実験サンプル中の SCFA を定量しました。

MS-DIAL v.4.80 (参考文献 58) は、対象外の LC-MS/MS データを処理するために使用されました。 HILIC LC-MS/MS (ESI+ および ESI-) およびリピドミクス (ESI+ および ESI-) データセットは、手動で最適化されたパラメーターを使用して処理されました (補足表 9)。ピークの高さは、すべての非ターゲット分析について報告されました。実験的な MS/MS スペクトルは、HILIC 分析用に北米の MassBank および NIST20 スペクトルライブラリと照合され、MS-DIAL のすべての脂質参照 MS/MS スペクトルはリピドミクス分析に使用されました。同一のクロマトグラフィー条件下で実行された本物の標準からの HILIC およびリピドミクスの保持時間情報は、代謝産物のアノテーションの別の証拠として使用されました。代謝物のアノテーションは、保持時間との正確な質量の一致および/またはライブラリースペクトルとの MS/MS の一致に基づいていました。ブランクの減算は、実験サンプルからの最大強度がメソッドブランクの平均の少なくとも 10 倍である LC-MS 特徴を保持することによって実行され、補足表 2 に記載されているようにさらなるデータ削減が行われました。データ処理は、ソース内フラグメントの同定のための保持時間の近い特徴間の相関を使用した、MS/MS 一致品質、ピーク品質、ピークアラインメント、およびソース内フラグメントの除去に関する注釈付き特徴の手動調査でした。スペクトルライブラリからの複数の代謝産物が 1 つの実験 MS/MS と一致した場合、その一致は非固有の MS/MS 一致として記録されました (補足表 1)。 Retip69 を使用して計算された予測保持時間は、低品質のアノテーションにフラグを立てるための追加の証拠として使用されました。

微生物ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）７０を使用して、カプセル装置または１００ｍｇの糞便から５０μｌのＤＮＡを抽出した。 16S rRNA アンプリコンは、Earth Microbiome Project が推奨する 515F/806R プライマーペアと 5PRIME HotMasterMix (Quantabio、2200410) を使用し、サーモサイクラーで次のプログラムを使用して生成しました: 94 °C で 3 分間、94 °C で 45 秒を 35 サイクル、 50 °C で 60 秒、72 °C で 90 秒、その後 72 °C で 10 分間。 UltraClean 96 PCR Cleanup キット (QIAGEN、12596-4) および Quant-iT dsDNA 高感度アッセイキット (Invitrogen、Q33120) を使用して、PCR 産物を洗浄、定量し、プールしました。サンプルは、MiSeq (Illumina) で 300 bp のリードで配列決定されました。配列データは、Chan Zuckerberg BioHub Sequencing 施設で Illumina bcl2fastq アルゴリズムを使用して逆多重化されました。その後の処理は、擬似プーリング 72 を使用して前述したように、R 統計コンピューティング環境 v.4.0.3 (参考文献 71) と DADA2 を使用して実行されました。 truncLenF パラメーターと truncLenR パラメーターはそれぞれ 250 と 180 に設定されました。分類は、Silva rRNA データベース v.132 (参考文献 73) を使用して割り当てられました。 2,500 を超えるリードを持つサンプルは分析のために保持されました。

統計的検定は R71 を使用して実行されました。 LMM は lmerTest および lme4 R パッケージを使用して実行されました。腸全体の空間的な違いを調べるために、サンプリング位置（近位（デバイスタイプ 1 および 2）または遠位（デバイスタイプ 3 および 4））、食事記録から分類された 8 つの食品タイプ（野菜および動物タンパク質（肉））を考慮した LMM を適用しました。、卵および魚）、穀物（米、パスタ、パンおよびその他の穀物）、コーヒーまたは紅茶、デザートまたはアルコール（ビール、ワインまたはアルコール炭酸飲料）、乳製品および果物）、および固定効果変数としての 6 か月以内の抗生物質の摂取量と相互作用-ランダム効果変数としての個人変動 (補足表 3 および 4)。食品の種類は、カスタマイズされた評価フォームを使用して、参加者が書いた食事記録から手動で割り当てられました。代謝産物の存在量は log10 変換され、欠損値はゼロとして扱われ、続いて LMM 分析の前に -1 と 1 からスケーリングされました。 Benjamini-Hochberg74 補正を使用して、複数の仮説検定を説明しました。微生物叢 (log2 スケールのアンプリコン配列変異体の存在量) と代謝物 (log10 スケールの代謝物存在量) の間の相関関係は、ピアソン相関を使用してアンプリコン配列変異体レベルで計算されました。 Limma-Voom 差次存在量分析を使用した差次存在量分析は、FAHFA およびスルホノリピドの存在/不在分析に利用されました。絶対差分存在量 > 0.75 および Benjamini-Hochberg 補正 P < 0.1 を持つ分類群のみが考慮されました。 ChemRICH75 を使用して濃縮統計を計算しました。クラスタリングは、R の cor 関数を使用して計算された代謝物スピアマン順位相関行列と、R の as.dist 関数を使用して計算されたユークリッド距離を使用して hclust 関数を使用して実行されました。PLS-DA および主成分分析 (PCA) は、ropls を使用して実行されました。 R76のパッケージ。参加者とデバイスの種類を区別するための PLS-DA モデルは、7 倍の相互検証によって評価されました。過剰適合をテストするために、ropls R パッケージによって実行されるクラスラベルの 20 ～ 1,000 個のランダムな置換を使用すると、モデルは Q2Y > 0.15 および P < 0.05 を維持しました (参考文献 77)。非ターゲット LC-MS/MS (HILIC および RP ESI+/-) の特徴は、各プラットフォームの内部標準の合計に対して正規化されており、単一化合物に対する正規化よりも堅牢であることが示されています 78。この正規化は、各 LC-MS 特徴をそのサンプルの内部標準ピーク高さの合計で割ることによって実行されました 78,79。 GC-MS データは、公開されたプロトコルで広く議論されているように、注釈付きのすべての代謝物の強度の合計に正規化されました 80。この方法は、最近では有効ピーク総面積に対する正規化と呼ばれる GC 方法に特有の差異に対処します 81。 CapScan および便サンプルと比較すると、プールされた QC データは密集したクラスターで見つかりました (拡張データ図 1)。データセットの結合中、複数のアッセイで検出された代謝物は 1 つの機器からのデータのみを保持するように簡素化され、技術的分散 (プールされた QC の変動係数 %) が低いアッセイからのデータを優先して保持しました。単一アッセイでのみ検出された代謝物は、プールされた QC の % 分散係数とは無関係に、データセットに残りました (補足表 1)。 PCA および PLS-DA の前に、各代謝産物に対して、未検出の特徴について報告された最小ピーク高さの 10 分の 1 を使用した Log10 変換とゼロ値補完を実行しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

生の質量分析データは、メタボロミクスワークベンチ (https://www.metabolomicsworkbench.org/) の研究 ST002073、ST002075、ST002407、ST002409、および ST002411 で入手できます。 16S およびメタゲノミクスシーケンシングリードは、BioProject PRJNA822660 の下で NCBI で入手できます。分類は、Silva rRNA データベース v.132 (https://www.arb-silva.de/) を使用して割り当てられました。質量スペクトルには、MassBank of North America 公共図書館 (https://massbank.us/) および NIST からライセンス供与された NIST20 ライブラリを使用して注釈が付けられました。スクリプトは Zenodo (https://zenodo.org/record/7659119#.ZBGhMh_P23A) にアーカイブされています。

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リファレンスをダウンロードする

J. Wells と Z. Tippins は、西海岸メタボロミクスセンターでの質量分析を支援しました。 D. Barupal の R コードは、ChemRICH 評価のために彼の GitHub サイトからダウンロードして使用されました。 C. Brydges は統計的回帰分析について相談しました。この研究は、OFに対するUSDA 2021-67017-35783、KCHに対する国立衛生研究所（NIH）助成金RM1 GM135102、KCHに対する国立科学財団助成金EF-2125383によって資金提供され、JFの給与は助成金NIH R01 AT010216およびNIH U19によって提供されました。 AG023122。この資料も、助成金番号 2 に基づいて米国科学財団によって支援された研究に基づいています。 DSJG への 1936687 は、スタンフォード大学医学部学部長フェローシップおよび NIH F32 DK130574 によって支援されました。 DAR は、スタンフォード大学のトーマス C. およびジョアン M. メリガン基金によって支援されています。 KCH と DAR はチャンザッカーバーグバイオハブ調査員です。

ウェストコーストメタボロミクスセンター、カリフォルニア大学、デイビス、カリフォルニア州、米国

ジェイコブ・フォルツ、フアン・モンテス・モラレス、オリバー・フィーン

スタンフォード大学医学部遺伝学科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

レベッカ・ニール・カルバー

スタンフォード大学医学部医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ジェシカ・グレンビ & デヴィッド・A・レルマン

シリコンバレー神経胃腸科および運動性センター、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国

ジョージ・トリアダフィロプロス

スタンフォード大学医学部微生物学および免疫学教室、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

デビッド・A・レルマン & カーウィン・ケイシー・ファン

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

デビッド・A・レルマン & カーウィン・ケイシー・ファン

米国カリフォルニア州パロアルト退役軍人局パロアルト医療システム感染症セクション

デビッド・A・レルマン

スタンフォード大学生物工学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

カーウィン・ケイシー・ファン

Live Bio、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

シャロンより

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OF、KCH、DS が研究を設計しました。 JF はメタボロームデータを取得および処理し、JMMJF の支援を受けて統計分析を実行し、図や表を作成しました。 GT は参加者を募集し、同意とサンプルを取得しました。 KCH、RNC、JG、DAR はマイクロバイオームデータを取得、処理、分析しました。 JF と OF は、DS、KCH、GT、RNC からの寄稿を受けて原稿を執筆しました。著者全員が原稿の最終版を承認しました。

オリバー・フィーンへの手紙。

DS は従業員であり、人間の消化管に関心を持つ企業である Envivo Bio の株式を保有しています。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

この研究は、独立した組織である西部治験審査委員会内のコペルニクスグループによって、研究番号 2 で審査され、承認されました。 1186513. 各参加者からインフォームドコンセントを得ました。

Nature Metabolism は、この研究の査読に貢献してくれた Robert Quinn と他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Ashley Castellanos-Jankiewicz、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a. 腸内サンプリング装置タイプのサンプルの pH。ボックスは±1 四分位範囲を表し、線は中央値サンプルから最も遠いサンプルまで伸び、中央値から最大 1.5 四分位範囲離れた範囲まで伸びます。すべてのサンプルは個別の点としてプロットされます。 (合計デバイス数 n = 274、デバイスタイプ 1 = 75、デバイスタイプ 2 = 70、デバイスタイプ 3 = 69、デバイスタイプ 4 = 60) ****: p < 0.0001 (Wilcoxon 符号付きランク)。 b、メタボロミクスデータセットからの正規化されたピーク高さの主成分分析 (PCA)。 QC サンプルは、ヒトの腸管サンプルからプールされた腸内容物です。

サンプルと代謝物は、階層的クラスタリングによってそれぞれ x 軸と y 軸に編成されます。各サンプルには、被験者番号とサンプルの種類 (デバイスの種類または便) がラベル付けされています。代謝物の存在量を色で表し、代謝物（行）ごとに最小値と最大値を個別に設定します。

サンプルはデバイスの種類ごとに X 軸に編成され、代謝物は階層的クラスタリングに従って Y 軸に編成されます。色は代謝物の存在量を表し、カラースケールの最小値と最大値は代謝物 (行) ごとに個別に設定されます。

デバイス 1 + 2 (近位) からのデータとデバイス 3+4 (遠位) からのデータの比較。有意性は、線形混合効果モデル (LMM) を使用して計算されました。水平の破線は、p < 0.05 の有意性閾値を表します (正確な p 値については、補足表 4 を参照してください)。丸は、偽発見率 (FDR) 補正または効果サイズ係数 < ± 0.2 後に有意差がない代謝物を示します。ひし形は、FDR 補正 (n = 9,317) 後に有意差 (p<0.05) があり、エフェクトサイズ係数 > ± 0.2 である代謝物を示します。この分析には、腸サンプルの >50% で検出された特徴のみが含まれました (n = 9,317 の特徴)。効果量係数は、LMM によって推定される傾きであり、正 (負) の係数は、近位の上部腸と比較して遠位の代謝産物が高い (低い) ことを表します。縦の破線はエフェクトサイズ係数の ±0.20 倍です。

化学濃縮統計は ChemRICH によって実行されました。腸サンプルの >50% で検出された代謝物がこの分析に含まれました (n = 1182 代謝物)。これらの結果は、化学的親油性 (logP) および化学的クラスの有意水準 -log10(p 値) によってクラスを分離することによって視覚化されました。赤い丸は、化学クラスが近位腸上部と比較して遠位腸の上部で高いことを示し、青は、化学クラスが近位腸上部と比較して遠位で低いことを示します。紫は、化学クラスターに有意に高い代謝物と、近位上部腸と比較して遠位で有意に低い代謝物があることを示します。円の大きさは化学クラスのサイズを表します。

a、分散分析（クラスカル-ウォリス）によって各被験者について計算された、腸領域（デバイスの種類）間または食事間（4つのカプセルデバイスのサンプリング時点）で大きく異なる代謝産物の数。各被験者のサンプルの >50% で検出された代謝物のみがこの分析に使用されました (n = 1182 代謝物)。非FDR補正p < 0.05を有意性閾値として使用した。 b. 多変量判別分析 (PLS-DA) を実行して、被験者間または領域間を区別するために最も重要な代謝産物を特定しました。これらのグループを区別するために最も重要な 100 個の代謝物は、投影スコア (VIP) における変数重要度によってランク付けされ、化学サブクラスによって分類されています。代謝物が 3 つ未満の化学サブクラスは「その他」として報告されます。

各被験者のサンプルの >50% で検出された代謝物のみがこの分析に使用されました (n = 1182 代謝物)。非FDR補正p < 0.05を有意値カットオフとして使用しました。 a、化学クラスおよび各化学クラスの割合ごとにグループ化された、各被験者の腸領域間で存在量が大きく異なる代謝物。 b. サンプリング時点間で存在量が大きく異なる代謝物。化学クラスおよび各化学クラスの割合ごとにグループ化されています。

代謝産物には、胆汁色素、ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル (FAHFA および AAHFA)、短鎖脂肪酸、スルホノリピド (SL)、および二次胆汁酸が含まれます。すべての便サンプルのデータが表示され、サンプルは被験者ごとに整理されています。この研究の 1 か月前と 5 か月前に抗生物質を摂取した 2 人の被験者が強調表示されています。カラーバーは、胆汁酸の代謝物の存在量 (ピークの高さ) または濃度 (ng/mL) を表します。最小値と最大値を使用して、各代謝産物 (各行) のカラースケールを設定しました。

代謝物はヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル (FAHFA および AAHFA) であり、すべてのデバイスサンプルの >50% で脂肪酸が検出されます。すべてのデバイスのサンプルが表示され、主題ごとに整理されています。上位 (FAHFA) セクションと下位 (脂肪酸) セクション内では、代謝産物は階層的クラスタリングに基づいて順序付けされます。カラーバーは、胆汁酸の代謝物の存在量 (ピークの高さ) または濃度 (ng/mL) を表します。最小値と最大値を使用して、各代謝産物 (各行) のカラースケールを設定しました。

補足図。 1～3。

補足表 1 ～ 9。

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転載と許可

フォルツ、J.、カルバー、RN、モラレス、JM 他。上部腸管に沿ったヒトのメタボロームの変動。 Nat Metab 5、777–788 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z

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受信日: 2022 年 9 月 24 日

受理日: 2023 年 3 月 3 日

公開日: 2023 年 5 月 10 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z

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