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May 02, 2023

慢性ストレス下におけるマウスの血液および局所組織中の副腎皮質ステロイドのプロファイリング

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7278 (2023) この記事を引用

262 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ストレスはコルチコステロイドの血漿濃度を上昇させますが、その組織レベルは不明です。 私たちは、繰り返される社会的敗北のパラダイムを用いて、コルチコステロン (CORT)、プロゲステロン (PROG)、11-デオキシコルチコステロン (11DOC)、および 11-デヒドロコルチコステロン (11DHC) の組織レベル、および腸内微生物叢に及ぼす慢性ストレスの影響を調べました。ストレス反応。 雄の BALB/c マウス、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析法および 16S RNA 遺伝子配列決定をそれぞれステロイド レベルと糞便マイクロバイオームのスクリーニングに使用しました。 ストレスにより、結腸やリンパ系器官よりも脳、肝臓、腎臓で CORT の増加が大きく引き起こされましたが、11DHC は結腸、肝臓、腎臓で最も高く、脳とリンパ系器官でははるかに低かったです。 血漿中の CORT/11DHC 比は脳と同様でしたが、他の臓器でははるかに低かったです。 ストレスはまた、PROGおよび11DOCの組織レベルを変化させ、PROG/11DOC比は、血漿および他の臓器よりもリンパ系臓器においてはるかに高かった。 ストレスは腸内細菌叢のβ多様性に影響を与えるが、α多様性には影響を与えず、LEfSe分析によりストレス治療に関連するいくつかのバイオマーカーが明らかになった。 私たちのデータは、社会的敗北ストレスが腸内細菌叢の多様性を調節し、コルチコステロイドの局所レベルの組織依存性変化を誘発することを示していますが、これは多くの場合、全身レベルを反映していません。

ストレスの多い身体的および心理的課題への反応は、現在の状況下で個人の生存を守り、身体システムを維持するための適応プロセスを表しています1。 ストレス刺激は視床下部-下垂体-副腎(HPA)軸に一連のイベントを誘発し、これにより副腎皮質が活性化され、糖質コルチコイド、ヒトではコルチゾール、ラットとマウスではコルチコステロン(CORT)が放出されます。 脳内のストレス反応の神経経路はストレッサーの種類によって異なりますが、HPA 軸の活性化が最後の共通経路であると考えられており、その結果、循環グルココルチコイドが純増加します 2。 グルココルチコイドは多くの組織に作用して、代謝、免疫、認知、生殖システムを調節するゲノム効果および非ゲノム効果を誘発します3。 グルココルチコイドに加えて、ストレスも副腎皮質からのプロゲステロン (PROG) および 11-デオキシコルチコステロン (11DOC) 分泌の急速な増加をもたらします 4,5。

一部の組織は局所ステロイドレベルを積極的に調節できるため、グルココルチコイドの局所効果はその血漿濃度だけに依存するわけではありません。 糖質コルチコイドの新規合成酵素は、副腎皮質だけでなく、腸6、7、8、リンパ器官9、10、11、免疫細胞12、13などの他の組織でも発現していますが、ステロイド合成の最初のステップのみが発見されています。後者では。 さらに、一部の細胞は、酵素 11-ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ 1 型 (11HSD1) を発現します。この酵素は、糖質コルチコイドの不活性 11-オキソ誘導体であるコルチゾンおよび 11-デヒドロコルチコステロン (11DHC) を活性糖質コルチコイドのコルチゾールおよび CORT に変換し、局所的な糖質コルチコイドのレベルを効果的に増幅します。活性糖質コルチコイド。 この酵素は、肝臓、腎臓、腸 14、リンパ器官 15、16、免疫細胞 17 など、多くの組織で発現しています。 腎臓や腸などの一部の組織内では、CORT とコルチゾールは、酵素 11-ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ 2 型 (11HSD2) によって局所的に不活性な 11-オキソ誘導体である 11DHC とコルチゾンに変換されます14。 末梢組織に加えて、脳でも、副腎を含む末梢内分泌器官に由来するステロイドの新規合成または局所変換を介したステロイドの局所産生が見られます18,19。 興味深いことに、ストレスはグルココルチコイドの全身レベルを増加させるだけでなく、11HSD1を含むステロイド生成酵素を時間および組織依存的に調節する20、21、22。これは、コルチコステロイドの局所産生および代謝、ならびにストレスに応答したそれらの変化が、ステロイド生成酵素の調節を調節する可能性があることを示唆している。特定の組織における HPA 軸反応の影響。

副腎外ステロイド生成酵素と 11HSD が局所コルチコステロイドを形成すると考えられていますが、慢性ストレスに応答した組織コルチコステロイドのプロファイリングは、慢性ストレスを受けたラットとマウスの脳、胸腺、腸における CORT 濃度を除いて直接定量化されたことはありません 23,24。 したがって、本研究は、社会的敗北を繰り返すモデルを用いて、慢性ストレスにさらされたマウスの血液、脳および末梢組織におけるプレグネノロン(PREG)、PROG、11DOC、CORTおよび11DHCの全身レベルと局所レベルを比較することを目的とした。 多くの研究が、慢性的なストレスへの曝露が腸内微生物群集の構造を変化させ25、腸内微生物叢が宿主の行動とストレス反応を変化させ26、一部のステロイドの組織レベルを調節する可能性があることを示しているため、我々はまた、曝露が腸内微生物群集の構造を変化させるかどうかも決定した。慢性的な心理社会的ストレスにより、実験動物の微生物叢の群集構造が変化しました。

実験は、12/12 日の温度管理された部屋 (22 ± 1 °C) で飼育された 9 週齢の雄 BALB/c マウス (チェコ科学アカデミー生理学研究所、プラハ) で行われました。ペレット食のアルトロミン 1314 (ドイツ、ラーゲのアルトロミン) と水道水を自由に摂取できる、明暗サイクル (午前 7 時に点灯)。 2 週間の順応期間の後、マウスをランダムに 2 つのグループ (ストレスを受けたグループと対照グループ; 各グループあたり n = 5 匹) に分け、個別にケージに収容しました。 この研究で使用された社会的敗北ストレスプロトコルは、以前の研究で使用された居住者-侵入者のパラダイムに似ていました22。 簡単に言えば、このプロトコルは、雄のマウスが見知らぬ雄の侵入者から自分の領土を守ること、および若い侵入者の居住者への曝露がHPA軸の活性化に関連する予測不可能なアロスタティック負荷を表すという事実に基づいていました。 性経験のある高齢の男性 (n = 9) を居住者として使用し、実験前の 7 日間、寝具を交換せずに個別に収容しました。 7 日間の隔離期間の後、各侵入者は週に 3 回 (2 日おき)、異なる居住者にさらされました。 各侵入者は合計 16 回居住者にさらされました。 まず、居住者と侵入者を居住者のケージ内で 10 分間互いに直接物理的に接触させた後、侵入者をスチールメッシュで分離し、次の 50 分間居住者と侵入者の間の感覚的接触を維持しました。 この設定により、怪我のリスクが軽減されましたが、侵入者は居住者との感覚相互作用により継続的な心理的ストレスにさらされました。 社会的交流セッションの後、侵入者は居住者のケージから取り出され、同じ部屋にあるホームケージに戻されました。 対照(ストレスを受けていない)マウスは、別の静かな部屋のホームケージ内で静かに保ち、ストレス群の前日に屠殺した。 概日リズムの影響を最小限に抑えるために、すべてのストレスセッションは、午前8時55分に開始された最後のストレスセッションを除き、それぞれのマウスの間に15分の間隔を置いて午前9時から10時30分の間に実施されました。 すべてのマウスは、ストレッサーの開始からちょうど 80 分後 (最後のストレスセッションから 20 分後) に屠殺されました。 両方のマウス群(ストレスを与えた群および対照群)を午前10時15分から11時40分の間に屠殺した。この実験は、チェコ科学アカデミー生理学研究所の動物管理使用委員会によって承認された。

最後の社会的交流セッションの後、マウスをイソフルラン蒸気で直ちに麻酔した。 このタイプの麻酔が選択されたのは、イソフルラン麻酔が屠殺中の CORT レベルに大きな影響を与えなかったためです 28。 対照マウスを注意深くホームケージから取り出し、ホームケージを乱してから 1 分以内に深く麻酔をかけました。 心臓穿刺により血液を採取し、2000 g、4 °C で 10 分間遠心分離し、-80 °C で保存しました。 次に、麻酔をかけたマウスの首を切り落とし、脳(大脳皮質、海馬)、肝臓、腎臓、結腸、胸腺、腸間膜リンパ節(MLN)のサンプルを採取し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる分析まで-80℃で保存した。 ストレス期間の開始前と終了直後に糞便ペレットのサンプルを収集し、滅菌チューブに入れ、配列決定のための遺伝物質の抽出まで -80 °C で保存しました。

ステロイドは、Polytronホモジナイザー(Kinematica AG、ルツェルン、スイス)を用いて、1mlの氷冷水中で調製された血液および組織ホモジネートから2回抽出された。 血液(100μl)と900μlの水またはホモジネートサンプル(1000μl)を、2mlのtert-ブチルメチルエーテルを添加することによって抽出した。 混合物を30秒間3回ボルテックスし(1500rpm)、1500gで15分間遠心分離して、水相と有機相を分離した。 遠心分離したサンプルを凍結させ、上部の有機相を清潔なチューブに移しました。 水相を 2 ml の tert-ブチル メチル エーテルで再度抽出し、有機相を合わせて、窒素流中 40 °C で蒸発させ、LC-MS/MS 用にさらに処理する前に -80 °C で保存しました。分析。 ビシンコニン酸法を使用して、組織ホモジネートのタンパク質濃度を10μlの組織ホモジネート中で測定した。

各ステロイド化合物の参照標準 (PREG PROG、11DOC、CORT、および 11DHC) および内部標準 (PROG-d9、CORT-d4) をメタノールに溶解して 0.5 mg/ml の原液を得、-18 ℃で 1 週間まで保存しました。 ℃。 次いで、内部標準を個々のサンプルまたは品質管理試験サンプルに最終濃度 0.1 μg/ml まで添加しました。 ステロイド化合物の定量化のための検量線は、ピーク面積 (内部標準によって調整) 対関連する参照標準の濃度をプロットすることによって作成されました。 曲線は、0.0001 ~ 1.000 μg/ml の濃度範囲 (対照サンプルを含む) の 6 つのキャリブレーション ポイントを使用して作成されました。 この範囲では、質量検出器の応答対ステロイド濃度は線形でした。 LC-MS/MS 分析の前に、各サンプルの乾燥上清を超音波バスを使用して内部標準を含むメタノール 150 µl に再溶解し、遠心分離し (15 分間、13,500 rpm、室温)、0.2 µm PVDF スピンフィルター (Thermo) で濾過しました。 Fisher Scientific、米国テネシー州ロックウッド)。 抽出物をバイアルに移し、LC-MS/MS 分析の前に -18 °C で保存しました。

LC-MS/MS によるステロイド分析は、前述のように実施されました 7。 簡単に説明すると、クロマトグラフィー分離は、逆相 Kinetex XB-C18 カラム (2.1 × 100 mm、2.6 μm、Phenomenex、トーランス、カリフォルニア州、米国)およびグラジエント溶出。 質量分析は、加熱エレクトロスプレー イオン化源 (HESI-II) および Xcalibur ソフトウェア バージョン 4.0 を備えた四重極/軌道イオントラップ Q Exactive 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) を使用して処理されました。 質量分析計は、次のソース条件で正イオン モードで操作されました。スプレー電圧 2.5 kV。 シースガス流量 49AU。 補助ガス流量 12 AU およびスイープガス流量 2 AU。 キャピラリー温度 260 °C。 ヒーター温度419℃。 データは、Xcalibur ソフトウェアを使用して取得されました。 LC-MS/MS 分析が適切に実行されることを保証するために、10 回ごとの分析後に品質管理サンプルが入力されました。 サンプルの測定は 3 回繰り返して行われました。 サンプル中のステロイドの濃度を検量線から外挿し、ml あたりの ng (血漿の場合) に変換するか、組織のタンパク質の mg に正規化しました。 ステロイド濃度が検量線 (BC) の最低値を下回っている場合、その濃度は測定不能であると見なされます。

組織からのステロイドの相対回収率は、濃度 300、30、3、および 0.3 ng の CORT、11DHC、11DOC、PROG、およびプレグネノロン (PREG) の標準溶液をスパイクした組織サンプル中の分析物のピーク面積を比較することによって推定されました。 /ml 抽出前と抽出後。 研究対象の組織サンプルにおけるステロイドの平均相対回収率は、ステロイドおよびマトリックスに応じて 75 ~ 90% 以上の範囲でした (PREG、81.3 ± 5.0%、PROG、86.2 ± 2.5%、11DOC、93.5 ± 3.2%、CORT、 93.2 ± 4.9%、11DHC 77.6 ± 2.9%)。

ストレスを受けた動物とストレスを受けていない動物のマイクロバイオームプロファイルを決定するために、自発的な排便直後に個々のマウスから糞便サンプルを滅菌チューブに無菌的に収集し、-80℃で保存しました。 コントロールサンプルは、ストレス期間の前に収集され(STAEX グループ; n = 10)、その後 1 か月後にストレスを受けていないマウス(CTRL グループ; n = 5)および屠殺日の最後のセッション後にストレスを受けたマウス(STRESS グループ; n = 5)から収集されました。 5)。 QIAmp PowerFecal DNA Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を製造業者のプロトコールに従って使用して、各糞便サンプルから全 DNA を抽出しました。 抽出された DNA は、前述したように配列決定とマイクロバイオーム分析に利用されました 29。 簡単に説明すると、16S rRNA 遺伝子の V4V5 領域のアンプリコンを抽出した DNA から調製しました。 NEBNext Fast DNA Library Prep Set (New England Biolabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国) を使用してライブラリーを調製し、精製および定量しました。 次世代シーケンシングは Ion Torrent プラットフォーム (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を介して実行され、シーケンシング データは GenBank (アクセッション番号 PRJNA896122) に寄​​託されています。 STAEX グループの 3 つのサンプルでは配列決定が成功しなかったため、その後のデータ分析はこのグループの 7 サンプルのみから実行されました (n = 7)。

統計分析は、Statistica ソフトウェア (StatSoft Inc.、米国オクラホマ州タルサ) を使用して実行し、データは平均値 ± SEM として表されます。 データセットは、一元配置または二元配置分散分析 (ANOVA) とその後の事後テューキー検定によって分析されました。 一元配置分散分析を使用して、ステロイドレベルと CORT/11DHC、PROG/11DOC、CORT/PROG、および CORT/11DOC 比の組織プロファイルを比較しましたが、個々の組織のステロイドレベルに対する反復的な社会的敗北ストレスの影響は、対応のない分散分析によって分析されました。学生の t 検定。 二元配置分散分析を使用して、副腎および血漿中のステロイドレベルがストレスとステロイドの種類によって異なるかどうか、またストレスとステロイドの種類の相互作用があるかどうかを明らかにしました。 AP 値 ≤ 0.05 を有意であるとみなしました。

マイクロバイオーム分析は前述のように実行されました24。 簡単に説明すると、FASTQ 形式で得られた細菌 16S rDNA 遺伝子配列を QIIME 2 バージョン 2020.2 パイプラインによって分析しました。 品質管理は、キメラ配列をフィルタリングすることにより、DADA2 を使用して逆多重化された配列に対して実行されました。 続いて、99% の OTU 参照配列を含む SILVA データベースを使用して、クラスタリングと分類分類が評価されました。 α多様性(1つの生態系/対照またはストレスを受けたマウスのグループにおける種の多様性/豊かさを表す)は、クラスカル・ウォリス検定に基づくシャノン多様性指数を使用して決定されました。 ブレイ - カーティス距離 (β 多様性; 2 つのグループ/対照マウスとストレスを受けたマウスの間の種の多様性を記述する) に基づく主座標分析 (PCoA) は、希薄化後に生成されました。 シャノン多様性指数の箱ひげ図と 2 次元 PCoA プロットは、ggplot2 (https://ggplot2.tidyverse) を使用して R-Studio (バージョン 3.6.3) (http://www.rstudio.com/) で生成されました。 org) パッケージ。 楕円は各グループの信頼度 95% を示し、P 値 ≤ 0.05 は統計的に有意であると見なされます。 Adonis 順列多変量解析 (Adonis/PERMANOVA) と Bray-Curtis 距離行列を使用して、順列を 999 に設定したサンプル間の非類似性を評価しました。効果サイズ (LEfSe) アルゴリズムを使用した線形判別分析 (LDA) は、Galaxy モジュール (http) で実行されました。 ://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) 要因クラスカル・ウォリス検定とペアワイズウィルコクソン検定に基づいて、ストレス群と対照群の間で相対存在量の有意差があり、対数上のα値 0.05 と閾値 2.0 を持つ属を特定します。識別機能の LDA スコア。

この研究はヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施され、チェコ科学アカデミー生理学研究所 vvi の実験動物の保護と使用委員会によって承認されました。 すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。 この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。

社会的に敗北し、ストレスを受けていないマウスの副腎におけるステロイドプロファイリングは、オンラインの図1Aおよび補足図S1にまとめられています。 二元配置分散分析により、ストレス (F1,48 = 19.12、P < 0.001)、ステロイドの種類 (F5,48 = 78.62、P < 0.001)、およびストレス x ステロイドの種類の相互作用 (F5,48 = 3.99、P < 0.001) の有意な主効果が明らかになりました。 P < 0.01)。 Tukey の事後検査では、PROG および 11DOC のレベルに大きな変化はなく、副腎 PREG および CORT の有意な上方制御が示されました。 同様に、11HSD2 によって CORT から生成される 11DHC の局所レベルは、ストレスを受けたマウスとストレスを受けていないマウスの副腎の間で差がありませんでした。

プレグネノロン (PREG)、プロゲステロン (PROG)、11-デオキシコルチコステロン (11DOC)、コルチコステロン (CORT)、および 11-デヒドロコルチコステロン (11DHC) の副腎レベル (A) および血漿レベル (B) に対する社会的敗北の影響。 赤い列、コントロールのストレスを受けていないマウス (CTRL)。 緑の柱、慢性的な社会的敗北(ストレス)にさらされたマウス。 BC、検量線の最低値を下回ります。 ステロイドの量は、血漿 1 ml あたりの ng、または副腎についてはタンパク質 1 mg あたりの ng に変換されました。 データは平均値 ± SEM (n = 3 ~ 5) として表示されます。 ストレスを受けたマウスとストレスを受けていないマウスの間で有意に異なる値: ***P < 0.001、**P < 0.01、*P < 0.05。

予想通り、コルチコステロイドの血漿レベルは、PREGを除くステロイドの種類に関係なく、社会的敗北中に大幅に増加しました(図1B;補足図S1オンライン)。 二元配置分散分析により、ストレス (F1,30 = 76.03、P < 0.001)、ステロイドの種類 (F3,30 = 68.52、P < 0.001)、およびストレス x ステロイドの種類の相互作用 (F3,30 = 59.10、P < 0.001) の有意な効果が示されました。 0.01)。 副腎とは対照的に、ストレスは血漿 CORT (× 26) だけでなく、PROG (× 45)、11DOC (× 27)、および 11DHC (× 6) も有意に上方制御しました。

ストレス時の末梢組織におけるコルチコステロイドの組織レベルの変化を特定するために、脳、結腸、肝臓、腎臓およびリンパ系器官におけるコルチコステロイド、コルチコステロイド、コルチコステロイドのレベルを定量しました。 血漿と一致して、社会的敗北への曝露によりコルチコステロイドの局所レベルが増加し、この増加は特定の組織に依存した。

ストレスを受けていないコントロールのマウスでは、リンパ器官を除くすべての組織で局所的な CORT が検出されました。 ストレスは、MLNおよび胸腺を含むすべての組織のCORTレベルを大幅に増加させました(図2A;オンラインの補足図S1)。 この増加は、結腸で約 20 倍、腎臓で 40 倍、肝臓と脳で 60 倍以上でした。 一元配置分散分析により、ストレスを受けていない動物 (F4,18 = 3.23、P < 0.05) とストレスを受けた動物 (F6,27 = 7.73、P < 0.001) の両方で組織全体の CORT レベルが異なることが示されました。 ストレスを受けていない動物では、事後比較により、腎臓の CORT レベルが結腸 (P < 0.05) および皮質 (P < 0.01) の CORT レベルよりも有意に高いことが明らかになりました。 ストレスを受けた動物では、海馬、肝臓、腎臓の CORT レベルが他の組織よりも有意に高かった (P < 0.05 または P < 0.01)。 CORTとは対照的に、ストレスを受けていない動物の11DHCは、両方の組織間に有意差がなく、腎臓と結腸でのみ検出されました(図2B、オンラインの補足図S1)。 社会的敗北により、研究したすべての組織で 11DHC レベルが増加しました。 ただし、組織間には有意な差がありました (一元配置分散分析、F6,25 = 11.41、P < 0.001)。 11DHC レベルは、他の組織よりも結腸、腎臓、肝臓で高かった (P < 0.001 または P < 0.05)。

脳および末梢組織における(A)コルチコステロン(CORT)、(B)11-デヒドロコルチコステロン(11DHC)、(C)プロゲステロン(PROG)、および(D)11-デオキシコルチコステロン(11DOC)のプロファイリングに対する社会的敗北の影響。 データは平均値 ± SEM (n = 4 ~ 5) です。 赤い列、コントロールのストレスを受けていないマウス (CTRL)。 緑の柱、慢性的な社会的敗北(ストレス)にさらされたマウス。 BC、検量線の最低値を下回る。 股関節海馬、MLN 腸間膜リンパ節。 ステロイドの量は、タンパク質 1 mg あたりの ng に変換されました。 ストレスを受けたマウスとストレスを受けていないマウスの間で有意に異なる値: ***P < 0.001、**P < 0.01、*P < 0.05。

CORTと同様に、ストレスはその前駆体であるPROGおよび11DOCの組織レベルを大幅に増加させました(図2C、D;オンラインの補足図S1)。 ストレスを受けていないマウスの場合、一元配置分散分析では PROG の組織レベルが大きく異なり (一元配置分散分析、F4,19 = 28.72、P < 0.001)、結腸、海馬、肝臓よりも皮質と MLN のレベルが低かった (P < 0.001)。 < 0.05 または P < 0.001)。 ストレスの影響は肝臓を除くすべての組織で明らかであり、PROG の組織レベル間の差異はストレスを受けた動物でも持続しました (一元配置分散分析、F6,27 = 12.73、P < 0.001)。 海馬の PROG レベルは、他のすべての組織の PROG レベルよりも有意に高かった(海馬対結腸または皮質: P < 0.05; 海馬対肝臓、腎臓または MLN: P < 0.001; 海馬対胸腺 P < 0.01)。 11DOC に関しては、ストレスにより、肝臓を除くすべての組織でこのステロイドの局所レベルが大幅に増加しました (図 2D)。 11DOC 組織レベルのプロファイリングは、PROG (一元配置分散分析、ストレスを受けていないマウス: F6,27 = 33.26、P < 0.001、ストレスを受けたマウス: 一元配置分散分析、F6,28 = 10.17、P < 0.001) および 11DOC レベルと非常に類似していました。ストレスを受けたマウスの海馬では、他のすべての組織よりも有意に高かった(海馬対結腸または皮質: P < 0.05; 海馬対肝臓、腎臓、MLN、または胸腺 P < 0.001)。

脳および末梢組織における11HSD1と11HSD2の機能的関連性を調べるために、CORT / 11DHCの比率が分析されました(図3A;オンラインの補足図S2)。 ストレスを受けていない動物では、この比は血漿と腎臓では同様でしたが、結腸では 10 分の 1 でした (一元配置分散分析、F2,11 = 4.83、P < 0.05)。 ストレスを受けた動物に関しては、CORT/11DHC 比は組織間で大きく異なりました (一元配置分散分析、F7,29 = 9.76、P < 0.001)。 この比率は、結腸、肝臓、腎臓、MLN では血漿および脳よりも有意に低かった (P < 0.05 または P < 0.01)。 さらに、ストレスは血漿中の CORT/11DHC 比を有意に上昇させ (P < 0.01)、腎臓の CORT/11DHC 比を低下させました (P < 0.05)。

脳、末梢組織および血漿における(A) CORT/11DHC、(B) PROG/11DOC、(C) CORT/PROG、および(D) CORT/11DOC比のプロファイリングに対する社会的敗北の影響。 データは平均値 ± SEM (n = 3 ~ 5) です。 赤い列、コントロールのストレスを受けていないマウス (CTRL)。 緑の柱、慢性的な社会的敗北(ストレス)にさらされたマウス。 ND、未定。 股関節、海馬。 MLN、腸間膜リンパ節。 CORT、コルチコステロン。 11DHC、11-デヒドロコルチコステロン。 PROG、プロゲステロン。 11DOC、11-デオキシコルチコステロン。 ストレスを受けたマウスとストレスを受けていないマウスの間で有意に異なる値: ***P < 0.001、**P < 0.01、*P < 0.05。

副腎以外にも、コルチコステロイドの新規合成カスケード全体から一部の酵素のみを発現する組織があることはよく知られています 18,19。 したがって、個々の組織における他のステロイドの比率も計算することにしました(図3、オンラインの補足図S2)。 ストレスは結腸、海馬、皮質のPROG/11DOC比を有意に減少させたが、MLNと血漿では比を増加させた。 ストレスは肝臓の比率を変化させませんでした(図3B)。 PROG/11DOC 比のプロファイリングでは、ストレスを受けていない動物 (一元配置 ANOVA、F6,22 = 51.67、P < 0.001) とストレスを受けた動物 (一元配置 ANOVA、F7,31 = 18.93、P < 0.001) の両方で有意な組織差が示されました。 ストレスを受けた動物では、リンパ器官での PROG/11DOC 比が他の組織よりも有意に高かった(P < 0.001)が、ストレスを受けていないマウスでは、この比は他の組織よりも MLN および血漿で有意に低かった(P < 0.001)。

CORT/11DHC および PROG/11DOC 比と比較して、ストレスは結腸、脳、肝臓の CORT/PROG 比および CORT/11DOC 比を有意に増加させました (P < 0.01 または P < 0.001) が、血漿または血漿および血漿には影響を与えませんでした。それぞれ腎臓。 (図3C、D;オンラインの補足図S2)。 ストレスを受けていないマウスでは、どちらの比率も、肝臓、脳、結腸よりも血漿 (CORT/11DOC の場合は血漿と腎臓) で 13 倍以上高かった (CORT/PROG: 一元配置分散分析、F4,16 = 15.42、P < 0.001) ; CORT/11DOC: 一元配置分散分析、F5,22 = 11.64、P < 0.001)。 対照的に、ストレスを受けたマウスの CORT/PROG 比は腎臓で最高値に達しましたが (P < 0.001)、CORT/11DOC 比は肝臓で最高でした (肝臓 vs 腎臓 P < 0.05; 肝臓 vs その他)組織 P < 0.001) (CORT/PROG: 一元配置分散分析、F7,31 = 23.49、P < 0.001; CORT/DOC: 一元配置分散分析、F7,31 = 12.14、P < 0.001)。

α多様性については、クラスカル・ウォリス検定により、3つのグループ間でシャノン指数に統計的に有意な差がないことが明らかになりました(P = 0.51)(図4A)。 ブレイ カーティス距離 (α 多様性) に基づく PCoA は、マイクロバイオームの多様性に対する有意なストレス効果を示しました (R2 = 0.160、P = 0.038)。 図 4B に示すように、ストレスを受けたマウスのクラスターは中心でしたが、残りの 2 つのグループのクラスターは大きく分散していました。 門および家族レベルでの糞便微生物叢の相対組成は、すべてのマウス群で同様であり、対照群とストレス群の間に顕著な差はありませんでした(P > 0.05)。 主要な豊富な門はバシロータ門(以前はファーミキューテスとして知られていた)とバクテロイド門(以前はバクテロイデス門として知られていた)であり、ラクノスピラ科とムリバキュラ科が最も豊富な科でした(図5A、B)。 属レベルでは、ムリバキュラ科(以前はS24-7として知られていた)およびラクノスピラ科_NK4A136_グループが、すべてのマウスグループの中で最も豊富な属でした(図5C)。 ストレスを受けたグループとストレスを受けていないグループの糞便マイクロバイオームの特定の分類群を解明するために、LEfSe (LDA スコア > 2) 法が使用されました。 この分析によると(図5D、E)、5つの細菌属(アリスティペス、リケネラ、ルミニクロストリジウム5、ローズブリア、ヘリコバクター)が糞便微生物叢のストレスに関連していましたが、ストレスを受けていないマウスに関連した属はルミノクロストリジウム9のみでした(CTRLグループ) )。 Prevotellaceae NK3B31 グループおよび Parasutterella の属は、ストレス処理前のマウスの糞便マイクロバイオームと関連していました (STAEX グループ)。

腸内微生物叢構成の多様性に対する社会的敗北の影響。 (A) 異なるグループ間の細菌マイクロバイオームにおけるシャノン指数によるα多様性を示す箱ひげ図 (クラスカル-ウォリス検定、P = 0.51)。 (B) ブレイ - カーティス距離に基づく主座標分析プロット (PCoA) は、異なるグループ間で異なるクラスターを示しました。 楕円の信頼度は 95% でした。 STAEX、ストレス期間前に収集された対照サンプル (n = 7)。 CTRL、ストレスを受けていないマウスからのサンプルを 1 か月後に採取し、次に STAEX グループからのサンプル (n = 5)。 ストレス、1 か月間ストレスを受けた動物からのサンプル。

門 (A)、科 (B)、および属 (C) のレベルでの腸内微生物集団の相対的な存在量に対する社会的敗北の影響。 ストレスを受けた動物(STRESS グループ; n = 5)と対照動物(CTRL グループ; n = 5)の間の腸内微生物叢の属レベルでの線形判別分析効果サイズ(LEfSe)(D)およびストレスを受けた動物(STRESS グループ)とストレスを受ける前の動物の間ストレス治療 (STAEX グループ; n = 7) (E)。

我々は、(i) CORT、11DHC、PROG、および DOC のレベルは組織に応じて変化する、(ii) 局所組織のレベルは全身の血漿レベルと常に並行して変化するとは限らない、および (iii) ステロイドプロファイルは次のことを示しました。ストレスを受けたマウスとストレスを受けていないマウスでは異なります。 ストレスを受けた動物では、血漿中の CORT レベルが 26 倍増加するのに対し、局所組織では CORT レベルが 19 ~ 75 倍増加しました。 局所組織にストレスがかかると、PROG および 11DOC レベルは 1 ~ 30 倍高くなりますが、血漿 PROG レベルは 45 倍、11DOC は 27 倍増加しました。 同様の CORT、PROG、および 11DOC の上方制御が、急性ストレスにさらされた思春期前マウスの脳と胸腺で最近観察されましたが、ストレスの刺激効果は成体動物と比較して顕著ではありませんでした 30,31。 11HSD2 のよく知られた代謝物である 11DHC は、ストレスを受けていない動物のほとんどの組織では検出されませんでしたが、ストレスにより 11DHC レベルがそれぞれ 65 倍、40 倍、6 倍に増加した腎臓、結腸、血漿は例外でした。 ストレスを受けていないマウスの脳領域およびリンパ器官における 11DHC の検出不可能なレベルは、脳および胸腺におけるこのステロイドの検出可能なレベルを報告した Hamden ら 18 および Salehzadeh ら 32 のデータと一致しません。 この不一致の理由は不明ですが、使用されるメソッドの感度と直線性の違いがその理由の 1 つである可能性があります。 さらに、ストレスを受けていない対照の結腸および腎臓、すなわち高い 11HSD2 デヒドロゲナーゼ活性を発現し 14 、より高い局所濃度の 11DHC が予想される組織で、測定可能な量の 11DHC が検出されました。 11HSD2 は腎臓や結腸などのミネラルコルチコイド標的組織で主に発現されますが 14、この酵素の mRNA またはタンパク質レベルでの発現は、胸腺、MLN、脾臓などの他の臓器でも実証されていますが、多くの場合、明確な機能的重要性はありません 32,33 、34。 したがって、11HSD2は海馬、皮質、リンパ器官の基礎条件下では不活性であるか、または血液由来の11DHCがこれらの組織で11HSD1によって急速に代謝される可能性があります。 11DHC から CORT を再生する 11HSD1 の高い活性は肝臓で示されましたが、11HSD1 は脳、胸腺、脾臓および MLN でも見つかりました14,16,33。

ストレスは、血漿および組織の CORT レベルをストレスを受けていない対照の値よりも増加させただけでなく、海馬、肝臓、腎臓のレベルも他の組織よりも高かった。 これらの所見は、コルチゾールレベルの組織特異的な差異を示唆しており、これは、MR受容体およびGR受容体への結合による組織内でのコルチゾールの隔離によるものである可能性があり、局所的なステロイド生成および/または11HSDを介したコルチゾールおよび11DHCの代謝によるものである可能性がある。 他の研究者らは、慢性的な社会的敗北にさらされたラットの海馬は皮質よりもコルチコイドのレベルが高く24、海馬のコルチコステロイド受容体の密度が皮質36よりも高いことを示した。しかし、脳のCORT/PROGおよびCORT/11DOC比は大幅に増加している。ストレスを受けたマウスでは、対応する血漿比に変化はなく(図3、オンラインの補足図S2)、およびPROGをCORT37に変換する海馬の能力は、コルチコステロンの局所産生のいくつかの証拠を与えます。 さらに、海馬では 11HSD1 の高発現が報告されています 38,39。 したがって、末梢コルチゾールの 11HSD2 代謝による 11DHC の上昇は、脳コルチゾールの増加にさらに寄与する可能性があります。 11HSDを介したコルチコステロンの再生と不活化を反映するCORT/11DHC比は、ストレスを受けたマウスの血漿と脳では結腸、腎臓、肝臓、MLNよりも有意に高かった。 ストレスを受けた動物の結腸および腎臓における低い CORT/11DHC 比および比較的高い組織 11DHC レベルは、両方の組織が 11HSD1 および 11HSD2 を発現している場合でも、11HSD2 の高い活性と一致します。 11HSD2 が 11HSD114 よりも約 100 倍高い親和性でその基質に結合することを考慮すると、11HSD2 は両方の酵素を共発現する組織におけるコルチコステロイド代謝においてより支配的な役割を果たしている可能性があります。 脳領域および胸腺の一部における CORT/11DHC 比の値が他の組織よりも高く、組織レベルの 11DHC が低いことは、コルチコステロンの局所的な再生または蓄積が異なることを示唆しています。 脳およびリンパ器官は、11HSD2 が存在しないか、その活性がスペースに制限されており、11HSD1 と比較して非常に低い組織です。 これらの組織は、顕著な 11HSD1 活性を示し、リンパ器官 33 と海馬 40 の両方で 11DHC から CORT を再生し 16,33,39 、慢性的な社会的敗北により 11DHC からの CORT の再生を上方制御します。 組織レベルに対する血中ステロイドの寄与を排除することはできないが、Schliamser ら 41 は、脳組織の血液含有量が 0.26 ~ 0.7% の間で変化することを示し、Little ら 42 は、海馬および CORT のレベルが影響を受けることを実証した。大脳皮質は、脳の摘出前の生理食塩水灌流による大きな影響を受けません。

ストレスは高コルチコステロン血症を誘発するだけでなく、副腎からの分泌を介して CORT の直接前駆体である PROG および 11DOC の血漿レベルを上方制御します 4,43,44。 私たちは、ストレスが血漿だけでなく他の組織でもPROGと11DOCのレベルを増加させることを示しました。 ストレスを受けたマウスの脳、特に海馬における高レベルの PROG および 11DOC は、血液からのステロイドの蓄積だけでなく、脳内でのニューロステロイドの新規合成を示している可能性があります 45,46。 急性の水泳ストレスの後、海馬および他の脳領域における PROG および 11DOC のレベルは、我々の結果と同様の方法で増加しました5。 脳と同様に、社会的敗北ストレスにさらされたマウスのリンパ器官でも PROG および 11DOC レベルの増加が観察されました。 ただし、注意すべき点の 1 つは、脳組織とは対照的に、リンパ器官における PROG/11DOC 比は有意に増加しており、減少していなかったということです。 胸腺および一部の免疫細胞は、最終的なグルココルチコイド合成酵素 Cyp11b1 を持たずに新たなステロイド生成に必要な上流酵素を発現し、PREG、PROG、および 11DOC9、10、12、13、48 の生成に関連する酵素活性を示すことが以前に示されています。 さらに、リンパ器官における PROG/11DOC 比は、血漿におけるこの比よりも有意に高かった。 したがって、胸腺およびMLNにおける比率の増加は、適切な受容体への結合、またはコレステロールまたは循環前駆体からの新規の局所PROG合成の上方制御を含む、循環ステロイドのより多くの供給およびリンパ組織におけるそれらの隔離を反映している可能性がある。 ストレスを受けた動物における CORT/PROG および CORT/11DOC 比の上昇は、副腎で新たに合成され血液によってリンパ器官に輸送される CORT、PROG、および 11DOC の隔離の違いだけでなく、11DHC16 からの CORT の再生も反映している可能性があります。 47.

多くの研究は、ストレスが宿主マイクロバイオームの変化と関連していることを示しています。 コルチゾール/コルチコステロンのレベルが高くなると腸の微生物組成が変化する可能性があり、腸内細菌叢は宿主のストレス反応を変化させる可能性があります26、49、50。 我々の結果では、ストレスを受けたマウスとストレスを受けていないマウスの糞便マイクロバイオームのα多様性には有意な差は見られませんでしたが、糞便マイクロバイオームのβ多様性には有意な差が観察されました。 同様に、C57BL/6 および CD-1 マウスを社会的ストレス因子に曝露しても、宿主の腸内細菌叢の α 多様性には影響しませんでしたが、β 多様性は大きく変化しました 49,50。 マウスとは対照的に、ヒトの乳児の研究では、たとえα-多様性がコルチゾールストレス反応と弱い関連性を持っていたとしても、コルチゾールストレス反応とβ-多様性との間に関連性は証明されなかった51。 主要な門と科の相対的な存在量は、すべてのグループ間で比較的類似しており、社会的敗北を喫した C57BL/6 マウスで以前に観察された発見である、群集の構造に直接的な変化がないことが明らかになりました 52。 しかし、LEfSe 分析では、アリスティペス、リケネラ、ルミニクロストリジウム、ローズブリア、ヘリコバクターなど、ストレスに関連するいくつかの細菌属が同定されました。 これらの発見は、心理的ストレスに曝露されたBALB/cマウスのヘリコバクター・ピロリによる胃への定着の促進53、熱ストレスを受けたウサギの糞便マイクロバイオーム内のルミノクロストリジウム54、および格子床に曝露されたBALB/cマウスのアリスチペスによる胃への定着の促進を実証した以前の研究と一致している。慢性的なストレス55、または繰り返しの水没による拘束ストレス56。 同様に、ローズブリアとリケネラは腸内微生物叢のストレスと正の関連性を示しました 25,57,58。 さらに、ストレスを受けたラットでは、コルチコステロンレベルの低下とリケネラ菌の存在量の少なさの間に正の相関関係が観察されました59。 しかし、他の研究では、慢性的な拘束ストレスが門および属レベルで結腸微生物叢に劇的な変化をもたらし、これに伴ってリケネラ属、ロゼブリア属、およびラクノスピラ科のレベルが減少し、プレボテラ属のレベルが増加しました50,60。 社会的ストレスは、CD-1 マウスの腸内細菌叢におけるラクトバチルス属の相対的な存在量を減少させるのに対し 49、BALB/c マウスにおけるラクトバチルス属の相対的な存在量を増加させました (図 5C)。 この結果は、慢性ストレスにさらされたラットにおいて乳酸を含む微生物代謝産物のレベルが増加することを示した Xu らのデータ 61 と相関しています。 これらの観察は、ストレスがマイクロバイオームの多様性に影響を及ぼし、特定の細菌分類群がストレス曝露に関連するバイオマーカーと考えられることを示しています。

結論として、我々は、社会的敗北の動物モデルを使用して、ストレスを受けていない雄マウスおよび慢性的にストレスを受けた雄マウスのいくつかの組織タイプにおけるコルチコステロイドの局所レベルを調査した。 この研究では、血漿だけでなく脳やその他の組織でもコルチゾール、11DHC、PROG、および11DOCレベルがストレスに依存して上方制御されることが実証されました。 しかし、ストレス反応は組織に依存しており、糞便微生物群集を調節していました。 この発見は、コルチコステロイドの血漿レベルが個々の組織の局所レベルを必ずしも表すとは限らず、ストレス中のコルチコステロイドへの曝露が組織依存的に影響を受ける可能性があることを示しています。 しかし、これらの違いがステロイド酵素活性の程度と組織内のステロイドの蓄積(受容体の結合の程度、組織内の血流、組織の取り込み)にどの程度起因するのかという疑問は未解決のままです。

現在の研究中に生成されたデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手可能にするか、GenBank に寄託することができます (配列データ、アクセッション番号 PRJNA896122)。

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著者らは、ストレス期間とサンプル調製に関連する日常活動を支援してくれた、プラハの CAS 生理学研究所の Ivana Muricová に感謝したいと思います。

この研究は、チェコ科学財団助成金 21-10845S (JP) によって支援されました。 チェコ科学アカデミー L200112201 (PPLZ プロジェクト; MV) およびチェコ共和国農業省、制度的サポート MZE-RO0423 (VD)。

チェコ科学アカデミー生理学研究所、ヴィデスカー 1083、142 00、プラハ 4—クルチ、チェコ共和国

カルラ・ヴァグネロヴァ、ピーター・エルガン、マルティン・ヴォディチカ、イジー・パチャ

品質と植物製品、作物研究所、プラハ、チェコ共和国

ミハル・ヤグル & ヴァーツラフ・ドヴォルザーチェク

動物生理学および遺伝学研究所、チェコ科学アカデミー、プラハ、チェコ共和国

チャハラズド・メカディム、ハナ・セホヴコヴァ、カテジナ・オルシャ・フリーゲロヴァ、ヤクブ・ムラゼク

チェコ生命科学大学、農業生物学、食品および天然資源、微生物学、栄養学および栄養学学部、プラハ、チェコ共和国

ハナ・セチョフコバ

カレル大学理学部生理学教室、プラハ、チェコ共和国

イジー・パチャ

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実験の概念化と計画: KV、MV、JP。 データ収集と分析: MJ、CM、PE、HS、KOF、VD; データの分析と解釈: KV、CM、JM、JP; 原稿執筆:KV、CM、JP。 資金調達: JP、MV、VD すべての著者が最終原稿を読んで承認しました。

カルラ・ヴァグネロヴァへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Vagnerová, K.、Jágr, M.、Mekadim, C. 他慢性ストレス時のマウスの血液および局所組織中の副腎皮質ステロイドのプロファイリング。 Sci Rep 13、7278 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34395-2

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受信日: 2023 年 1 月 5 日

受理日: 2023 年 4 月 28 日

公開日: 2023 年 5 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34395-2

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