真菌のリグノセルロースの同定

Communications Biology volume 5、記事番号: 1254 (2022) この記事を引用

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活性ベースのタンパク質プロファイリング (ABPP) は、さまざまな生理学的条件下での酵素活性を研究するための汎用性の高い生化学的方法として出現しており、これまで主に生物医学に応用されています。今回我々は、好熱性でリグノセルロースを分解する白色腐朽菌ファネロカエテ・クリソスポリウムからの生体触媒の発見におけるABPPの可能性を示す。木質基質結合酵素の直接プロファイリングを含む比較ABPPベースの機能スクリーニングを採用することにより、リグノセルロースを分解する炭水化物エステラーゼ（CE1およびCE15）およびグリコシド加水分解酵素（GH3、GH5、GH16、GH17、GH18、GH25、 GH30、GH74、および GH79) 酵素は、基質の存在下で特異的に活性になります。真菌酵素の発現は依然として困難であるため、ABPP を介したアプローチは、最も有望な生体触媒に実験の取り組みを集中させるための事前選択手順となります。さらに、このアプローチでは、未知の機能のドメイン (DUF) の機能アノテーションも可能になる可能性があります。したがって、ここで説明する ABPP ベースの生体触媒スクリーニングにより、対象のプロセスにおける活性酵素の同定と、既知の対応物と配列類似性を持たない新規生体触媒の解明が可能になる可能性があります。

活性ベースのタンパク質プロファイリング (ABPP) は、基礎生物学研究に広く使用されている化学プロテオミクス手法として浮上しています 1、2、3、4、5。 ABPP では、活性ベースのプローブ (ABP) は、反応性「弾頭」、標的タンパク質と不可逆的な共有結合を形成し、多くの場合高い酵素クラス特異性を確保する酵素阻害部分、リンカー、およびレポーターで構成されます。タグは、天然の生理学的条件下で活性酵素を標識、識別、報告するために使用されます。レポーターとして、ビオチン、フルオロフォア、またはアルキンやアジド部分などのいわゆる 2 ステップレポータータグがよく使用されます6。ここ数年、新しい酵素ファミリーをターゲットとした新しい ABP の開発と、とりわけ創薬 (ターゲットおよびリードの発見、ターゲットエンゲージメント) におけるその使用の確立の両方に集中的な取り組みが行われてきました 7,8,9,10,11 、12、植物生物学13、または微生物学14、15、16、17、18。

進化する代替 ABPP アプリケーションは、生体触媒スクリーニング、つまりバイオテクノロジーでの使用です (ここでは、生体触媒を産業利用の可能性のある酵素として定義します)19,20,21。たとえば、ABPP を使用すると、リグノセルロースのような複雑なポリマーバイオマスを再生できる微生物生体触媒、持続可能なエネルギーと循環型生物経済プロセスの文脈で非常に求められている存在を発見することができます 22,23,24。配列相同性に基づく生体触媒スクリーニングアプローチ（例えば、ゲノミクスデータの分析25）とは対照的に、ABPPは、ABPの確立された酵素選択性を利用して、原則として配列相同性を割り当てる必要がなく、望ましい基質優先性を持つ新しい生体触媒を同定します（図2）。 1a)26,27。「ABP ベースの濃縮」と呼ばれるものでは、活性があり、ABP と反応する能力のある酵素のみが、その後の LC-MS/MS ベースのシーケンスによる同定のために選択されます。これにより、ターゲットに応じてタンパク質の同定が制限されます。使用されたABPの特異性。したがって、煩雑になりがちな生化学的タンパク質の発現と精製は、ABPP によって事前に選択された生体触媒のみに限定され、系統的なタンパク質発現に依存するスクリーニング方法と比較すると作業が大幅に軽減されます。これは、例えば木材分解酵素の場合の複雑なグリコシル化パターンの結果として、困難な異種タンパク質の発現と精製によってしばしば妨げられる真菌生体触媒スクリーニングキャンペーンに特に関係がある28,29。これらの本質的な進歩にもかかわらず、ABPP に基づく生体触媒の発見は、主に純粋培養、多くの場合モデル生物、そしてより重要なことに、それらの増殖のための標準的な培地を使用した概念実証研究に適用されてきました 30,31,32,33,34 。

ブナ材チップを含む最少培地で増殖させた P. クリソスポリウム懸濁培養物からリグノセルロース分解酵素を同定するための ABPP ワークフローの概要。 ABP は、凍結乾燥後の P. クリソスポリウムブナ材培養物の濾液 (上清と表示) またはドデシルマルトシド可溶化基質結合画分 (SBF と表示) のいずれかに添加されます。前処理の後には、アフィニティー濃縮のためのビオチン残基のクリック付着 (2 ステップ ABP の場合)、標識酵素のアフィニティー濃縮、トリプシン消化、およびその後の MS ベースのタンパク質同定からなる標準 ABPP ワークフローが続きます。。したがって、酵素クラス特異的 ABP を使用すると、活性生体触媒の標的同定が可能になり、機能的な酵素のスクリーニングが可能になり、既知の相同体との類似性のない新規生体触媒の配列に依存しない同定も可能になります。注入口の画像は、リグノセルロースの分解中に P. クリソスポリウムが無垢材の表面にどのように結合するかを示しています。 b この研究で使用した ABP と競合物質の化学構造。これらは、FP-アルキン (「古典的な」セリン加水分解酵素 ABP) および JJB111 (GH ABP)、ならびに FP の競合製品パラオキソンおよび JJB111 の競合製品 KY371 および KY358 です。 c リグノセルロースは、セルロース、キシラン (ヘミセルロース)、およびリグニンから構成される複雑で難解なポリマーです。その分解には、さまざまな酵素の相乗作用が必要です。

本研究では、この制限を克服し、より複雑でバイオテクノロジーに関連した実験環境で ABPP 生体触媒スクリーニング技術の可能性を示すことを目的としました。したがって、担子菌のセットにおける機能的ABPPアプローチに関する最近の研究と同様に、我々は、最小培地で増殖させた白色腐朽菌ファネロケテ・クリソスポリウムと唯一の炭素源およびエネルギー源としての固体ブナ木材チップからなる懸濁培養物にABPPを適用した35。リグノセルロースは枯れ木の主成分であり、セルロース、キシラン（ヘミセルロース）、およびリグニンから構成される非常に難分解性の高分子複合体を表します（図 1b）36。非食品バイオマスの産業原料へのバイオテクノロジー変換を確立するために、その効率的な分解のための持続可能な方法が緊急に求められています37、38、39。ただし、これには、グリコシドヒドロラーゼ (GH)、炭水化物エステラーゼ (CE)、多糖リアーゼ、および溶解性多糖モノオキシゲナーゼなどの補助酵素クラス (補助活性、AA) に属する他の酵素などのさまざまな生体触媒の相乗作用が必要です ( LPMO）40、41、42。 P. クリソスポリウムは、特に枯れ木とリグノセルロースの効果的な分解剤です43。そのゲノムには、合計 166 の GH、14 の CE、および 57 のグリコシルトランスフェラーゼ (GT) (CAZY データベース (www. cazy.org44)45. この非常に複雑なため、この生物は生体触媒発見の有望な資源に変わります。しかし、その巨大なサイズのため、すべての酵素を系統的に発現させて P. クリソスポリウムセクレトームを探索することはできません。代わりに、それらの酵素のみを事前に選択する方法論が必要です。注目すべきことに、これらの生体触媒の発現はリグノセルロース基質の存在によって制御されており、不溶性木材チップの存在下、つまり非常に不均一な条件下での事前選択アッセイが必要である46。

ABPP ベースの事前選択を介してこの複雑なシステムから有望なリグノセルロース分解酵素を迅速に同定することを目的として、我々は、ABP47、48 を標的とする十分に確立されたセリンヒドロラーゼ (SH) である FP-アルキン、および構造的に関連する 2 つの GHブナ材チップを唯一の炭素源およびエネルギー源として含む最少培地で増殖させたP.クリソスポリウム培養物を、ABPであるKY371（N-アルキニル-シクロフェリトールアジリジン）およびJJB111（KY371のビオチン同等物）49,50を標的としました（図1c）。 FP-アルキンは、よく知られているフルオロホスホネートセリンヒドロラーゼ阻害剤のレポータータグ付き誘導体であるため、この酵素クラス内での特異性はなく、すべてのSH、すなわちセリンプロテアーゼおよび代謝性SHに特異的に結合します51。対照的に、JJB111 は、GH の天然産物阻害剤であるシクロフェリトールのアジリジン類似体です。 JJB111 は構造的に β-グルコピラノシド部分を模倣しているため、保持されている β-グルコシダーゼと優先的に反応します 49。さらに、さまざまな β-エキソグリコシダーゼも標識します 52,53。ヘミセルロースの分解では、SH ファミリーのメンバーであるアセチルキシランエステラーゼは、分解経路全体の最初のステップの 1 つとして、炭水化物/多糖骨格からアセチル基を切断します 54。次に、GH はセルロース、ペクチン、キシランの加水分解を担当します。培養上清中に見出される細胞外可溶性酵素に加えて、我々は木材チップから単離された基質結合酵素にもABPPアプローチを適用しました。したがって、我々の結果は、ABPP により、複雑なリグノセルロース基質上で増殖させた真菌/微生物培養物から直接、これまで注釈が付けられていなかった遺伝子配列 (未知の機能ドメイン (DUF) で構成される) を持つ酵素を含む活性生体触媒の直接的かつ技術的に簡単な標的同定が可能であることを示しています。

P. クリソスポリウムリグノセルロース分解酵素の同定に関するこれまでの研究は、培養上清の「古典的な」完全プロテオーム解析によって行われてきました 55。リグノセルロース分解酵素の迅速な同定におけるABPPの可能性を実証するために、ブナ材チップを含む最少培地でP.クリソスポリウム培養物（DSM 1566）を37℃で5日間増殖させました（図2a）。浸漬液体培養における真菌の菌糸の形成および増殖基質の肉眼で見える分解により、これらの条件下で効率的な真菌細胞の増殖が確認された。培養上清を濾過、凍結乾燥し、バッファーに再溶解し、2 μM の 2 つの ABP FP-アルキンまたは JJB111 でそれぞれ標識しました。競合的 ABPP 実験では、FP-アルキンの場合は 50 μM パラオキソン、JJB111 標識の場合は 20 μM KY358 による前処理を使用しました。アフィニティー濃縮後、オンビーズのトリプシン消化と LC-MS/MS 分析によってターゲットを同定しました。同定された各タンパク質は、スペクトル強度に基づく相対定量を使用して定量化されました。参照として、DMSO または対応する競合他社で処理したサンプルを使用しました。すべての ABPP ベースの標識実験では、log2 倍率変化 (FC) が 2 以上のタンパク質グループのみがさらなる分析のために保持されました。

分析のワークフロー。 P.クリソスポリウム懸濁培養物を、ブナ材チップを補充した最少培地で5日間増殖させた。固体物質を濾去し、濾液を凍結乾燥し、残渣を対応するプローブを用いてABPPに供した。 b クリックケミストリー後の2μM FP-アルキンによる50μMパラオキソンによる前処理なし（左パネル、DMSOと比較してlog2倍変化≧2を示す）または後（競合実験、右パネル）のSHのABPP（生物学的にn = 4）独立したサンプル）。緑色の点は SH を示します。 c 2μM JJB111による前処理なし（左パネル、DMSOと比較してlog2倍変化≧2を示す）または20μM KY358による前処理後（競合実験、右パネル）のGHのABPP（n = 4の生物学的に独立したサンプル）。青い点は GH を示し、赤い点は潜在的な GH 活性を持つ未知の機能の 4 つのドメイン Phchr2|3002168 を持つ DUF タンパク質を表します。

FP-アルキン処理の場合、このアプローチにより、Joint Genome Institute (JGI) タンパク質 ID Phchr2|126075 (CBM1 ドメイン、分子量 35.6 kDa を持つ予測炭水化物エステラーゼファミリー 1 (CE1)) および Phchr2 を持つ 2 つの SH が同定されました。 |2912243 (予測炭水化物エステラーゼファミリー 15 (CE15)、分子量 44.3 kDa) (表 1 および図 2b の緑色で標識されたタンパク質。同定されたタンパク質の完全なリストについては補足データ 1 を参照)。 Phchr2|126075 は、以前に研究された P. クリソスポリウムのアセチルキシランエステラーゼと高い配列類似性を示し、その標識はエステラーゼ阻害剤パラオキソン 56 による前処理によって競合されました。対照的に、Phchr2|2912243 配列分析は、この酵素が CE15 ファミリーのメンバーであること、したがって 4-O-メチル-グルクロノイルメチルエステラーゼである可能性が高いことを示唆しています。

JJB111 の適用により、12 個の GH の同定が可能になりました (表 1 および図 2c の青色で標識されたタンパク質。同定されたタンパク質の完全なリストについては補足データ 2 を参照)。 KY358 による前処理により、GH3、GH5、GH16、および GH74 ファミリーに属する 6 つの標識が競合しました。興味深いことに、セルロース (GH3 および GH5)、キシラン (GH3)、またはキシログルカン (GH74) の分解に関与することが知られている同定された GH とは対照的に、我々の分析では、タンパク質 Phchr2| の有意な濃縮 (log2 倍変化: 5.39) も明らかになりました。 3002168、JGI MycoCosm ゲノムデータベースではグルタミナーゼとして注釈が付けられています 45 (表 1 および図 2c の赤色で標識されたタンパク質)。 Phchr2|3002168 の標識は、KY358 とのプレインキュベーションによって競合され、そのタンパク質配列の PFAM57 および InterProScan58 によるドメイン分析により、分泌シグナルとともに 4 つの DUF ドメイン (DUF4964、DUF5127、DUF4965、および DUF1793) の存在が明らかになりました (補足図) .1a)。しかし、HHpred59 による構造相同性分析では、Thermoanaerobacterium xylolyticum 由来の GH116 ファミリーの β-グルコシダーゼ (pdb コード 5O0S60、e 値 7.2e-34、14% の配列同一性) および Geobacillus Thermoglucosidasius 由来の GH52 キシロシダーゼ (pdb コード 4C1O61、e -値7.1e-31、10％の配列同一性）を相同タンパク質として示します（補足図1b）。さらに、InterProScan による分析により、GH15、GH65、GH92、および GH116 ファミリーメンバーに特徴的な 6 ヘアピングリコシダーゼドメインの存在が示唆されました。 Alphafold62 によって予測された Phchr2|3002168 の 3D 構造は、配列類似性が 12% と低いにもかかわらず、GH52 β-キシロシダーゼ 4C1P ((α/α)6 バレル) と 70% という高い二次構造の重複を示しました (補足図 1c、補足図 1c、 d)。全体として、これらの結果は、Phchr2|3002168 がこれまで特徴づけられていない GH ファミリーの GH である可能性があることを示しています。

私たちのこれまでの研究は、ABPP を使用して真菌培養上清中の活性な SH および GH 酵素を検出できることを示しています。しかし、P. クリソスポリウムによるリグノセルロースの分解には、それぞれの炭水化物ベースの基質に部分的に結合するさまざまな酵素が関与します 63。当然のことながら、これらの基質結合酵素は、リグノセルロースの分解に直接関与するため、バイオテクノロジー応用にとって特に興味深いものです。サンプル調製中に、リグノセルロース基質を濾別して、標識用の均質な出発物質を得た。実際、このような廃棄ステップは、さまざまな機能スクリーニングアプローチで頻繁に実行されており、基質に結合した生体触媒の標的分析のための技術的に単純なアプローチが非常に望まれています。

このような酵素が基質を標的としたABPPアプローチによって検出できるかどうかを調べるために、我々は再びブナ材チップの存在下でP.クリソスポリウムを増殖させた。培養上清と遊離の真菌細胞を除去した後、活性基質結合酵素を 0.1% (w/v) の MS 適合性洗剤ドデシル-β-d-マルトシドで剥離しました。次に、剥離したタンパク質を凍結乾燥し、残渣をバッファーに溶解し、続いて ABP を添加し、標準的な下流 MS サンプルの調製と分析のワークフローを実行しました (図 3a)。

SBF 分析のワークフロー。 P.クリソスポリウム懸濁培養物を、ブナ材チップを補充した最少培地で5日間増殖させた。ブナ材チップを単離し、0.1% (w/v) ドデシルマルトシド処理により基質結合タンパク質を単離しました。得られたタンパク質溶液を凍結乾燥し、残渣を対応するプローブを用いてABPPに供した。 b クリックケミストリー後の50μMパラオキソン（競合実験、右パネル）および2μM FP-アルキンによる前処理なし（左パネル、DMSOと比較してlog2倍変化≧2を示す）または後処理後のSHのABPP（n = 4生物学的に独立）サンプル）。緑色の点は、注釈が付けられた CE を示します。 c 2μM JJB111による前処理なし（左パネル、DMSOと比較してlog2倍変化≧2を示す）または20μM KY371による前処理後（競合実験、右パネル）のGHのABPP（n = 3の生物学的に独立したサンプル）。青い点は注釈付きの GH を示します。

FP-アルキンの使用により、53 個の基質結合タンパク質が同定され、そのうち 17 個は log2 倍変化≧ 2 で濃縮されました。それらの機能注釈により、CE1 および CE15 ファミリーに由来する 4 つの CE の存在が明らかになりました（表 2 および図 3b の緑色で標識されたタンパク質。同定されたタンパク質の完全なリストについては補足データ 3 を参照）。注目すべきことに、CE1ファミリータンパク質Phchr2|2983171およびPhchr2|126075の標識のみがパラオキソンとのプレインキュベーションによって阻害されることに成功した。これらのタンパク質は、アセチルまたはフェルロイルエステラーゼとしての可能性が予測されているため、バイオテクノロジー的に潜在的に興味深いものです。さらに、リグノセルロース分解中の酵素活性化、たとえばセロビオースデヒドロゲナーゼに役割を果たしている可能性がある 5 つのセリンカルボキシペプチダーゼ (S10) と 4 つのカルボキシルエステラーゼが同定されました 64。濃縮されたカルボキシルエステラーゼのうち 3 つの標識は、パラオキソンによってさらに競合されました。

JJB111を使用したABPPアプローチの分析により、log2-FC≧2で濃縮された7つのGHが明らかになりました（図3cの青色で標識されたタンパク質、同定されたタンパク質の完全なリストについては補足データ4を参照）。これらのうち、4 つは KY371 とのプレインキュベーションによって競合されました。タンパク質 Phchr2|3002242、Phchr2|2945552、および Phchr2|3003144 は GH3 ファミリーのメンバーであると予測されていますが、タンパク質 Phchr2|2915237 は GH5 サブファミリー 9 に属します。どちらの GH ファミリーもセルロースまたはキシランの分解を触媒することが知られています。対照的に、タンパク質 Phchr2|3004009 (GH17)、Phchr2|2895579 (GH5)、および Phchr2|3038646 (GH25) の標識は、KY371 によって競合されませんでした。注目すべきことに、同定されたタンパク質のうちの 3 つ (つまり、Phchr2|291537、Phchr2|126075、および Phchr2|2912243) は、上清の ABPP 分析でも同定されました。

全体として、これらの実験は、ABPP が有望なリグノセルロース生体触媒を同定するための技術的に単純な標的アプローチであるだけでなく、関連する活性酵素サブフラクション、たとえば不溶性基質に結合した酵素に焦点を当てて分析できることを示しています。

これまでのところ、我々の ABPP アプローチにより、リグノセルロースを分解する可能性のある生体触媒がいくつか特定されています。その後の機能的注釈は、配列相同性分析によって達成されました。しかしながら、酵素の同定は配列相同性ではなくABP酵素の反応性に基づいているため、ABPPアプローチは原理的には新しい酵素ファミリーの酵素の同定も可能にする可能性がある。私たちのABPPアプローチが実際にリグノセルロース分解生体触媒の同定をもたらしたことを実証するために、さらなる発現とその後の生化学的特徴付けのために、ABPPで同定された酵素のうちの3つ、Phchr2 | 126075、Phchr2 | 2915237、およびPhchr2 | 3002168を選択しました（補足図）２）。

推定上のアセチルキシランエステラーゼ Phchr2|126075 (338 アミノ酸; 35.5 kDa) は、P. クリソスポリウム上清 (log2 倍濃縮 7.18) および SBF (log2 倍濃縮 2.37) 中の FP アルキンで同定されました。 Phchr2|126075 は CE1 ファミリーに属し、炭水化物結合および分泌シグナルのための真菌 CBM1 モチーフを含んでいます。エステラーゼドメインは残基 80 ～ 288 を含みます。注目すべきことに、同じ種に由来する相同なアセチルキシランエステラーゼ (Phchr2|129015、e 値 0.0、89% の配列同一性) が以前に特徴付けられていました 56。特性評価のために、phchr2|126075 を pKLAC2 ベクターにクローン化し、Kluyveromyces lactis で過剰発現させました。配列相同性から予想されるように、Phchr2|126075はpNP-アセテートに対してエステラーゼ活性を示し、その後のアッセイでは、それぞれpH8および40℃で最も高い酵素活性が明らかになりました（補足図3）。その後、さらなる速度論的特徴付けにより、pNP-酢酸加水分解のVmaxが41.7U mg-1タンパク質、KMが0.67mMであることが明らかになりました（図4a）。

Phchr2|126075はK. lactisで異種産生され、pNPアセテートに対する活性は、Vmaxが41.7U mg-1タンパク質およびKMが0.67mMのpNPの放出後に確認された。 b S. misionensis 由来の Phchr2|2915237 および WP_074995790 の基質特異性。異なる p-ニトロフェノールベースの基質での活性は、pNP の放出を測定することによって決定されました。複合多糖に対する活性は、多糖切断時の還元末端の形成を定量化する DNSA アッセイによって測定されました。 Phchr2|2915237 は、pNP-Glc、pNP-Xyl、リケナン、およびブナ材キシランに対して最も高い活性を示しましたが、Phchr2|3002168 の類似ホモログである WP_074995790 は、比活性 0.85 U の基質として pNP-Gal を使用した場合にのみ活性を示しました。 mg-1タンパク質。 c pNP-Glc、pNP-Xyl、リケナン、およびブナ材キシランを基質として使用したPhchr2|2915237の速度論的特徴付け。すべての活性測定は 3 回繰り返して実行され (n = 3)、平均値が示され、エラーバーは標準偏差 (SD) を示します。

Phchr2|2915237 (422 アミノ酸; 46.5 kDa) が同定され、可溶性上清 (log2 倍変化: 10.71) および SBF (log2 倍変化: 4.11) の両方で JJB111 が濃縮されました。 InterProScan による分析では、残基 67 ～ 330 を含む GH5 セルラーゼドメインの存在が示されています。 Phchr2|2915237 にも細胞外分泌シグナルが含まれていますが、膜貫通ドメインは含まれていません。 HHpred59 分析では、β-1-3 グルカナーゼ 65 (e 値: 9.7e-35、配列同一性 44%) または β-1-4-キシログルカナーゼ 66 (e 値: 8.8e-24、配列同一性 18%) のいずれかを予測します。最も近い構造相同体として。さらに、Phchr2|2915237 の相同体は、BLASTP67 によって同定された Trametes や Pleurotus などのさまざまな木材分解菌種に存在します。 Phchr2|2915237 の最も特徴が近い相同体 (e 値: 9e-108、配列同一性 45%) は酵母 Candida albicans に属し、細胞壁の代謝と再構築に役割を果たしています 68。

我々は、アスペルギルス・オリゼでPhchr2|2915237を異種発現させ、精製後のさまざまな発色性p-ニトロフェノール-糖複合体およびさまざまな多糖を使用して、その基質特異性を研究しました。 pNP-GlcおよびpNP-Xylを基質として使用した場合、Phchr2|2915237は高いGH活性を示しましたが、pNP-Araのみが残存し、pNP-Man、pNP-GlcNAc、およびpNP-Galでは加水分解活性は観察されませんでした（図4b））。 pNP-Glc 加水分解の場合、最適な pH と最適温度はそれぞれ 5 °C と 60 °C であることが解明されました (補足図 3)。 3,5-ジニトロサリチル酸（DNSA）アッセイにより、Phchr2|2915237もリケナンとブナ材キシランの両方を分解できる一方、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ガラクトマンナン、キシログルカン、カードランは適切な基質ではないことが明らかになりました（図4b）。。より詳細な速度論的特徴付けにより、pNP-グルコピラノシドおよびpNP-キシロピラノシドについて、それぞれ、999 U mg-1 タンパク質のVmaxおよび1.82 mMのKM、ならびにそれぞれ612 U mg-1 タンパク質のVmaxおよび6.98 mMのKMが明らかになった。多糖類の分解については、Vmax 値 107 U mg-1 タンパク質と 5.5 mg mL-1 の KM 値、および Vmax 値 71.6 U mg-1 タンパク質と 13.8 mg mL-1 の KM 値が決定されました。これは、Phchr2|2915237が天然のより複雑な糖ポリマーも切断できることを示しています（図4c）。 Phchr2|2915237 がエキソまたはエンドグルカナーゼ/キシラナーゼとして機能するかどうかを判断するために、薄層クロマトグラフィーを介して Phchr2|2915237 によって生成されたキシランおよびリケナンの加水分解生成物を分析しました。単糖はグルカン鎖から切断されませんでした。代わりに、長さが不明な多糖分解生成物の形成を観察しました（補足図4）。さらに、グルコースデヒドロゲナーゼまたはキシロースデヒドロゲナーゼを使用した共役アッセイでも、それぞれリケナンおよびキシランの加水分解中に、Phchr2|2915237 によるグルコースまたはキシロースの生成が示されませんでした。

Phchr2|3002168 (691 アミノ酸; 74.4 kDa) は、JJB111 によって濃縮された未特徴のタンパク質です。その JJB111 標識は、KY371 による前処理によって競合されました。 4 ドメインタンパク質 Phchr2|3002168 はグルタミナーゼとして注釈が付けられていますが、我々の ABPP アプローチおよび以前に記載した追加の配列分析により、GH 活性の可能性が示唆されました。さらに、P. クリソスポリウムを含むさまざまな真菌種の完全なプロテオーム解析により、それらのいくつかがリグノセルロースの存在下で Phchr2|3002168 相同タンパク質を分泌することが明らかになりました 69。

したがって、私たちは生化学的アッセイによってこのタンパク質の特徴を明らかにしようとしました。しかし、Phchr2|3002168を大腸菌またはA.オリゼで発現および精製するという我々の試みはすべて失敗し、真菌タンパク質の発現対ABPPベースの機能的生体触媒スクリーニングの依然として困難な点が改めて強調された。したがって、GHとしてのPhchr2|3002168の活性を確認するために、他の生物で近い相同体を検索し、Streptomyces misionensisのWP_074995790（e値：0.0; 42％の配列同一性）を有望な候補として発見しました。 WP_074995790 は Phchr2|3002168 と同じ 4 つのドメイン構造を表示しますが、InterPro タンパク質のアノテーションには DUF5127 ドメインがリストされているだけであることに注意してください。

したがって、WP_074995790 (752 アミノ酸; 80.5 kDa) を過剰発現させ、この酵素は生化学的アッセイでは凝集傾向が強いため取り扱いが困難でしたが、この調製物を使用していくつかの酵素アッセイを実行することができました。もともとグルタミナーゼとして割り当てられていたため、対応するグルタミナーゼ酵素アッセイを開始しましたが、グルタミン基質の変換を検出できませんでした。次に、以前に使用した同じセットの pNP ベースの糖基質を Phchr2|2915237 でテストすることにより、GH 活性をスクリーニングしました。満足のいくことに、総比活性 0.85 U mg-1 タンパク質の弱い β-ガラクトシダーゼ活性を検出することができました。しかしながら、試験した他のすべての pNP 基質は加水分解されませんでした (図 4b)。したがって、これらの生化学的アッセイは全体として、WP_074995790 の GH 活性を実証しましたが、観察された全体的に弱い β-ガラクトシダーゼ活性は、他の炭水化物構造、例えば、より複雑なポリマー炭水化物がより優れた基質を表す可能性があることを予測します。

白色腐朽菌は優れた分解能力を示し、植物バイオマス中のリグニンの分解に関与します。したがって、それらはバイオテクノロジーに関連する酵素を同定するためのリソースとしてかなりの関心を集めています56,70。その中でも、P. chrysosporium 種は、生育至適温度が 40 °C とかなり高いため、酵素が熱安定性であることが多いため、生体触媒発見の出発点として特に適していると思われます 71。したがって、リグノセルロース分解生体触媒を同定する目的で、複数のプロテオミクス研究がリグノセルロース基質上での増殖中のセクレトームを調査しているが、同定された生体触媒のほとんどは生化学的に検証されていない46、55、69、72。

ここでは、酵素クラス固有の ABP を使用した ABPP を介してバイオテクノロジーに関連する酵素を同定するための代替アプローチについて説明します。これにより、生物学的プロセス全体に関連する活性酵素のみに焦点を当てて分析を行うことができます。このアプローチは、細胞外可溶性 (上清) 生体触媒を迅速に分析するために使用できます。しかし、より重要なことは、ここで初めて説明したように、基質結合生体触媒、たとえば私たちの場合はブナ材チップの形態の固体リグノセルロースに付着した酵素を同定するためにも使用できることです。 ABPP アプローチは、最も有望な生体触媒の事前選択ステップを表します。これを可溶性酵素または基質に直接結合した酵素に適用することにより、技術的に簡単な機能スクリーニングが可能となり、標的生体触媒の発見においてより広範な用途が見出されると予想されます。さらなるABP、例えば、異なるα/β特異性または異なる糖選択性50を有するGH指向性プローブの使用により、リグノセルロース分解のための追加の酵素を解明することが可能になる。

このアプローチの適用可能性を実証するために、特定された ABPP の「ヒット」のうち 3 つを生化学的に検証しました。 FP-アルキンの 1 つの SH ターゲットと、JJB111 ABPP 標識アプローチの 1 つの GH ターゲットを選択しました。さらに、我々は、配列分析に基づいて炭水化物活性酵素 (CAZyme) として割り当てられていない 1 つの標的酵素、Phchr2|3002168 の細菌ホモログを特徴付けることを選択しました。 FP アルキンにより同定された CE1 ファミリータンパク質 Phchr2|126075 は、特徴付けられたアセチルキシランエステラーゼ 73 と相同であり、pNP アセテートに対する強力な加水分解活性を確認することができました。これは、リグノセルロース上のアセチル基の切断であるヘミセルロース分解の最初のステップにおけるこの酵素のバイオテクノロジー応用の可能性を示唆しています。 Phchr2|2915237 は、キシランとリケナンの両方、および pNP-Glc と pNP-Xyl に対して活性を示し、リケナン鎖またはキシラン鎖からそれぞれグルコースもキシロースも放出しない、無差別で触媒活性の高い多糖切断β-エンドグルカナーゼとして同定されました。。したがって、これは P. クリソスポリウムのリグノセルロースの分解に寄与している可能性が最も高くなります。 Phchr2|2915237 には細胞外輸送のための分泌シグナルが含まれており、GH5 サブファミリー 9 に属すると予測されています。これまでのところ、このサブファミリーの酵素はわずか数種類しか知られておらず、そのほとんどには exo-β-1,3- または exo-β が含まれています。一部の家族では、エンド-1,6-グルカナーゼ活性に加えて-1,4-グルカナーゼ活性も発現します。合計 17 のファミリーメンバーが特徴付けられており、それらはすべて異なる酵母またはアスペルギルス種に属していますが、これまでどの担子菌にもホモログは記載されていません。 Phchr2|2915237 の特徴づけられたホモログは、発生および分化中の形態形成過程で重要な役割を果たすことがわかっています。たとえば、カンジダアルビカンスでは、エキソ-β-1,3-グルカナーゼが細胞壁領域を部分的に加水分解し、新しい細胞壁の挿入を可能にします。材料であり、さらに 1,4 および 1,6 グリコシド結合を切断することもできます 68。 S. pombe では、GH5 サブファミリー 9 タンパク質が β-1,3 および β-1,6 グリコシド結合の両方を加水分解することができました 74,75。しかし、さまざまなホモログが抗真菌酵素として機能すること、または植物細胞壁の分解に関与することも示されています 76,77。興味深いことに、Phchr2|2915237 は、さまざまなキシロ/グルコオリゴ糖の切断を触媒することが示されているエンド-1-4-グルカナーゼとの類似性も示しています66。 P. クリソスポリウムにおける真菌細胞壁の切断に関しては、これまでのところ、主に GH16 および GH55 酵素が細胞壁の形態形成と栄養素の再利用に関与していると考えられています 78。 Phchr2|2915237 の正確な in vivo 機能は不明ですが、P. クリソスポリウムがリグノセルロース上で生育すると、その輸出が誘導されるようであり、その二重のエンドグルカナーゼ/キシラナーゼ活性により、この酵素が植物の分解に関与できるようになるでしょう。細胞壁材料。 Phchr2|2915237 の全体的な高い酵素活性と幅広い基質特異性は、A. オリゼなどの産業関連生産生物における異種発現との適合性と相まって、この酵素を効率的な炭水化物分解のための有望な生体触媒に変えます。最後に、未知または誤って割り当てられた機能のタンパク質にも ABPP が注釈を付ける可能性を示すことができました。 Phchr2|3002168 は、GH プローブ JJB111 で標識することによって同定されました。しかし、我々はこのタンパク質を直接発現できなかったため、代わりに、サトウキビのバガスの形でセルロースを分解することでも知られる細菌である S. misionensis 由来の相同性の高いタンパク質 WP_074995790 を特徴づけました 79。総比活性は低いものの、β-ガラクトシダーゼ活性が確認できました。これは、WP_074995790 が確かに GH 活性を持っている可能性があるが、これまでのところこれらの新規酵素の天然基質を同定できなかったことを示しています。しかし、我々の標識アプローチ、配列分析、および酵素アッセイに基づいて、Phchr2|3002168 または WP_074995790 などの DUF4964、DUF5127、DUF4965、および DUF1793 ドメインを含むタンパク質がグリコシド加水分解酵素として機能する可能性があることが示唆されます。

ただし、この研究で報告されている ABPP アプローチにもいくつかの制限があることに注意する必要があります。 P. クリソスポリウムによって分泌されるタンパク質の組成は培養増殖時間、リグノセルロース系バイオマスの供給源と処理に依存するため、潜在的な ABPP 標的タンパク質の同定は細胞培養条件の影響を受けます。この研究では両方の因子が固定されているため、潜在的な標的の範囲は、これらの条件下で産生および分泌されるタンパク質に限定されます。さらに、優先的に異なる標的特異性を持つ追加の ABP を使用すると、さらなる酵素の同定が可能になる可能性があります。 ABPP 標識は、競合する代謝物の存在または酵素媒介生成によっても低下する可能性があります。最後に、現在、ほとんどの ABBP メソッドでは、ABPP プロファイリング中に少量の非特異的標識が含まれるため、その後のバイオインフォマティクス分析と、発現と精製によるターゲットヒットの検証が必要です。

結論として、我々の ABPP アプローチは、機能的スクリーニングからのデータを配列情報にリンクする難しさという、生体触媒発見における永続的な課題を克服するのに役立つ可能性があります。 ABPP アプローチはこれを短縮し、酵素選択的 ABP プローブの標的となる活性酵素に分析を絞り込むことができます。利用できる ABP が増えるにつれ、異なる ABPP スクリーニングキャンペーンで同定された酵素を組み合わせるだけで、複雑な基質の分解であっても生体触媒アンサンブルを同定できる可能性があります。

酵母抽出物、麦芽抽出物、ソイトーン、溶原性ブロス、TRIS、MES、および最小培地用の塩を含む、大腸菌およびP.クリソスポリウムDSM 1556の培養用の化学薬品は、Carl Roth (ドイツ)から入手しました。成長用のブナ材チップは、J. Rettenmaier Söhne GmbH & Co. KG から入手しました。（ドイツ）。カルボキシメチルセルロース (CMC)、リケナン、マンナン、キシログルカン、およびグルコマンナンは Sigma Aldrich (米国) から購入し、ブナ材キシランは Carl Roth (ドイツ) から購入しました。パラ-ニトロフェノール (pNP)、パラ-ニトロフェニル-β-d-ガラクトピラノシド (pNP-Gal)、パラ-ニトロフェニル-酢酸 (pNP-アセテート)、パラ-ニトロフェニル-β-d-グルコピラノシド (pNP-Glc)、パラ-ニトロフェニル-β-d-キシロピラノシド (pNP-Xyl)、パラ-ニトロフェニル-β-d-マンノース (pNP-Man)、パラ-ニトロフェニル-β-d-アラビノフラノシド (pNP-Ara)、およびパラ-ニトロフェニル-N-アセチル-β-d-グルコサミン (pNP-GlcNAc) は Megazyme (アイルランド) から購入し、n-ドデシル β-d-マルトシド (DDM) は Thermo Scientific (米国) から購入し、ウシ血清アルブミン (BSA) は VWR Chemicals (アメリカ合衆国）。より方法論に特化した試薬の供給元については、対応する手順セクションで報告されています。

P. クリソスポリウム DSM 1556 は DSMZ (ドイツ) から入手しました。長期保存の場合、P. クリソスポリウム DSM 1556 を MYP 寒天プレート (6 g L-1 麦芽エキス、1 g L-1 大豆ペプトン、0.5 g L-1 酵母エキス) 上で 37 °C で 2 日間増殖させました。。その後、細胞を削り取り、滅菌 50% (v/v) グリセロール 100 μL アリコートに再懸濁し、グリセロールストックとして -80 °C で保存しました。固体培養物の増殖のために、1.5% (w/v) MYP 寒天に 20 μL の P. クリソスポリウム DSM 1556 グリセロールストックを接種し、寒天プレート全体が真菌の菌糸で覆われるまで 37 °C で 2 日間増殖させました。その後、2.5 g L-1 K2HPO4、0.02 g L-1 KH2PO4、0.1 g L-1 NaCl、0.02 g L-1 CaCl2、0.1 g L-1 (NH4)2SO4、0.02 g L-1 MgSO4、0.001 を含む最少培地g L-1 FeSO4、および細菌の増殖を阻害するために 100 μg mL-1 のクロラムフェニコールを添加した pH 5 のブナ材チップ 40 g L-1 に、プレートで増殖させた P. クリソスポリウム DSM 1556 を接種しました。懸濁培養物を 5 日間インキュベートしました。一定の振盪下 (180 rpm) 37 °C。細胞増殖は、真菌の菌糸の形成を追跡することと、増殖基質の肉眼的分解によって追跡されました。大腸菌ロゼッタ DE3 は、前培養の標準 LB 培地 (10 g L-1 トリプトン、10 g L-1 NaCl、5 g L-1 酵母エキス) または TB 培地 (22 g L-1 酵母) で増殖しました。酵素の異種過剰発現には、抽出物、12 g L-1 トリプトン、4 mL L-1 グリセロール、0.072 M K2HPO4、0.017 M KH2PO4、pH 7.2)。 Kluyveromyces lactis GG799 は、NEB K. lactis タンパク質発現キット (New England Biolabs, USA) の供給培地または YPGlu 培地 (10 g L-1 酵母抽出物、20 g L-1 ペプトン、2 % グルコース、pH 7) で増殖させました。 ) 異種過剰発現の場合。

５日後、上清を除去し、０．２μｍフィルター（ＦｉｌｔｒｏｐｕｒＳ０．２；Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ドイツ）を通して濾過することにより滅菌した。 MS サンプルを取得するために、50 mL (標識) 培養上清を瞬間凍結し、一晩凍結乾燥し、その後さらなる分析まで -20 °C で保存しました。基質結合タンパク質を単離するために、P. クリソスポリウム DSM 1556 を、最小培地中の 40 g L-1 ブナ材チップ上で、反復ごとに 50 mL の浸漬培養液中で、合計 3 つまたは 4 つの生物学的反復で増殖させました。 5日間の成長時間の後、デカンテーションによってブナ材チップを培養培地および遊離真菌細胞から分離し、残りの木材チップを遠心分離（3000°C）によって50mLの緩衝液（50mM TRIS、pH 8）で3回洗浄しました。 × g、10 分、4 °C) で未結合のタンパク質と細胞をすべて除去します。次に、ペレット化した木材チップを、MS 適合性洗剤 DDM 0.1 % (w/v) を含む 50 mM TRIS pH 8 5 mL 中で 180 rpm で一定に振盪しながら 37 ℃ で 30 分間インキュベートし、結合したすべての基質を可溶化しました。タンパク質。上清と同様に、5 mL の剥離溶液を瞬間冷凍し、一晩凍結乾燥し、その後さらなる分析まで -20 °C で保存しました。

すべてのプローブと競合物質を DMSO に溶解しました。 FP-アルキンおよび JJB111 の酵素標的を同定するために、凍結乾燥タンパク質を 2 mL (上清) または 50 mM Na2PO4 (pH 8.0) (FP-アルキン標識) または 50 mM NaOAc (pH 5.0) のいずれか 100 μL (SBF) に再懸濁しました。 (JJB111 標識)、タンパク質濃度は Roti®-Nanoquant (修正ブラッドフォードアッセイ; Carl Roth、ドイツ) で測定しました。総量 400 μg (上清) または 100 μg (基質結合画分) のタンパク質を、2 μM の指定プローブで標識しました (1 時間、37 °C、激しく振盪)。示された ABP との標識の競合のために、50 μM パラオキソン (FP-アルキン標識) または 20 μM KY358-アシルまたは KY371 (JJB111 標識) を示されたとおりに使用しました (30 分間、37 °C、激しく振盪)。続いて、FP-アルキン標識タンパク質を、10 μM TAMRA-ビオチン-N3 (Jena Bioscience、ドイツ)、100 μM TBTA (Sigma Aldrich、米国)、2 mM TCEP (Sigma Aldrich、米国)、および 1 mM を用いたクリック反応に供しました。 CuSO4 (Sigma Aldrich、米国; 1 時間、室温、暗所)。

アフィニティー濃縮の前に、タンパク質をクリーンアップするために修正メタノール - クロロホルム 80 沈殿を実行しました。簡単に説明すると、タンパク質溶液を4当量のメタノール（-20℃、一晩）とともにインキュベートした後、1当量のクロロホルムおよび3当量のMSグレード水（VWR Chemicals、米国）を添加した。沈殿したタンパク質をメタノールで２回洗浄し、風乾し、最終体積８ｍＬの１×ＰＢＳ中０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（１５５ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に溶解した。 ) 穏やかに振盪しながら (37 °C、30 分)。 ABP 反応タンパク質を濃縮するために、得られたタンパク質溶液を 100 μL のアビジンビーズスラリー (Thermo Scientific、USA) と穏やかに回転させながらインキュベートしました (1 時間、室温)。次に、ビーズを 0.2 % (w/v) SDS で 5 回洗浄し (10 分間、室温、穏やかに回転)、続いて MS グレード H2O で 3 回洗浄し (5 分間、室温、激しく振盪)、収集しました。遠心分離 (400 × g、室温、5 分間) により行います。洗浄したビーズを、50 mM 重炭酸アンモニウム (ABC) 中の 0.8 M 尿素 (GE Healthcare Life Sciences、米国) 100 μL に溶解し、タンパク質を 50 mM ABC 中の 5 mM ジチオスレイトール (DTT、Sigma Aldrich、米国) で還元しました。 (30 分、37 °C、激しく振盪)、続いて 50 mM ABC 中の 10 mM ヨードアセトアミド (IAM) を加えてアルキル化しました (30 分、37 °C、暗所)。アルキル化反応は、DTTを最終濃度10mMまで添加することによってクエンチした。タンパク質消化のために、50 mM 酢酸中の 1 μg トリプシン (Thermo Fisher Scientific、米国) を添加しました (37 °C、16 時間、激しく振盪)。遠心分離 (5 分間、室温、650 × g) によってビーズを収集し、上清を回収し、最終濃度 0.5% (v/v) になるようにギ酸 (FA) と混合しました。ビーズを洗浄するために、40 μL の 1% (v/v) FA を添加し (5 分間、室温、激しく振盪)、上清を回収した消化混合物と合わせました。ペプチド溶液から残りのビーズを除去するために、混合物を自家製の 2 枚のディスクのガラスマイクロファイバー膜 (GE Healthcare、米国、孔径 1.2 μm、厚さ 0.26 mm) StageTip を通して遠心分離しました (5 分間、室温、100 x g)。。次に、記載されているように、透明なペプチド溶液を自家製 C18 StageTips で脱塩しました (使用したプロトコールについては、以下を参照)。

消化および固形物の除去後のすべてのペプチド溶液は、前述のように自家製 C18 StageTips を使用して脱塩されました 81。すべての遠心分離ステップは、400 ～ 800 × g の範囲で、室温で 1 ～ 3 分間実行されました。簡単に説明すると、酸性化されたトリプシン消化物を2枚のディスクのStageTipsに通し、固定化されたペプチドを0.5% (v/v) FAで2回洗浄しました。ペプチドは、0.5% (v/v) FA を含む 80% (v/v) アセトニトリルを用いた 2 段階溶出によって StageTips から溶出しました。 StageTips からの溶出後、真空濃縮器 (エッペンドルフ、ドイツ) を使用してサンプルを乾燥し、ペプチドを 15 μL の 0.1% (v/v) FA に再懸濁しました。このように調製されたサンプルは、LC-MS/MS 実験に直接使用されました (詳細については以下を参照)。

LC-MS/MS 実験は、EASY-nLC 1200 液体クロマトグラフィー (LC) システム (Thermo Fisher Scientific、米国) に接続された Orbitrap Fusion Lumos 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific、米国) で実行されました。 LC は 1 カラムモードで操作され、分析カラムは、社内で Reprosil-Pur 120 が充填された統合型 PicoFrit エミッター (New Objective、米国) を備えた溶融シリカキャピラリー (内径 75 μm × 36 ～ 46 cm) でした。 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch、ドイツ)。分析カラムはカラムオーブン (Sonation、ドイツ) に包まれ、ナノスプレーフレックスイオン源 (Thermo Fisher Scientific、米国) に取り付けられました。データ取得中、カラムオーブンの温度は 50 °C に調整されました。 LC には 2 つの移動相、溶媒 A (0.1% (v/v) FA、水溶液) および溶媒 B (0.1% (v/v) FA、20% (v/v) H2O、アセトニトリル溶液) が装備されていました。すべての溶媒は、UHPLC (超高速液体クロマトグラフィー) グレード (Honeywell、ドイツ) のものでした。ペプチドは、設定圧力限界の 980 bar (通常約 0.5 ～ 0.8 µL min-1) を超えない最大流量で分析カラムに直接ロードされました。続いて、ペプチド溶液を分析カラムで異なる勾配 (長さ 105 分、詳細については、補足ファイルの Sample_Legend_and_LC-MS_Settings、セクション「LC_Settings」を参照) で分離しました。

質量分析計は、Xcalibur ソフトウェア v4.3.7.3.11 を使用して操作されました。質量分析計は陽イオンモードに設定されました。前駆体イオンスキャン (MS1) は、Orbitrap アナライザー (FTMS; 内部ロック質量オプションをオンにしたフーリエ変換質量分析 (ロック質量は 445.120025 m/z、ポリシロキサン)) で実行されました 82。動的排除をオンにしました (n 回後の排除 = 1; 排除期間 (秒) = 120; 質量許容値 = ±10 ppm)。 MS2 プロダクトイオンスペクトルは、+1 より大きい電荷を持つイオンのみから、ITMS (イオントラップ質量分析) でデータに依存した方法で記録されました。個々の実験に関連するすべての個別の MS 設定 (分解能、スキャン速度、スキャン範囲、AGC、イオン取得時間、電荷状態、分離ウィンドウ、フラグメンテーションの種類と詳細、サイクルタイム、実行されたスキャン数、およびその他のさまざまな設定)補足ファイル Sample_Legend_and_LC-MS_Settings の「MS_Settings」セクションにあります)。

RAW スペクトルは、デフォルト設定を使用して MaxQuant83 (バージョン 1.6.10.43) の Andromeda 検索に送信されました。ラベルフリーの定量化と実行間の照合が有効になりました。 MS/MS スペクトルデータは、UniProt P. クリソスポリウム (Phanerochaete_chrysosporium_Uniprot_210114.fasta; 430 エントリ) および Joint Genome Institute P. クリソスポリウム (Phanerochaete_chrysosporium_JGI_210114.fasta)42 (最もフィルタリングされたモデル、13602 エントリ) データベースに対して検索されました。すべての検索には、汚染物質データベース (MaxQuant で実装されている、246 配列) が含まれていました。汚染物質データベースには既知の MS 汚染物質が含まれており、汚染レベルを推定するために組み込まれています。アンドロメダの検索により、メチオニン残基の酸化 (16 Da)、動的修飾としてのタンパク質 N 末端のアセチル化 (42 Da)、およびシステインの静的修飾 (57 Da、IAM によるアルキル化) が可能になりました。酵素特異性は「Trypsin/P」に設定しました。アンドロメダ探索の機器タイプは Orbitrap に設定され、前駆体質量許容差は ±20 ppm (最初の探索) および ±4.5 ppm (メイン探索) に設定されました。 MS/MS 一致許容値は ±0.5 Da に設定されました。ペプチドスペクトルは FDR と一致し、タンパク質の FDR は 0.01 に設定されました (ターゲットデコイアプローチに基づく)。最小のペプチド長は 7 アミノ酸でした。タンパク質の定量化では、ユニークなペプチドやカミソリペプチドが許可されました。動的修飾を伴う修飾ペプチドの定量が可能になりました。修飾ペプチドの最小スコアは 40 でした。実行間の一致は、0.7 分の一致時間ウィンドウと 0.05 分の一致イオン移動度ウィンドウで有効になりました 84。 MaxQuant 出力のさらなるデータ分析とフィルタリングは、Perseus v1.6.2.3.85 で実行されました。ラベルフリー定量 (LFQ) 強度は、proteinGroups.txt ファイルと潜在的な汚染物質、および逆データベースからのヒットからマトリックスに読み込まれ、修飾部位を持つペプチドによってのみ識別されるヒットは削除されました。関連する生物学的複製をカテゴリ別グループにまとめて、さまざまな処理または培地を比較できるようにしました。データは log2 スケールに変換され、それぞれ 3 回中 2 回または 4 回中 3 回の反復で見つかったタンパク質のみが個別に調査されました。定量化の前に、欠損値が正規分布 (幅 0.3、ダウンシフト 1.8) から代入されました。

標識実験では、FP-アルキンまたは JJB111 によるタンパク質グループの log2 倍濃縮は、DMSO 対照と比較した両側スチューデント t 検定 (順列ベースの FDR: 0.05、s = 0.1、250 のランダム化) に基づいて計算されました。。 log2 倍変化が 2 を超えるタンパク質は有意に濃縮されているとみなされ、倍数変化が正のすべてのタンパク質がその数値順序に対してプロットされました。タンパク質濃縮に対する競合前処理の影響を調べるために、両側スチューデント t 検定 (順列ベースの FDR: 0.05、s = 0.1、250 ランダム化) を実行して、非競合プローブと前処理プローブ間のタンパク質存在量の差を計算しました。ラベル付けされたサンプルと倍率変化の統計的有意性。それぞれのプローブで標識された非競合サンプルと比較した、対応する競合他社とプレインキュベートされたサンプルの log2 倍の変化が、-log p 値に対してプロットされました。存在量が >75% 減少し、ap 値 < 0.01 のタンパク質は一次ヒットとみなされ、一方、p 値 < 0.05 のタンパク質は二次ヒットとして報告されました。タンパク質 ID は、JGI ID または Uniprot ID として報告されました。

P. クリソスポリウム DSM 1556 からの cDNA の合成では、懸濁培養物をブナ材チップを含む最少培地で 5 日間増殖させました。その後、細胞をデカンテーションによってブナ材チップから分離し、遠心分離（6000×g、4℃、30分）によって収集し、5 mLの緩衝液（10 mM TRIS、pH 8）に再懸濁しました。次に、約 500 μL の細胞を 0.1/0.5 mm バッシングビーズバイアル (Zymo Research、米国) に移し、ビーズビーター (Precellys 24、VWR、米国) で溶解しました。その後、遠心分離 (16,000 xg、2 分) によって細胞破片を除去し、Monarch total RNA 単離キット (New England Biolabs, USA) を使用して 300 µL の RNA 溶解バッファーと混合することにより、300 µL の溶解細胞から RNA を単離しました。。 RNAの単離後、SMARTer PCR cDNA合成キット(Takara Bio Europe, France)を使用して、P.クリソスポリウムDSM 1556のcDNAライブラリーを合成した。 cDNA は -20 °C で保存され、標的遺伝子の増幅と配列決定に使用されました。 P. クリソスポリウム遺伝子 phchr2|126075 は、Q5® ポリメラーゼ (New England Biolabs、米国) および次の遺伝子特異的プライマー (Eurofins Genomics、ドイツ) 5'-ATGAGGTTGACATGTCCC-3' および 5'-ACCTCCAATTCCTCGG を使用して、cDNA からイントロンなしで増幅されました。 -3分。次に、得られた PCR 産物を、以下のプライマーを使用して、pKLAC2 ベクターの追加の特異的制限部位を含む phchr2|126075 を増幅するためのテンプレートとして使用しました: 5'-GAGGAGCATATGATGAGGTTGACATGTCCC-3' および 5'-GAGGAGCTCGAGACCTCCAATTCCTCGG-3' (NdeI および XhoI)制限部位に下線を付した）。その後、Wizard® SV Gel および PCR クリーンアップキット (Promega、米国) を使用して PCR 産物を精製しました。精製したPCR産物および空ベクターをそれぞれの制限酵素(NEB、米国)で制限消化した後、Phchr2|126075をpKLac2ベクター(Novagen、米国)にクローン化した。制限された PCR 産物とベクターを 1:4 のモル比で、T4 DNA リガーゼ (New England Biolabs, USA) を使用して 16 °C で一晩ライゲーションに使用しました。得られた構築物を用いて大腸菌DH5α細胞(Novagene, USA)を形質転換し、上記の遺伝子特異的プライマーを用いた配列決定により、クローン化に成功した遺伝子の存在を確認した。次いで、製造業者（New England Biolabs、USA）の指示に従って、pKLAC2:phchr2|126075をK. lactis GG799に形質転換した。 phchr2|126075 が正しく組み込まれたことは、付属の組み込みプライマーを使用した PCR によって確認されました。形質転換したクローンを２ｍＬのＹＰＧｌｕ培地に接種して、Ｐｈｃｈｒ２｜１２６０７５の分泌を試験した。発現クローンを単離し、250 μL の滅菌 20% (v/v) グリセロールに再懸濁し、さらに使用するために -80 °C で保存しました。大腸菌ロゼッタ DE3 における P. クリソスポリウム由来の phchr2|3002168 およびストレプトミセスミシオネンシス由来の WP_074995790 の発現のために、両遺伝子のコード配列は、pET20b ベクター (C 末端を持つ) にクローニングするための分泌シグナルなしで BioCat (ドイツ) によって合成されました。彼のタグ）。異種過剰発現のために、大腸菌ロゼッタ DE3 を対応するプラスミドで新たに形質転換しました。

Phchr2|126075の組換え産生は、K. lactis GG799 (New England Biolabs, USA)において行われた。形質転換後、培養上清を遠心分離 (4000 × g、30 分、4 °C) によって収集し、pNP-アセテートに対して最も高い活性を持つクローンをスクリーニングしました (培養容量 50 mL)。この目的のために、100 μL の上清を 100 μL の 50 mM TRIS pH 8 および 400 μM pNP-アセテートとともにインキュベートし、96 ウェルプレート (BRANDplates®、BRAND) で p-NP の放出を 410 nm で測定しました。、ドイツ）ＴｅｃａｎｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００プレートリーダー（ＴｅｃａｎＴｒａｄｉｎｇＡＧ、スイス）を使用した。タンパク質発現のために、50 mL の培養物に 1% (v/v) の前培養物を接種し、30 °C で 3 日間インキュベートしました。その後、細胞を遠心分離し (4000 × g、30 分、4 °C)、上清を 0.45 μm フィルター (Rotilabo® シリンジフィルター、Carl Roth、ドイツ) に通した後、Phchr2|126075 のエステラーゼ活性の測定に使用しました。。

WP_074995790 の生産では、150 μg mL-1 アンピシリンおよび 50 μg mL-1 クロラムフェニコールを添加したテリフィックブロス (TB) 培地 (500 mL) で新たに接種した大腸菌ロゼッタ DE3 [pET20b::WP_074995790] を培養しました。一定の振とう（180 rpm）下、37 °C で OD600 が 0.8 になるまで増殖させます。タンパク質発現は、1 mM イソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド (IPTG) の添加によって誘導されました。次に細胞を 18 °C でさらに 16 時間インキュベートし、遠心分離 (6000 × g、20 分、4 °C) によって収集し、10 mL のバッファー A (50 mM TRIS-HCl pH 7.8、200 mM KCl) に再懸濁しました。、湿重量１グラムあたり１０ｍＭイミダゾール）。細胞溶解は、UP 200 S ソニケーター (Hielscher Ultrasonics GmbH、ドイツ) を使用し、一定の冷却下で 3 × 7 分間 (50% 振幅、0.5 s-1) 超音波処理し、その後遠心分離 (14,000 × g、60 分、4°) することによって実行されました。 C)。 WP_074995790 をさらに精製するために、透明なライセートを 0.45 µm フィルター (Rotilabo® シリンジフィルター、Carl Roth、ドイツ) に通し、バッファー A で平衡化した 5 mL Ni-IDA カラム (Cytiva、米国) に一定の流速でアプライしました。 5 mL min−1 の流量。緩衝液Ａ（２０カラム容量）で洗浄した後、緩衝液Ｂ（５０ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．８、２００ｍＭＫＣｌ、４００ｍＭイミダゾール）の直線勾配で溶出を行った。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心濾過装置（５０ｋＤａカットオフ、メルク、ドイツ）を使用して、濃縮と希釈を繰り返すことにより、溶出緩衝液を保存緩衝液（５０ｍＭＴＲＩＳｐＨ８．０、２０ｍＭＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）と交換した。保存のために、タンパク質は液体窒素中で急速冷凍され、-80 °C で保存されました。

Phchr2|2915237 をコードする合成遺伝子は、IDTdna (USA) から gBlock として注文され、Aspergillus oryzae のゲノムに組み込まれ、他の場所で説明されているように細胞外酵素として発現されました 86。下流の精製を容易にするために、C 末端 His タグ (6xHis) が追加されました。発酵ブロスを滅菌濾過し、５００ｍＭＮａＣｌを添加し、ＮａＯＨの添加によりｐＨ７．５に調整した。サンプルを、500 mM NaClを含む50 mM HEPES、pH 7.5（緩衝液A）中で平衡化したNi-Sepharose™ 6 Fast Flowカラム（GE Healthcare、米国）にロードしました。ローディング後、カラムを 10 カラム容量のバッファー A で洗浄し、結合タンパク質をバッファー A 中の 500 mM イミダゾールで溶出しました。酵素を含む画分をプールし、Sephadex™ G-25 (培地) (GE Healthcare) にアプライしました。、米国）カラムを平衡化し、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５で溶出した。画分をSDS-PAGEで分析し、酵素を含む画分を合わせた。

エステラーゼ活性は、不連続または連続アッセイのいずれかにおいて、pNP-アセテートからのpNPの放出を410 nmで測定することによって確認した。 Phchr2|126075 の至適 pH を確認するために、1.08 μg のタンパク質を 50 mM リン酸クエン酸緩衝液中、pH 5.5 ～ 8 の範囲で 25 mM の pNP-アセテートを加え、総量 500 μL で 35 °C で 10 分間インキュベートしました。。その後、500 μL の 0.5 M 炭酸ナトリウムを添加して反応を停止し、サンプルの吸収を 410 nm で測定しました。次いで、ｐＮＰ８７について確立された吸光係数１６．１ｍＭ−１ｃｍ−１を使用して、ｐＮＰの生成を計算した。至適温度を決定するために、Phchr2|126075 を 50 mM TRIS pH 8、20 mM KCl 中でインキュベートし、pNP アセテートからの pNP の放出を、総量 500 μL で 30 ～ 70 °C の温度範囲で連続的に測定しました。。速度定数を決定するために、Phchr2|126075を、50 mM TRIS pH 8および20 mM KClを含む水溶液中、異なる濃度のpNP-アセテートとともに40℃でインキュベートした。各反応の初速度が取得され、活性の計算に使用されました。すべての酵素アッセイは 3 回繰り返して実行されました。

Phchr2|2915237 および WP_074995790 の活性は、さまざまな多糖および人工 pNP 複合体に対して確立されました。 Phchr2|2915237 の至適 pH と温度は、0.5 µg の酵素を 200 µM の pNP-Glc または pNP-Gal と 500 µL リン酸クエン酸緩衝液中で 10 分間、pH 範囲 3 ～ 8、30 °C でインキュベートすることによって決定されました。または pH 5 でそれぞれ 30 ～ 70 °C の温度範囲。インキュベーション後、500μLの0.5M炭酸ナトリウムを添加することによって反応を停止し、pNP-Glcの切断に続いて、上記のように410nmでpNPの放出を測定した。 pNP 複合体に対する Phchr2|2915237 および WP_074995790 の基質特異性を測定するために、200 μM の pNP-Ara、pNP-GlcNAc、pNP-Gal、および pNP-Man を 10 μg の Phchr2|2915237 または 11.2 μg の WP_074995790 とインキュベートしました。または、200μMのpNP-XylおよびpNP-Glcを、上記のように0.4μgのPhchr2|2915237または11.2μgのWP_074995790とインキュベートした。ニトロフェニル基質に対する反応速度測定は、それぞれ 1、2、5、および 10 分後に反応を停止しながら、異なる濃度の pNP-Glc および pNP-Xyl を 0.5 μg の Phchr2|2915237 とインキュベートすることにより、不連続アッセイで実施しました。その後、反応の初速度を使用して、ニトロフェノール基質に対する Phchr2|2915237 の比活性を計算しました。

キシログルカン、ガラクトマンナン、カードラン、CMC、キシラン、およびリケナンに対する Phchr2|2915237 の基質特異性を測定するために、1 μg の酵素を 500 μL のクエン酸リン酸緩衝液中で 0.5 % (w/v) のそれぞれの多糖類とインキュベートしました。 pH 5 で 1、2、5、10 分間。その後、DNSA 溶液 500 μL (10 g L-1 DNSA、0.05 g L-1 亜硫酸ナトリウム 2 mL L-1、200 g L-1 酒石酸ナトリウムカリウム、および 10 g L-1 NaOH) を加え、その後、100℃で15分間インキュベートしました。次に、サンプルを氷上で 15 分間冷却し、遠心分離（10,000 xg、4 °C、30 分間）した後、上清 250 μL を 96 ウェルプレート（BRANDplates®、BRAND、ドイツ）に移しました。還元糖の放出を、ＴｅｃａｎｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００プレートリーダー（ＴｅｃａｎＴｒａｄｉｎｇＡＧ、スイス）を使用して５７５ｎｍで追跡し、ｄ－グルコースに基づく検量線を使用して決定した。非生物的基質の分解およびタンパク質溶液の添加によるバックグラウンド吸収を測定し、サンプルの吸収から差し引いた。グルタミナーゼ活性は、前述したように l-ガンマ-グルタミル-pNP を使用するか 89、NAD+ の還元を介してグルタミン酸デヒドロゲナーゼ (Merck、ドイツ) によるグルタミンからのグルタミン酸の形成をモニタリングすることによってテストされました。多糖類の分解中のグルコースまたはキシロースの形成を確認するために、サンプルを上記のように 4 時間インキュベートしました。その後、サンプルを 10,000 xg、4 °C で 30 分間遠心分離し、200 μl の上清を 2 U のグルコースデヒドロゲナーゼ (Sigma Aldrich、米国) またはキシロースデヒドロゲナーゼ (Megazyme、アイルランド) および 5 mM の NAD+ とインキュベートしました。次に、NAD+ から NADH への還元を測定することによって、グルコースとキシロースの形成を 50 mM TRIS pH 8 中で測定しました。すべての酵素アッセイは 3 回繰り返して実行されました。

0.5 % (w/v) リケナンまたはブナ材キシランを用いた酵素反応は、10 μg の Phchr2|2915237 を用いた DNSA アッセイに使用したのと同じ条件下で実行されました。リケナンおよびキシランを上記のように Phchr2|2915237 とインキュベートし、1、2、および 4 時間後にサンプルを取り出しました。その後、加水分解生成物および対照溶液 2.5 μl をアルミニウムシートシリカゲル 60/珪藻土 F254 プレート ((20 cm × 20 cm、Merck、ドイツ) に塗布し、室温で酢酸エチル、メタノールおよび H2O (68:プレートを乾燥させ、プレートを KMnO4 染色溶液 (200 mL H2O 中の 1.5 g KMnO4、10 g K2CO3、および 10% NaOH 水溶液 1.25 mL) で処理することによって生成物を視覚化しました。）そして室温で30分間インキュベートします。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

消化の質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD030618 とともに PRIDE90 パートナーリポジトリ (https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/) 経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。この研究中に生成されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。グラフとチャートの基礎となるすべてのソースデータは補足データ 5 にあります。現在の研究中に生成された生のデータセットは、リクエストに応じて入手できます。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04290-z

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Mercur Mercator Research Center Ruhr (Pr-2017-0020、DB、BS、MK 宛) および DFG (INST 20876/322-1、MK および FK 宛) からの資金提供に深く感謝いたします。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセスの資金調達。

ジェロニモ・ハイルマン

現在の住所: ドイツ糖尿病センター (DDZ)、ハインリッヒハイネ大学デュッセルドルフライプニッツ糖尿病研究センター、デュッセルドルフ、ドイツ

Christian Schmerling、Leonard Sewald、Geronimo Heilmann などの著者も同様に貢献しました。

分子酵素技術および生化学 (MEB)、環境微生物学およびバイオテクノロジー (EMB)、水および環境研究センター (CWE)、化学学部、デュイスブルク - エッセン大学、Universitätsstraße 5、45141、エッセン、ドイツ

クリスチャン・シュマーリング、クリストファー・ブレーゼン、ベッティーナ・シーバース

デュイスブルクエッセン大学生物学部ケミカルバイオロジー学科 ZMB、Universitätsstraße 2、45117、エッセン、ドイツ

レナード・ゼヴァルト、ジェロニモ・ハイルマン、ファルヌシュ・カシャーニ、マルクス・カイザー

植物と菌類の進化、ルール大学ボーフム、Universitätsstraße 150、44780、ボーフム、ドイツ

フレデリック・ヴィトフェルド & ドミニク・ベゲロウ

Novozymes、Biologiens vej 2、2800 Kgs、リンビー、デンマーク

ケネス・ジェンセン

分析コア施設エッセン、ZMB、デュイスブルクエッセン大学生物学学部、Universitätsstraße 2、45117、エッセン、ドイツ

ファルヌシュ・カシャーニ

生物有機合成学部、ライデン化学研究所、ライデン大学、Einsteinweg 55、2333 CC、ライデン、オランダ

ハーマン・S・生存

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CB、DB、BS、MK が研究を考案し、設計しました。 CS、LS、GH、KJ、および FW は、すべてのケミカルバイオロジー実験を実行し、分析しました。 CS と KJ は成長研究とタンパク質発現を実施しました。 CS は酵素の特性評価を実施しました。 HSO はアクティビティベースのプローブを提供しました。 LS、CS、GH、FK は質量分析と関連データ分析を実行しました。 CS、LS、BS、MK が原稿を書きました。

ベッティーナ・シーバースまたはマルクス・カイザーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Jean-Guy Berrin と他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Calvin Henard と Christina Karlsson Rosenthal。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Schmerling, C.、Sewald, L.、Heilmann, G. 他。活性ベースのタンパク質プロファイリングによる、Phanerochaete chrysosporium によって分泌される真菌のリグノセルロース分解生体触媒の同定。 Commun Biol 5、1254 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

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受信日: 2022 年 2 月 21 日

受理日: 2022 年 10 月 20 日

公開日: 2022 年 11 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

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