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Nature Communications volume 14、記事番号: 512 (2023) この記事を引用

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人間の腸内細菌叢は、血液中を循環し、医薬品と同等のレベルまで蓄積し、宿主の生理機能に影響を与える数十の小分子を生成します。これらの代謝産物は人間の健康や病気にとって重要であるにもかかわらず、微生物によって生成されるほとんどの分子の起源と宿主内でのそれらの運命はほとんど不明のままです。今回我々は、哺乳類の尿中に最も豊富に含まれる有機酸の一つである馬尿酸を生成する宿主微生物の共代謝経路を明らかにした。安定同位体の追跡と細菌および宿主の遺伝学を組み合わせて、腸内細菌によるフェニルアラニンのフェニルプロピオン酸への還元を実証します。宿主は、中鎖アシル-CoA デヒドロゲナーゼ (MCAD) を関与させてフェニルプロピオン酸を再酸化します。無菌の雄および雌 MCAD-/- マウスの作製により、非標的メタボロミクスと組み合わせたノトバイオティクスの定着が可能となり、宿主循環において MCAD によって処理される追加の微生物代謝産物を同定することができました。私たちの発見は、豊富で無毒なフェニルアラニン代謝物である馬尿酸の宿主微生物経路を明らかにし、哺乳類が微生物叢由来の代謝物を代謝する新規メカニズムとして MCAD を介した β 酸化を特定するものです。

ヒトの腸内マイクロバイオームは、人間の生物学のさまざまな側面に影響を与える多数の薬物のような小分子を生成します1、2、3、4。これらの分子は、グリカン、タンパク質、アミノ酸などの食餌および宿主由来の分子の代謝を介して腸内で生成されます。微生物叢に依存した代謝産物は、その濃度が最も高い腸内で局所的に生理機能に影響を与えます。しかし、一部は腸壁を通って吸収され、体中を循環し、腸から遠位の器官で宿主の生理機能に影響を与える可能性があります5、6、7、8、9。微生物の代謝産物が宿主に及ぼす影響を文書化した最近の文献が数多く存在するにもかかわらず、これらの分子に関する我々の知識には大きなギャップが存在します。その主な点は、微生物叢によって生成される代謝産物が宿主の代謝とどのように交差するか、および主要な生成物の正体と運命が明確になっていないことです。このような洞察は、宿主の遺伝学が個体内の微生物の代謝産物のスペクトルにどのような影響を与えるかを理解するために不可欠であり、腸内の微生物の機能に関する新しいバイオマーカーを同定することになります。

腸内微生物の代謝産物は宿主の循環に入り、そこで第 I 相代謝（酸化、還元、加水分解による修飾）および第 II 相代謝（グルタチオン、硫酸、グルクロン酸、またはアミノ酸（通常はグリシンまたはグルタミン）との結合）に関与する酵素によって代謝されます。薬物代謝における役割で古典的に知られています。微生物代謝産物の第 I 相および第 II 相代謝産物には以下が含まれます。 (1) インドキシル硫酸 10、11、12、トリプトファンの宿主微生物共代謝物で、腎臓が機能不全になると血漿レベルが上昇し、心血管系後遺症に寄与すると考えられています。末期腎臓病の場合13、14。 (2) 微生物のチロシン分解の硫酸化生成物である p-クレゾール硫酸は、心臓血管および腎臓の損傷と関連しています9、15。 (3) トリメチルアミン N-オキシド。コリンなどのトリメチル含有化合物の宿主微生物共代謝産物であり、その血漿レベルは心血管疾患患者における有害転帰と関連しています7。ヒトの結腸由来の代謝産物の多くは硫酸化およびグルクロン酸抱合反応を受けます 16 が、微生物由来の代謝産物の大部分に代替宿主代謝経路がどの程度寄与しているかはまだ解明されていません。

我々は以前、腸内細菌による芳香族アミノ酸の還元代謝におけるフェニル乳酸デヒドラターゼ（FldABC、図1a）遺伝子クラスターの役割を実証し、これは宿主内を循環する9つの代謝産物を説明しており、その中には微生物の代謝産物であるインドールプロピオン酸（IPA）も含まれる17。腸の透過性を調節するトリプトファン17、18。ここでは、循環に入るfld遺伝子座によって生成される追加の化合物を宿主がどのように代謝するかを理解しようとしました（補足図1）。野生型（wt）マウスの代謝プロファイリングとノトバイオティックコロニー形成を使用して、我々は、fld 遺伝子座が最も濃縮されたヒト尿代謝産物の 1 つである馬尿酸の重要な決定因子であることを発見しました。トランスジェニックマウスを用いたグノトバイオティクス実験により、fld 遺伝子座の産物が宿主内で中鎖アシル-CoA デヒドロゲナーゼ (MCAD) を介して β 酸化を受けることが明らかになりました。私たちの発見は、宿主内を循環する代謝産物に寄与する、これまで評価されていなかった宿主と微生物の共代謝のメカニズムを明らかにしました。

C. sporogenes 遺伝子座と還元的芳香族アミノ酸代謝に関与するコードされた生化学的経路の概略図。 fldC、フェニル乳酸デヒドラターゼサブユニット C. b 無菌スイスウェブスターマウスに、野生型 C. スポロジェンまたはその fldC 変異体のいずれかを単コロニー形成させました。体液を収集し、GC-TOF ショットガンメタボロミクスによって分析しました。 c、e WT（緑色、倍率変化が陽性）またはfldCコロニー形成マウス（赤色、陰性）で有意に濃縮された代謝物。重要な代謝物は色付けされており、Benjamini、Krieger、および Yekutieli の 2 段階線形ステップアップ手順を使用した対応両側 t 検定で、P 値 < 0.05 に調整されています。 d、f WTマウスとfldCコロニー形成マウス間で有意に異なる（c、e）に対応する代謝物。各列は個々のマウスの行で正規化されたピーク強度を表し、サンプリングされた少なくとも 2 つの宿主コンパートメントで有意な代謝物はヒートマップに含まれます。すべての重要な発見は補足データ 2 に報告されています。g 腸内腔におけるフェニルアラニン代謝の酸化および還元経路における代謝産物レベルの fldC 依存性変化および宿主尿中の潜在的に関連する代謝産物。 bのマウスの概略図は参考文献から適応されました。 17.

無菌マウスに野生型（WT）クロストリジウムスポロジェネスまたはそのフェニル乳酸デヒドラターゼ変異体（fldC）のいずれかを単定着させ、ガスクロマトグラフィー飛行時間質量によるメタボロームプロファイリングのために盲腸内容物、糞便、血清、尿を収集しました。分光分析 (GC-TOF-MS) (図 1b、補足データ 1、2)。還元的芳香族アミノ酸代謝における fldC 遺伝子の役割と一致して、fldC が定着したマウスの糞便および盲腸内容物において、(i) アリールプロピオン酸最終生成物の喪失、(ii) ブロックに近い中間体の蓄積が検出されました。 (iii) 酸化経路生成物 (酢酸アリール) の増加 (図 1c、d)。同様に、fldCコロニー形成マウスの血清および尿では、アリールプロピオン酸塩のレベルの減少、アリール乳酸塩の増加、および宿主修飾酸化経路産物であるフェニルアセチルグリシン（化合物4、フェニル酢酸の宿主グリシン複合体）の増加が観察されました（図1e）。、f）。これらの結果は、単一の微生物遺伝子座が腸内腔および宿主循環内のいくつかの芳香族アミノ酸代謝産物の存在量を決定するという我々の以前の発見を裏付けるものである17。

興味深いことに、我々のメタボロミクス分析により、馬尿酸が、WT対fldCコロニー形成マウスの血清および尿において最も高濃度に濃縮された代謝産物の1つであることが特定された(図1e、f、化合物11)。馬尿酸の同定は、次の 3 つの理由から注目に値します。(1) 馬尿酸は、哺乳動物の尿中に最も豊富な有機酸の 1 つであることが長い間知られていました 19、(2) 腸内細菌叢が哺乳動物の尿中に馬尿酸に寄与していることが示されています。宿主 4、20、21 ですが、微生物や経路がそのレベルに影響を与えることはまだ示されていません (3) 一方、食事中の安息香酸塩 22 やトルエン 23 はよく知られた前駆体であり、フェニルアラニン 24 やポリフェノール 19 などの他の食事性化合物は馬尿酸レベルの増加と関連しています。、宿主馬尿酸に対する腸内の微生物のアミノ酸代謝の寄与はこれまで実証されていませんでした。さらに、酸化的フェニルアラニン代謝の最終生成物である心毒性分子であるフェニルアセチルグリシン 8 の量が fldC 定着マウスの尿中に多く存在し、フェニルアラニンの還元的微生物代謝が健康的な代替手段となる可能性があることが示されました。フェニルプロピオン酸はWT定着マウスの糞便および盲腸内容物中に豊富に含まれているが（図1c、d、化合物3）、血清および尿中には検出されないことを考慮すると、微生物によって生成されたフェニルプロピオン酸は次の方法によって馬尿酸に変換できると推論した。ホスト (図 1g)。

馬尿酸生成における fldC 遺伝子クラスターの役割をさらに調査するために、まず WTC. スポロジェンまたは fldC 変異体をマウスに定着させ、安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析によって馬尿酸レベルを分析することで、GC-TOF-MS の結果を検証しました。分光分析 (LC-MS)。これらの実験により、fldC定着マウスの尿馬尿酸レベルは無菌マウスと同様に低いのに対し、WT定着マウスの尿馬尿酸レベルはミリモルレベルであることが明らかになりました（図2a）。次に我々は、経口投与されたフェニルプロピオン酸が尿中馬尿酸の前駆体として機能するかどうかを尋ねた。無菌マウスに安定同位体標識フェニルプロピオン酸（d9-フェニルプロピオン酸）を経口強制投与し、馬尿酸（d5-馬尿酸）への標識の取り込みをモニタリングしました（図2b）。標識馬尿酸は、d9-フェニルプロピオン酸強制経口投与時には検出できませんでした (t = 0)。しかし、標識馬尿酸は 3 時間目と 6 時間目の時点で上昇し、その後 9 時間目で低下し、胃管栄養法の 24 時間後までにレベルは検出されなくなったことに注目しました。このことは、フェニルプロピオン酸が宿主によって馬尿酸に変換されることを示唆しています (図 1)。 2c)。馬尿酸が fldC 遺伝子が関与するフェニルアラニン代謝から生じるという仮説を直接検証するために、今回は標識フェニルアラニン (d5-フェニルアラニン) を使用して、無菌マウスと定着マウスで同様の安定同位体追跡実験を実施しました。無菌マウスでは、標識馬尿酸は検出されず（図２ｅ）、これはフェニルアラニンから馬尿酸を生成する内因性経路が存在しないことを示唆している。ただし、WTコロニー形成マウスの尿中に高レベルの標識馬尿酸が存在することに気づきましたが、fldCコロニー形成マウスではそのレベルは検出できませんでした（図2e）。総合すると、これらの結果は、fld 遺伝子座を必要とする食事性フェニルアラニンから馬尿酸への変換のための新しい宿主微生物共代謝経路を明らかにする。

a 無菌マウス (n = 10)、fldC 定着マウス (n = 4)、または野生型 C. sporogenes 定着マウス (n = 5) から尿を採取し、安定同位体希釈質量を使用して馬尿酸を測定しました。分光分析 (Tukey の事後多重比較による一元配置分散分析、F(2, 16)=60.90)。 b 無菌マウスに d9-フェニルプロピオン酸を強制経口投与し、馬尿酸への環標識の取り込みを定量して、フェニルプロピオン酸が馬尿酸の前駆体であるかどうかを決定しました。 c 無菌マウスに d9-フェニルプロピオン酸を投与すると、尿中に d5-馬尿酸が蓄積します (n = 12 マウス)。 d 無菌マウス (n = 10 マウス)、fldC 定着マウス (n = 5)、または WT 定着マウス (n = 5) に同位体標識フェニルアラニンを経口投与し、尿中の標識馬尿酸を経時的にモニタリングしました。 e 安定同位体希釈質量分析法を使用して、d5-フェニルアラニンの経口投与後 0、3、6、9、または 24 時間後に尿 d5-馬尿酸を測定しました。 a、c、e の場合: ボックスは四分位間距離の中央値を示します。ひげ、最大値と最小値。 (c) では、t = 3 時間の 1 つの外れ値 (55.88 μM d5-馬尿酸) をテストし、GraphPad Prism 8 に実装された Extreme Studentized Deviate メソッドを使用して削除しました。 b、d のマウスの図式は、参考文献から適応されました。 17.

単一定着したノトバイオティックマウスにおける馬尿酸産生のための宿主微生物共代謝経路を同定したので、我々は次にこれらの化合物が従来の微生物叢が定着したマウスに存在するかどうかを調べた。これに対処するために、我々は 3 つの異なる動物施設 (ジャクソン研究所、タコニック、チャールズリバー、図 3a) で従来どおり飼育された同質遺伝子型スイスウェブスターマウスを入手しました。次に、これらのマウスの血漿および尿中の馬尿酸とフェニルプロピオン酸を LC-MS によって定量しました。興味深いことに、馬尿酸レベルが血漿中にマイクロモルレベルで存在するのは、Jackson Labs (ジャクソン) で飼育されたマウスのみであることがわかりました (図 3b)。馬尿酸の前駆体としてのフェニルプロピオン酸の役割と一致して、ジャクソン研究所の従来の方法で飼育されたマウスの血漿中のフェニルプロピオン酸のレベルも著しく高かった（図３ｃ）。馬尿酸は、ジャクソン研究所で飼育されたマウスの尿中で同様に上昇しました（図3d）。腸内微生物叢がこれらの化合物の高レベルの原因であることを確認するために、ジャクソンおよびチャールズリバー研究所のマウスから盲腸内容物を入手し、それらを無菌スイスウェブスターマウスに移植しました（図3e）。これらの実験により、ジャクソン研究所で飼育されたマウスから得られた盲腸内容物のみが、元無菌マウスの血漿中馬尿酸およびフェニルプロピオン酸（図3f、g）および尿中馬尿酸（図3h）の高レベルの表現型を与えたことが明らかになった。ネズミ。これらの結果は、2 つの重要な発見を強調しています。第一に、馬尿酸とその前駆体フェニルプロピオン酸は、従来のマウスの血液中をマイクロモルレベルで循環しているということです。第二に、異なる施設で飼育されたマウス間では馬尿酸レベルに大きなばらつきがあり、微生物叢の変動が循環メタボロームの変化に寄与していることを示唆しています。

a 血漿および尿のサンプルは、Charles River、Jackson、または Taconic Laboratories の Swiss Webster 従来型マウスから入手しました。馬尿酸 (b) およびフェニルプロピオン酸 (c) レベルは、チャールズリバーまたはタコニックと比較して、ジャクソン研究所のマウスで有意に高かった。 d Jackson Laboratories 製の従来型マウスの尿では馬尿酸が上昇していました (クレアチニン濃度に正規化)。 b ～ d の場合: Tukey の事後比較を含む一元配置分散分析、n = 5 マウス/グループ、平均±標準誤差を示す。血漿馬尿酸 F(2,12) = 31.48、血漿 PPA F(2,12) = 60.09、尿馬尿酸 F(2,12) = 20.30。 e Charles River または Jackson Laboratories から入手した従来のスイスウェブスターマウス由来の盲腸内容物を、無菌レシピエントに移植しました。血漿と尿のサンプルが得られました。 GF、無菌。 CONV-Dを従来化。盲腸移植後、血漿馬尿酸 (f) とフェニルプロピオン酸 (g) は、チャールズリバーと比較してジャクソン研究所レシピエントで有意に高かった (対応のない両側 t 検定)。 h 馬尿酸は、ジャクソン研究所のマウスの盲腸内容物を含むマウスの尿中で有意に高かった (両側マン-ホイットニー検定)。 f〜hの場合：n = 4マウス/グループ、平均±標準誤差を示します。 a、eのマウスの概略図は参考文献から適応されました。 17.

馬尿酸の生成に寄与する微生物経路を特定した後、我々は宿主がどのようにしてフェニルプロピオン酸から馬尿酸を生成するかを理解しようと努めました。 fldCコロニー形成マウスで見られるように、フェニルアラニン（酢酸フェニル）の酸化経路産物は宿主によってグリシンと結合し、フェニルアセチルグリシンを生成します（図1f）。しかし、我々は、フェニルアラニンの還元経路生成物であるフェニルプロピオニルグリシンの対応するグリシン複合体を検出できませんでした。我々は、フェニルプロピオン酸がβ酸化を介して宿主によって鎖短縮されて安息香酸が生成され、その後グリシンと結合して馬尿酸（ベンゾイルグリシンとしても知られる）を形成する可能性があると仮説を立てました。この仮説を検証するために、我々は中鎖アシル-CoA デヒドロゲナーゼ (MCAD) ノックアウトマウス (MCAD-/-) 25 を無菌マウスとして再誘導し、ノトバイオティクス定着実験を可能にしました。従来の方法で飼育された MCAD-/- マウスの以前の研究と一致して、我々は、高レベルの血清アシルカルニチン (C6、C8、C10:1、および C10) を特徴とする GF MCAD-/- マウスの特有の生化学的欠陥に注目しました (補足図2a）および24時間の絶食期間後の尿中スベリン酸とヘキサノイルグリシン（補足図2b）。

MCADが馬尿酸産生に関与しているかどうかを調べるために、無菌マウスおよびWT C.スポロジェンスが定着したMCAD-/-マウスおよびMCAD+/+マウスの尿中の馬尿酸レベルを分析しました。これらの実験により、C. sporogenes が定着した MCAD-/- マウスでは、MCAD+/+ マウスと比較して尿中馬尿酸レベルが低下していることが明らかになりました (図 4a)。さらに、MCAD-/- マウスは、馬尿酸濃度の欠陥を補うレベルで尿中にフェニルプロピオニルグリシンを蓄積することを発見しました（図4b）。これらの発見は、MCAD-/- マウスではフェニルプロピオン酸のβ酸化が部分的にブロックされ、微生物のフェニルプロピオン酸をフェニルプロピオニルグリシンとして廃棄するための副経路を促進していることを示唆しています（図4c）。私たちのデータを裏付けるように、以前の研究では、MCAD 欠損症のヒトの尿中にフェニルプロピオニルグリシンが蓄積することが示されています 26。 MCAD-/- マウスにおける残留馬尿酸産生の性質は不明ですが、ペルオキシソームアシル CoA オキシダーゼが関与している可能性があると我々は推測しています 27。

a、b 尿は、無菌 (GF) 状態、または野生型 C. スポロジェン (Cs) によるコロニー形成後の MCAD+/+ または MCAD-/- マウスから採取されました。尿中の馬尿酸 (a) およびフェニルプロピオニルグリシン (b) レベルは、安定同位体希釈質量分析法によって測定され、尿中クレアチニンレベルに正規化されました (n = 4 マウス/GF グループ、n = 7 MCAD+/+ Cs 定着、n = 9) MCAD-/- Cs 定着、対応のない両側スチューデント t 検定）。 c MCADを含むフェニルプロピオン酸の宿主代謝、およびフェニルプロピオン酸をフェニルプロピオニルグリシンに変換する副経路の存在のモデル。 d 無菌マウスに同位体標識フェニルプロピオン酸を経口投与し、尿中の標識フェニルプロピオニルグリシンを経時的に定量しました。 e 安定同位体希釈質量分析法による、GF MCAD-/- または MCAD+/+ マウス (n = 12 マウス/グループ) における d9-フェニルプロピオン酸強制経口投与後の尿中 d9-フェニルプロピオニルグリシンレベル。 a、b、e の場合: ボックスは四分位間距離、ひげの最大値と最小値を含む中央値を示します。 dのマウスの概略図は参考文献から適応されました。 17.

ここに示したデータから、フェニルアラニンは腸内での細菌の変換と宿主の代謝に関与する経路を介して馬尿酸に変換されると提案します（補足図3）。機能的なMCAD遺伝子が存在しない場合、フェニルプロピオン酸はグリシンN-アシルトランスフェラーゼ（GLYAT）による副経路を通って分流され、フェニルプロピオニルグリシンが生成されます（図4c）。これと一致して、d9-フェニルプロピオン酸を強制経口投与されたGF MCAD-/- マウス（図4d）は標識フェニルプロピオニルグリシンを蓄積しますが、機能的MCADを有するGFマウスは蓄積せず（図4e）、代わりにこの分子を馬尿酸にルーティングします（図2c））。

フェニルプロピオン酸の馬尿酸への代謝における MCAD の役割を特徴付けたので、我々は次に、追加の微生物代謝産物が MCAD によって代謝されるかどうかを尋ねました。これに対処するために、GF および C. スポロジェネスが定着した MCAD+/+ および MCAD-/- マウスからの尿に対して非標的メタボロミクスを実行しました (補足データ 3)。微生物の代謝産物に焦点を当てるため、C. sporogenes の定着に依存する化合物（無菌と比較して定着後の上昇）に調査を限定しました。これらの分析から、宿主の遺伝子型に基づいて異なる 29 の LC-MS 特徴が特定され、MCAD-/- マウスの尿中で最も上昇していました（図 5a、補足図 4a）。社内の代謝物データベースと公的に利用可能な MS/MS データベースを検索することにより、4 つの化合物の推定構造同定を導き出すことができ、その後、それを本物の標準との比較によって検証しました (図 5b、補足データ 4)。図 4 に示すフェニルプロピオン酸から馬尿酸への代謝における MCAD の役割と一致して、MCAD-/- マウスの尿中でフェニルプロピオニルグリシンが上昇していることがわかり、安心しました。桂皮酸のグリシン結合体であるシンナモイルグリシンは尿中で減少していました。 MCAD-/- マウスの影響を受けており（補足図4a）、フェニルプロピオン酸のMCAD依存性代謝の中間体である可能性があります（補足図3）。 2 つの追加の代謝物、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸 (4-OH-PPA) とイソカプロイルグリシンの同定は予想外でした。 4-OH-PPAは、C. sporogenesによるチロシン代謝の還元生成物であり、フェニルプロピオン酸代謝と同じ経路によって生成されます（補足図1）。一方、イソカプロイルグリシンは、C. sporogenesのロイシン代謝の最終生成物であるイソカプロン酸に類似しています5 。

a MCAD-/- (陽性倍率変化、赤色) と MCAD+/+ マウス (陰性、灰色) の間で有意に異なる C. sporogenes 定着に依存する尿代謝物。代謝物は有意な場合に色付けされ (q 値 < 0.05)、2 倍を超える変化を示します (Benjamini、Krieger、および Yekutieli の 2 段階線形ステップアップ手順を使用した対応のある t 検定)。名前の付いた代謝物は青色で表示されます。 b a の 4 つの予測代謝産物を検証するためのトータルイオンクロマトグラムおよび MS/MS フラグメンテーションスペクトル。基準は上に示されています。生物学的サンプル、以下の青色。 c C. sporogenesによるチロシンの3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸への変換、およびMCAD-/-で3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニルグリシンを生成する宿主MCADおよびグリシン結合を介した4-ヒドロキシ馬尿酸への予測変換。 d 4-OH-PPA および 4-OH-PPG は MCAD の非存在下で蓄積しますが、4-OH-馬尿酸は MCAD+/+ マウスでより高くなります（4-OH-PPA および 4-OH-馬尿酸：不対の 2 つの-尾付きスチューデント t 検定、4-OH-PPG: 両側マン-ホイットニー)。 e C. sporogenes のロイシン代謝によりイソカプロン酸が生成されます。ホスト内の MCAD アクティビティに基づいて製品を予測します。 f イソカプロイルグリシンは MCAD 欠損マウスに蓄積し、イソカプロン酸が恒常性条件下で宿主の β 酸化を受けることを示します (対応のない両側スチューデント t 検定)。 dおよびfについて：n = 14マウス/GFグループ、n = 11 MCAD+/+ Cs定着マウス、n = 12 MCAD-/- Cs定着マウス。データは 2 つの独立した実験にわたって結合されました。ボックスは四分位間距離の中央値を示し、ひげは最大値と最小値を示します。 g 宿主の循環中にこれまでに実証されている 4 つの化合物は、微生物が生産した代謝産物の標準的な宿主フェーズ I (フラビンモノオキシゲナーゼ) およびフェーズ II (硫酸化、グルタミン、またはグリシン結合) 代謝の産物です。 MCAD による宿主の β 酸化 (赤色) により、馬尿酸と 4-ヒドロキシ馬尿酸、つまり宿主内に豊富に存在する 2 つの化合物が生成されます。

最初の GC-TOF メタボロミクスでは、尿中の 4-ヒドロキシ馬尿酸 (4-OH-馬尿酸) が fldC に依存していることを特定し (補足図 4b)、非ターゲット MCAD-/- メタボロミクス分析と合わせて、次の仮説を立てました。 -OH-PPA は、フェニルプロピオン酸と同様の MCAD 依存性変換を受けます (図 5c)。安定同位体希釈 LC-MS を使用して、胚芽尿中の 4-OH-PPA、4-OH-馬尿酸、および 3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニルグリシン (4-OH-PPG、この研究のために化学合成) を定量しました。 −フリーマウスおよびＣ．スポロジェネスが定着したＭＣＡＤ−／−およびＭＣＡＤ＋／＋マウス。この経路における MCAD の役割と一致して、尿中の 4-OH-馬尿酸は MCAD+/+ マウスで上昇しているのに対し、4-OH-PPA は MCAD-/- マウスで上昇しており、4-OH-PPG は有意な増加傾向にあります。 MCAD-/- マウスにおける（図5d）。これらの結果は、4-OH-PPA がフェニルプロピオン酸と同様の方法で MCAD を介して代謝されるというモデルを裏付けています。 4-OH-PPA（前駆体）と4-OH-PPG（副経路生成物）の両方が定着したMCAD+/+マウスの尿中に検出されるため、MCAD経路は完了まで進行しません（図5d）。これらの結果は、微生物によって生成された 4-OH-PPA が、MCAD を介した宿主の β 酸化の追加の基質であることを特定します。

我々は、微生物のイソカプロン酸も宿主MCADによって代謝される可能性があると予測しました（図5e）。鎖が短くなりグリシンが結合したイソカプロン酸のMCAD生成物であるイソブチリルグリシン（図5e）はブチリルグリシンと共溶出したため、MCADの非存在下で蓄積すると仮定した生成物であるイソカプロイルグリシンを定量しました。我々の予想と一致して、LC-MSによると、イソカプロイルグリシンレベルはMCAD+/+マウスと比較してMCAD-/-マウスで上昇していました（図5f）。フェニルプロピオニルグリイン（図4b）および4-OH-PPG（図5d）とは対照的に、無菌MCAD-/-マウスはかなりのレベルのイソカプロイルグリシンを有しており、内因性宿主経路がこの代謝産物を生成することを示唆している。ただし、イソカプロイルグリシンレベルは、コロニー形成時のMCAD-/-マウスで有意に高く（P <0.0001）、腸内のC.スポロジェンによって供給されるイソカプロン酸がMCAD欠損マウスのイソカプロイルグリシンレベルを上昇させることを示しています（図5f）。これらのデータは、イソカプロン酸が宿主 MCAD によって代謝される細菌代謝の 3 番目の生成物であることを示唆しています。

腸内マイクロバイオームは、食餌および宿主由来の化合物の代謝を通じて、宿主の生化学的在庫を拡大します。今回我々は、特定の微生物経路、fld 遺伝子座によってコードされる芳香族アミノ酸代謝に焦点を当て、哺乳類で最も豊富な尿代謝産物の 1 つである馬尿酸に寄与する宿主微生物共代謝経路を同定しました。私たちの発見は、フェニルアラニンが腸内でフェニルプロピオン酸に変換され、その後宿主に吸収され、グリシンと結合して尿中に排出される前にMCADを介してβ酸化されることを示しています。また、宿主 MCAD が、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸 (デスアミノチロシンとしても知られる) やロイシン代謝の還元経路生成物であるイソカプロン酸など、他の微生物由来の基質の代謝に関与していることもわかりました。まとめると、我々のデータは、腸内細菌叢由来分子の宿主代謝のこれまで未確認のメカニズムとして、MCADを介した宿主β酸化を明らかにしました（図5g）。

微生物叢に依存した宿主代謝産物に作用するいくつかの宿主酵素は、十分に特徴付けられています。これらには、シトクロム P450、フラビンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびモノアミンオキシダーゼが含まれ、化合物に反応性基または極性基を導入し (フェーズ I 代謝)、その後、活性化された代謝産物がグルタチオン、グリシン、硫酸、およびグルクロン酸種と結合します (フェーズ II)。グリシン結合は通常、水溶性を高めて尿中排泄を促進することによる解毒機構であると考えられていますが、より最近では、グリシン結合が神経伝達物質として利用される芳香族アミノ酸などの全身レベルを調節する可能性があることが示唆されています28。しかし、酪酸代謝を除けば、宿主のβ酸化は微生物代謝産物の代謝にとって重要なメカニズムとは考えられていません。フェニルプロピオン酸、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、およびイソカプロン酸が宿主MCADの基質である可能性が高いという我々の同定は、C6〜C1229の長さの範囲の脂肪酸に対する既知の優先性と一致する。我々の発見をさらに裏付けるのは、基質としてフェニルプロピオニル-CoAを用いた精製MCADの活性の実証26と、尿中フェニルプロピオニルグリシンレベルの増加、馬尿酸の減少26、30、およびイソカプロイルグリシンの増加31を特定したMCAD欠損患者における研究である。腸内の代謝活動がこれらの代謝産物の生成に関与していることが示唆されていますが、ノトバイオティクスマウスと細菌遺伝学に関する我々の結果は決定的な証拠を提供しています。我々の結果はまた、腸内細菌との共代謝を介して大量の循環代謝産物を生成する宿主酵素の増大するリストにMCADが関与していることを示唆している。

宿主と微生物の共代謝の分析から浮かび上がった興味深いテーマは、いくつかの微生物の代謝産物がグリシン結合体として排泄されるということです。これはおそらく、アシル-CoA とグリシンを共基質として使用し、アシルグリシンと CoASH を形成するミトコンドリア酵素である宿主グリシン N-アシルトランスフェラーゼ (GLYAT) の活性によるものと考えられます。哺乳類におけるグリシン結合の代謝的理論的根拠は完全には明らかではありませんが、いくつかの仮説が提案されています (参考文献 28 に要約): (1) グリシン結合は安息香酸などの芳香族代謝産物の親油性を変化させ、その毒性を制限します。 (2) GLYAT を介したグリシン結合は、多くの非常に重要な生化学活動に必要な CoASH をリサイクルします。 (3) 過剰な芳香族代謝産物との結合によって生じる宿主のグリシンレベルの低下は、食事の好みに影響を与える分子回路を表している可能性があります。

ヒトの尿中の馬尿酸は微生物由来であると仮定されています 4、16、20、34、35、36 が、その生成に関与する微生物も微生物遺伝子も定義されていません。野生型または fldC 変異体 C. スポロジェンが定着したノトバイオティクスマウスでの我々の結果は、フェニルアラニンの還元代謝が宿主における馬尿酸の主要な供給源であることを示唆しています。しかし、これまでの研究では、馬尿酸は微生物叢に依存しないメカニズム（安息香酸の摂取やトルエンへの曝露など）、またはコーヒーやお茶に含まれるような食事性ポリフェノールやフラボノイドの微生物分解を通じて生じることが示唆されています19。実際、広範な文献により、人間の馬尿酸排泄と、ポリフェノールが豊富であることが知られているお茶、ジュース、果物の摂取が関連付けられています (参考文献 19 で概説)。したがって、個人における馬尿酸の排泄の程度は多因子的であり、非微生物による食事の寄与と、（我々が示したように）フェニルアラニンおよび食事のポリフェノールの微生物の代謝からの寄与を表していると思われる。馬尿酸生成に対するこれらの食事源および微生物源の相対的な寄与を明らかにするには、標識された食品成分を使用した安定同位体追跡が必要になる可能性があります。これらの方針に沿って、同位体標識された食品成分をマウスに与える最近の研究では、食事性タンパク質が全身性馬尿酸の重要な前駆体であり、その寄与率は推定 33% であることが実証されました 37。

微生物の代謝産物の代謝に関与する宿主酵素として MCAD を特定すること以外にも、私たちの研究にはいくつかの重要な意味があります。まず、馬尿酸は遍在し、ヒトの健康への悪影響とは関連していませんが、グリシンのフェニルアセチルグリシン (ヒトではフェニルアセチルグルタミン)酸化的フェニルアラニン代謝の共役生成物は、心疾患のリスク増加と関連しています8。したがって、フェニルプロピオン酸を介したフェニルアラニンの馬尿酸への還元変換は、主に人体に対して無毒であると考えられており、酢酸フェニル生成のための酸化経路に代わる比較的健全な代替手段となります。第二に、高フラックスで機能し、フェニルアラニンを無毒の最終生成物に変換する微生物経路は、血中フェニルアラニンレベルが上昇しているフェニルケトン尿症患者にとって非常に興味深い可能性がある。これらの方針に沿って、以前の研究グループは、腸内でフェニルアラニンを分解するように遺伝子操作された大腸菌が血中のレベルを低下させる可能性があることを示しました。腸内でフェニルアラニンを分解できる天然の腸内細菌を特定することは、遺伝子操作された菌株に代わる方法となります。

この研究は、宿主が腸内微生物叢によって生成されるいくつかの化合物を代謝するための新規な経路として、遍在する哺乳類の代謝経路を提示します。フェニルプロピオン酸、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、イソカプロン酸に加えて、細菌代謝のいくつかの未確認のグリシン共役生成物が機能的 MCAD の非存在下で蓄積します。これは、恒常性条件下では、これらの分子が事前に β 酸化を受けることを示しています。グリシン結合に。したがって、宿主 MCAD は、微生物の代謝産物の代謝に関する、これまで予想されていなかった広範なメカニズムを表しています。

すべての動物実験は、スタンフォード大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実施されました。すべてのマウス実験は、Class Biologically Clean (ウィスコンシン州マディソン) のフレキシブルフィルム無菌増殖アイソレーターまたは実験用アイソレーターを使用した専用のノトバイオティクス施設で行われました。いくつかの短い実験 (1 週間未満) では、ケージレベルの HEPA ろ過を備えた IsoCage P ラックシステム (Tecniplast、Buguggiate、イタリア) を使用しました。動物は 12 時間の明暗サイクルで維持され、標準食 (LabDiet 5K67) と水を自由に与えられました。動物の不妊性は、各隔離者からの代表的な動物の糞便の隔週嫌気性および好気性細胞培養および 16S rRNA 遺伝子座の PCR によって検証されました。最初の非標的メタボロミクスマウス実験は、Taconic Biosciences から入手したノトバイオティックスイスウェブスター無菌マウス (雄、8 ～ 12 週齢、1 グループあたり n = 5) を用いて行われました。追加の実験は、もともとミュータントマウスリソース & 研究センター (MMRRC、カタログ番号 011588-MU) から胚として取得され、National Gnotobiotic に移送された MCAD-/- マウス (B6;129P2-Acadmtm1Uab/Mmmh)25 で行われました。齧歯動物資源センター (NGRRC) では、無菌 C57/BL6 マウスへの胚移植によって再誘導されました。ヘテロ接合性無菌 MCAD+/- マウスをスタンフォードのノトバイオティックマウス施設に移送し、そこでコロニーを拡大し、ホモ接合性 MCAD-/- または MCAD+/+ の同質遺伝子的バックグラウンド繁殖ペアとして繁殖を維持し、後者は対照として機能しました。従来のスイスウェブスターマウスは、Taconic、Jackson Laboratories、および Charles River Laboratories から入手しました。マウスは標準的な餌で飼育され、フレキシブルフィルムアイソレーターで飼育されました。定着状態および/または宿主の遺伝子型を比較する各実験は、性別を一致させた動物を用いて実施されました。雄と雌の両方のマウスを使用しました。特定の実験で使用される動物の性別は、当社のノトバイオティクス施設内での動物の入手可能性によって決定されました。

クロストリジウムスポロジェネス ATCC 15579 を強化クロストリジウム培地 (RCM、10 g/L ペプトン、10 g/L 牛肉エキス、3 g/L 酵母エキス、5 g/L ブドウ糖、5 g/L 塩化ナトリウム、1 g/L) で日常的に培養しました。 L 可溶性デンプン、0.5 g/L システイン塩酸塩、3 g/L 酢酸ナトリウム、0.5 g/L 寒天）、Coy Laboratories の嫌気チャンバー内、5% 水素、10% CO2、85% N2 雰囲気下、37 °C 。 ClosTron 挿入変異を含む C. sporogenes fldC 変異体は以前に生成され 17 、野生型株と同一の条件で培養されました。細菌細胞は、嫌気的に調製された 25% v/v グリセロールストックとして 12 × 32 mm ガラスクリンプトップバイアルに密封され、-80 °C で保存されました。液体培養物を、胃管栄養法の前に、内側にネジ山を備えた滅菌 2 mL クライオバイアルに移しました。 C. スポロジェンスを用いたすべての操作は、嫌気チャンバー内で、少なくとも 48 時間事前に還元した試薬と培地を使用して実行されました。

マウス MCAD 遺伝子型は、MCAD+/+ と MCAD+/- または MCAD-/- を区別するネオマイシンインサートをターゲットとした DNA PCR、および MCAD 転写物を検出する RT-PCR によって確認されました。 Qiagen DNeasy Blood and Tissue キット (カタログ番号 69506) を使用して、耳パンチから DNA を抽出しました。使用したプライマーは、NeoF 5'-CATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3'、NeoR 5'-ATATCACGGGTAGCCAACGCTATG-3'25でした。産物を 3% アガロースゲルで分析したところ、ヘテロ接合遺伝子型およびノックアウト遺伝子型については 289 bp のバンドサイズが予想されましたが、野生型遺伝子型については産物はありませんでした。 Qiagen RNeasy Mini キット (カタログ番号 74104) を使用してテールクリップから RNA を抽出し、Qiagen One Step RT-PCR キット (カタログ番号 210212) を使用して RT-PCR を実行しました。使用したプライマーは、M11588F 5'-ATGTGGCGGCCATTAAGACCAAAG-3'、M11588R 5'-GCTGATTGGCAATGTCTCCAGCAA-3'でした。製品は 3% アガロースゲル上で画像化されました。 MCAD+/+ 動物と MCAD+/- 動物はどちらも単一の 550 bp 産物を持ちますが、MCAD-/- 動物はラダー効果があり、おおよその産物サイズは 700、800、1000 bp 以上です。

無菌スイスウェブスターマウス (雄、8 ～ 12 週齢、各グループ n = 5) に、野生型クロストリジウムスポロジェネス ATCC 15579 またはその fldC 変異株 17 (マウス 1 匹あたり 1 × 107 CFU、200 μL) を定着させました。コロニー形成から４週間後、尿と糞便を採取し、その後マウスを安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取し、盲腸内容物を採取した。メーカーのガイドラインに従って BD マイクロテナー (カタログ番号 365967) を使用して全血から血清を取得し、液体窒素で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。尿、糞便、盲腸内容物を 2 mL スクリューキャップチューブに移し、採取後すぐに液体窒素中で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。サンプルはドライアイスに乗せてカリフォルニア大学デービス校の西海岸メタボロミクスセンターに輸送され、そこで代謝産物が抽出、誘導体化され、ガスクロマトグラフィー飛行時間型質量分析法 (GC-TOF-MS) によって分析されました。

サンプル（血清 30 μL、糞便および盲腸内容物約 20 mg、尿 20 μL）を 4 °C で解凍し、代謝産物を抽出し、誘導体化し、前述の標準プロトコールを使用して GC-MS で分析しました 38。報告されたデータ (補足データ 1) は、治療グループ内のすべての指定された代謝物のピーク高さの合計に正規化された、対応する各定量イオンのピーク高さを表します。

ショットガンメタボロミクスプラットフォームで同定された代謝物は、下流の分析に含まれました。統計的有意性を決定するために、GraphPad Prism v.8.4.1 に実装されている Q = 5% で、Benjamini、Krieger、Yekutieli の 2 段階の線形ステップアップ手順を使用して発見を決定しました。ピーク面積はlog10正規化され、各代謝産物は、各宿主コンパートメントについて合計225回のt検定による一貫したSDを仮定せずに個別に分析されました。

フェニルプロピオン酸安定同位体追跡実験では、無菌マウスに、水に溶解した滅菌濾過した 50 mM 溶液の d9-フェニルプロピオン酸 (C/D/N 同位体カタログ番号 D-5666) 200 μL を強制経口投与しました。 18 ～ 19 ゲージの強制経口投与針 (Popper 7900) を備えた 1 mL ツベルクリン注射器。強制経口投与後 t = 0、3、6、9、24 時間で尿を収集し、LC-MS によって尿中の d5-馬尿酸を定量しました (詳細については、LC-MS 法のセクションを参照)。

フェニルアラニン安定同位体追跡実験では、18-19 ゲージを備えた 1 mL ツベルクリン注射器を使用して、水に溶解した d5-フェニルアラニン (Sigma Cat. # 615870) の滅菌濾過 50 mM 溶液 200 μL をマウスに強制経口投与しました。強制経口投与針（ポッパー 7900）。強制経口投与後 t = 0、3、6、9、24 時間で尿を収集し、LC-MS によって尿中の d5-馬尿酸を定量しました (詳細については、LC-MS 法のセクションを参照)。安定同位体追跡は、標識フェニルアラニンの内因性変換をテストするために、無菌マウスで最初に実行されました。続いて、同じマウスに野生型または fldC 変異体クロストリジウムスポロジェネスを強制経口投与 (200 μL、約 1 × 107 CFU) で定着させ、定着後 1 週間で安定同位体追跡を実施しました。

MCAD-/- マウスは、この研究の目的のために無菌マウスとして再作成されました。 MCAD-/- マウスまたは MCAD+/+ コントロールは、HEPA フィルターを通した空気供給を備えた無菌のノトバイオティクスアイソレーターまたはケージ内で維持されました。安定同位体追跡は上記のように実施した。GF MCAD-/- および MCAD+/+ マウスからの尿を、50 mM d9-フェニルプロピオン酸による強制経口投与の直前およびその後 3、6、9、および 24 時間に無菌条件下で収集した。 7 日後、200 μL の飽和一晩培養物を強制経口投与することにより、マウスに野生型 C. スポロジェンを単定着させました。コロニー形成の1週間後、d9-フェニルプロピオン酸の強制経管栄養法と、0、3、6、9、および24時間での採尿を繰り返した。 C. sporogenes のコロニー形成は段階希釈プレーティングで確認されました。尿中クレアチニン、馬尿酸、標識および非標識フェニルプロピオニルグリシンを LC-MS によって定量しました (詳細については、LC-MS 法のセクションを参照)。

この研究の過程で、私たちの研究室は主にトリプル四重極質量分析計 (Agilent 6470) を使用していましたが、四重極飛行時間型 (Q-TOF) 質量分析計 (Agilent 6545XT) に移行しました。以下に説明するように、代謝物はわずかに異なります。 LC-MS グレードの溶媒は、Fisher Scientific (ペンシルバニア州ピッツバーグ) から購入しました。 d3-クレアチニン、Cambridge Isotope Laboratories (マサチューセッツ州テュークスベリー) から入手。重同位体の自然存在量を補正する試みは行われませんでした。マウスへの投与用に選択した重水素化化合物と内部標準として十分に異なるため、目的の分析物への影響は無視できる程度でした（たとえば、d2-馬尿酸の同位体純度には、< 0.1% 馬尿酸および d5-馬尿酸)。

無菌マウス、WT マウス、fldC 定着マウスの尿中の馬尿酸レベルの確認 (図 2a)、およびスイスウェブスターマウスの d9-フェニルプロピオン酸と d5-フェニルアラニンの安定同位体追跡 (図 2c、 e) では、Agilent 6470 トリプル四重極質量分析計を使用した安定同位体希釈質量分析法を使用しました。非標識馬尿酸は、Fisher Scientific (ペンシルバニア州ピッツバーグ) から購入しました。サンプル調製のために、5 μL の尿を 45 μL の LC-MS グレードの水で希釈し、次に 50 μL の 6% v/v スルホサリチル酸水溶液を加えてタンパク質を沈殿させました。 12,000 × g で 5 分間遠心分離した後、50 μL の上清を新しいチューブに移し、内部標準として 2.5 μM d5-馬尿酸 (Cambridge Isotope Laboratories、Tewksbury、MA) を含む 50% アセトニトリル 75 μL を加えました。 d5-馬尿酸がマウス尿から検出される実験（安定同位体追跡など）では、2,2-d2-馬尿酸（C/D/N同位体、カナダ、ケベック州ポイントクレア）を次のように使用しました。対応する SRM 移行 (180.1→136.1) に続く内部標準。チューブを軽くボルテックスして混合し、その後遠心分離し、シリコンキャップマップを取り付けた 96 ウェルオートサンプラープレートに移し、分析まで 4 °C で保存しました。化合物は、Agilent RRHD 粒径 1.8 µm C18 カラム (2.1 × 50 mm) を備えた Agilent 1290 Infinity II UPLC を使用して分離し、ジェットストリームエレクトロスプレーイオン化源を備えた Agilent 6470 トリプルクワッド質量分析計で検出しました。溶離液 A は水中の 0.1% ギ酸 (v/v) からなり、溶離液 B はアセトニトリル中の 0.1% ギ酸 (v/v) から構成されます。サンプル (5 μL) を冷蔵オートサンプラーを介して移動相に注入し、次の勾配を使用して 0.5 mL min-1 の流速で 40 °C でのクロマトグラフィー分離を達成しました: 0 ～ 1.5 分、10 ～ 12% B; 1.5 ～ 1.75 分、12 ～ 90% B; 1.75 ～ 2.75 分、90% B。 2.75 ～ 3 分、90 ～ 10% B。 3 ～ 4.75 分、10% B。最初の 0.5 分は無駄にされ、馬尿酸の特定の SRM 遷移 (178.1→134.0) と内部標準である d5-馬尿酸 ( 183.1→139.1)、滞留時間 200 ms、フラグメンター電圧 100 V、衝突エネルギー 9 V で測定しました。ピーク面積は内部標準を使用して正規化し、濃度は、本物の標準の希釈系列から作成した検量線との比較によって決定しました。（馬尿酸、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）。エレクトロスプレーイオン化パラメータには、ガス温度 300 °C、ガス流量 6 L/min、シースガス温度 350 °C、シースガス流量 12 L/min、およびキャピラリー電圧 2500 V が含まれます。

MCAD+/+ および MCAD-/- ノトバイオティックマウス尿中の馬尿酸および N-(3-フェニルプロピオニル)グリシン (PPG) の定量には (図 3)、Agilent 6545XT Q-TOF を使用した安定同位体希釈を使用しました。また、動物間の尿溶質を正規化できるように、尿クレアチニンを定量しました。マウス尿サンプル (5 μL) を内部標準 (10 μL、d3-クレアチニンおよび 2,2-d2-馬尿酸、それぞれ 0.5 mM) と混合し、96 ウェル V で LC-MS グレードの水 (15 μL) で希釈しました。 - USA Scientific 製の底板。９０μＬのアセトニトリル／メタノール３：１混合物を添加してタンパク質を沈殿させた。溶液をピペッティングにより 5 回混合し、プレートを 5000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。上清（４０μＬ）を、１６０μＬの水を含む９６ウェルオートサンプラープレートに移し、よく混合し、キャップマットをプレート上に置いた。サンプルは、Waters 1.7 μm 粒径 BEH C18 カラム (2.1 × 100 mm) を備えた Agilent 1290 Infinity II UPLC を使用して LC-MS によって分析され、デュアルジェットストリームエレクトロスプレーイオン化源を備えた Agilent 6545XT Q-TOF を使用して検出されました。拡張ダイナミックレンジ (EDR 1700 m/z) で動作します。溶離液 A は水中の 0.1% 酢酸 (v/v) から構成され、溶離液 B はアセトニトリル中の 0.1% 酢酸 (v/v) から構成されました。サンプル (0.5 μL) を冷蔵オートサンプラーを介して移動相に注入し、次の勾配を使用して 0.4 mL min-1 の流速で 40 °C でのクロマトグラフィー分離を達成しました。 2〜6 分、1〜98% B; 6〜7 分、98% B。 7〜7.5 分、98〜1% B。 7.5〜11分、1% B。クレアチニンの定量は、内部標準としてd3-クレアチニンを使用してESIポジティブモードで実施されました。 d5-馬尿酸およびd5-N-(3-フェニルプロピオニル)グリシンの定量は、内部標準として2,2-d2-馬尿酸を使用してESIネガティブモードで実施されました。エレクトロスプレーイオン化パラメータには、140 V のフラグメンター電圧、300 °C のガス温度、275 °C のシースガス温度、および 4000 V のキャピラリー電圧が含まれます。ピーク面積は、内部標準 (馬尿酸およびフェニルプロピオニルグリシンの場合は d2-馬尿酸) を使用して正規化されました。、クレアチニンの場合は d3-クレアチニン）、濃度は、1× PBS 溶液に添加した本物の標準（クレアチニン、馬尿酸、およびフェニルプロピオニルグリシン、トロントリサーチケミカルズ、ノースヨーク、オンタリオ州、カナダ）の希釈系列から作成した検量線との比較によって決定しました。代理行列として。クレアチニンの校正範囲は 0.029 ～ 30 mM、馬尿酸とフェニルプロピオニルグリシンの校正範囲は 0.020 ～ 20 mM でした。線形校正回帰モデルがクレアチニンと馬尿酸に適用されました。 1/x 加重最小二乗回帰アルゴリズムを使用して、二次回帰モデルをフェニルプロピオニルグリシンに適用しました。 R2 = クレアチニンの場合は 0.996、馬尿酸とフェニルプロピオニルグリシンの場合は 1.000。

d9-フェニルプロピオン酸安定同位体追跡実験では、d9-N-(3-フェニルプロピオニル)グリシンを定量しました。上清 (20 μL) を 96 ウェルオートサンプラープレートで 180 μL 水で希釈したことを除いて、上記のプロトコールに従って尿サンプルを調製および分析しました。尿中の有機酸および関連代謝産物の定量。アジピン酸、スベリン酸、およびヘキサノイルグリシンの定量では、マウス尿サンプル (2.5 μL) を内部標準 (15 μL、d3-クレアチニンおよび d2-イソ吉草酸、それぞれ 0.2 mM) と混合し、LC-MS グレードの水 ( USA Scientific の 96 ウェル V 底プレートに 7.5 μL)。アセトニトリル/メタノール 3:1 混合物 (75 μL) を加えてタンパク質を沈殿させた。溶液をピペッティングにより 5 回混合し、その後プレートを 15,000 × g で 5 分間、室温で遠心分離しました。上清（１０μＬ）を、９０μＬの水を含む９６ウェルオートサンプラープレートに移し、よく混合し、キャップマットをプレート上に置いた。サンプルは、Waters 1.7 μm 粒径 BEH C18 カラム (2.1 × 100 mm) を備えた Agilent 1290 Infinity II UPLC を使用して LC-MS によって分析され、デュアルジェットストリームエレクトロスプレーイオン化源を備えた Agilent 6545XT Q-TOF を使用して検出されました。拡張ダイナミックレンジ (EDR 1700 m/z) で動作します。溶離液 A は 0.1% 酢酸 (v/v) を含む水からなり、溶離液 B は 0.1% 酢酸 (v/v) を含むメタノールから構成されます。サンプル (2 μL) を冷蔵オートサンプラーを介して移動相に注入し、次の勾配を使用して 0.4 mL min-1 の流速で 60 °C でのクロマトグラフィー分離を達成しました。 1-15.5 分、1-45% B; 15.5〜15.6分、45〜99% B; 15.6〜16.9分、99％B、16.9〜17分、99〜1％B。 17〜19 分、1% B。クレアチニンの定量は、内部標準として d3-クレアチニンを使用して ESI ポジティブモードで実施されました。アジピン酸、スベリン酸、およびヘキサノイルグリシンの定量は、内部標準として d2-イソ吉草酸を使用して ESI ネガティブモードで実施されました。エレクトロスプレーイオン化パラメータには、フラグメンター電圧 70 V、ガス温度 250 °C、シースガス温度 250 °C、およびキャピラリー電圧 4000 V が含まれていました。ピーク面積は内部標準を使用して正規化され、濃度は、準備された検量線との比較によって決定されました。本物のスタンダードの希釈シリーズから。校正範囲は、クレアチニンの場合は 0.005 ～ 40 mM、アジピン酸の場合は 0.010 ～ 10 mM、スベリン酸の場合は 0.020 ～ 10 mM、ヘキサノイルグリシンの場合は 0.005 ～ 20 mM です。 1/x 加重最小二乗回帰アルゴリズムを使用して、線形キャリブレーション回帰モデルをアジピン酸とスベリン酸に適用し、二次回帰モデルをクレアチニンとヘキサノイルグリシンに適用しました。アジピン酸、スベリン酸、ヘキサノイルグリシン、およびクレアチニンの場合、R2 = 0.996、0.998、0.999、および 1.000。

盲腸内容物を、さまざまなベンダー (Taconic、Jackson Laboratories、Charles River Laboratories) のスイスウェブスターマウスから採取し、液体窒素中で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。 n = 5 匹のマウスの盲腸内容物を氷上で解凍し、プールし、レシピエントの無菌スイスウェブスターマウスに強制経口投与しました。次いで、LC-MS分析のために尿および血漿サンプルが収集されるまで、マウスをIsocage Pケージラックシステム内の標準的な餌で2週間維持した。

代謝産物は、血漿および尿サンプルから抽出され、3-ニトロフェニルヒドラジンで誘導体化され、以前に記載されているように LC-MS によって分析されました 39。

非標的メタボロミクスは、d5-フェニルアラニンまたは d9-フェニルプロピオン酸の投与前に収集されたマウス尿サンプルに対して実行されました (t = 0 時間)。マウス尿サンプル (2.5 μL) を LC-MS グレードの水 (5 μL) で希釈し、内部標準 (7.5 μL、d3-クレアチニン、1 mM、d9-フェニルプロピオン酸、0.2 mM、2,2-d2-馬尿酸) と混合しました。酸、0.2 mM)、次に参照標準 (d7-グルコース、d3-メチオニン、L-4-ヒドロキシフェニル-d4-アラニン、d5-馬尿酸、d5-トリプトファン、d3-ロイシン、ジ-n) を含む抽出溶媒 60 μL -フタル酸オクチル-3,4,5,6-d4、d19-デカン酸、d15-オクタン酸、d27-テトラデカン酸、2-フルオロフェニルグリシン、d9-カルニチンのメタノール溶液）を加えてタンパク質を沈殿させました。溶液をボルテックスし、プレートを 15,000 × g、4 °C で 5 分間遠心分離しました。上清(60μL)を新しいプレートに移し、それぞれ20μLを60μLのLC-MSグレードの水で希釈した。残りの上清はバックアップとして -80 °C で保存しました。尿サンプルの代わりに LC-MS 水 (2.5 μL) を使用した同じ調製方法を使用して、3 つの手順ブランクが含まれていました。品質管理 (QC) は、LC-MS 対応の各サンプルからプールされました。

サンプル (0.5 μL) を ESI ポジティブモードとネガティブモードの両方で LC-MS/MS 分析に供しました。ネガティブモード法は上の段落で説明したものと同じでした。ポジティブモード法では、水中 0.1% ギ酸 (v/v) からなる溶離液 A とメタノール中 0.1% ギ酸 (v/v) からなる溶離液 B を使用して、同じ勾配およびエレクトロスプレーイオン化パラメーターを適用しました。収集は、0、20、および 40 eV の衝突エネルギーを使用して、全イオンフラグメンテーションモードで実行されました。特徴の特定は、MS-DIAL (バージョン 4.24) を使用して、(a) 当社独自の社内の本物の標準ライブラリ 40 を検索するか、(b) 北米マスデータバンク (MoNA) で入手可能な MSMS スペクトルと比較することによって実行されました。含まれる検索パラメータ: 質量精度: MS1 許容差: 0.005 Da、MS2 許容差: 0.025 Da。ピーク検出最小ピーク高さ: 2000 振幅、質量スライス幅: 0.05 Da。デコンボリューションパラメータ: シグマウィンドウ値: 0.5、MS/MS アバンダンスカットオフ: 5 振幅。同定 MSP ファイル: MoNA データベースからダウンロードされた LC-MS/MS スペクトル、精密質量許容差 (MS1): 0.01 Da、精密質量許容差 (MS2): 0.05 Da。保持時間および精密質量ベースのライブラリー: スタンフォード化合物ライブラリー、保持時間許容差: 0.1 分、精密質量許容差: 0.01 Da。アライメントパラメータ: 参照ファイル: QC01、保持時間許容差: 0.1 分、MS1 許容差: 0.015 Da。ポジティブモードとネガティブモードの両方からのピークは、2,2-d2-馬尿酸の高さで正規化され、縮退特徴除去のために MS-CleanR41 にエクスポートされました。最小ブランク率 0.8、不正確な質量、および 50 ～ 3000 の相対質量欠陥がフィルターとして適用されました。ピアソン相関 ≥ 0.8 を使用してクラスターを計算し、最も強いピークが各クラスターに保持されました。保持時間/正確な質量ライブラリによって注釈が付けられた化合物をターゲット MS/MS スペクトル収集用に選択し、同一性を確認するために参照標準と比較しました (すべてのデータは補足データ 3 に提供されます)。

非標的メタボロミクスを実行した同じサンプルを、非標的分析中に特定された目的の代謝物についてさらに分析しました (補足データ 4)。フェニルプロピオン酸、N-シンナモイルグリシン、フェニルプロピオニルグリシン、4-ヒドロキシ馬尿酸、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、N-(3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル)グリシン、イソカプロイルグリシンの定量は、同じ機器とカラムを使用して実行されました。 ESIネガティブモード時。溶離液 A は 0.1% 酢酸 (v/v) を含む水からなり、溶離液 B は 0.1% 酢酸 (v/v) を含むメタノールから構成されます。サンプル (0.5 μL) を冷蔵オートサンプラーを介して移動相に注入し、次の勾配を使用して 0.3 mL min-1 の流速で 50 °C でのクロマトグラフィー分離を達成しました: 0 ～ 1 分、1% B、1 ～ 9 分、1〜99% B、9〜11 分、99% B、11〜11.5 分、99〜1% B、11.5〜16 分、1% B。エレクトロスプレーイオン化パラメーターには、70 V のフラグメンター電圧、250 のガス温度が含まれます。 °C、シースガス温度 250 °C、およびキャピラリー電圧 4000 V。ピーク面積は内部標準を使用して正規化され、濃度は本物の標準の希釈系列から作成された検量線との比較によって決定されました。フェニルプロピオン酸の校正範囲は 0.020 ～ 30 mM、フェニルプロピオニルグリシンの場合は 0.003 ～ 12 mM、4-ヒドロキシ馬尿酸の場合は 0.020 ～ 30 mM、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸の場合は 0.049 ～ 30 mM、N の場合は 0.020 ～ 12 mM でした。 -(3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル)グリシン、イソカプロイルグリシンについては0.003〜12 mM、N-シンナモイルグリシンについては0.12〜30 mM。 1/x 加重最小二乗回帰アルゴリズムを使用して、線形キャリブレーション回帰モデルを N-(3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル)グリシンとクレアチニンに適用し、二次回帰モデルを他の化合物に適用しました。クレアチニン、イソカプロイルグリシン、4-ヒドロキシ馬尿酸、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、N-(3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル)グリシンの場合、R2 = 0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、1.000、および0.990、フェニルプロピオニルグリシン、N-シンナモイルグリシン。

アシルカルニチンのプロファイルは、SCIEX 4500 トリプル四重極質量分析計を使用した臨床的に検証された同位体希釈質量分析アッセイを使用して評価されました。ラベルなし (カタログ番号: NSK-B-US-1、NSK-B-G1-US-1、ULM-7195-PK) とラベル付き (カタログ番号: NSK-B、NSK-B-G1) のフルセット、ＤＬＭ－９０６７－０．１ＭＧ）アシルカルニチン標準は、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅｓ（マサチューセッツ州テュークスベリー）から購入した。サンプル調製のために、20 μL の血漿を、完全な同位体内部標準セットを含む 0.1% ギ酸を含む 300 μL のアセトニトリルで沈殿させました。 13,000 × g で 5 分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、窒素で蒸発させました。次に、サンプルをブタノール中の 3 N 塩酸 100 μL で 65 °C で 15 分間誘導体化しました。誘導体化後、サンプルを窒素で蒸発させました。次に、乾燥サンプルを 80% アセトニトリル水溶液で再構成し、シリコンキャップを取り付けた 96 ウェルオートサンプラーバイアルに移しました。冷蔵オートサンプラーを 4 °C に設定しました。サンプル (4 μL) はサンプル調製後すぐに注入されました。抽出物はフローインジェクション分析によって質量分析計に導入されました。定組成移動相条件は、流速 0.1 mL min-1 の 100% アセトニトリルでした。アシルカルニチン種は、200 ～ 550 m/z の質量範囲にわたって 85 m/z の前駆体イオンスキャンを使用した正極性 ESI で検出されました。エレクトロスプレーイオン化パラメータは、イオンスプレー電圧が 5500 V、イオン源温度が 200 °C、ガス 1 とガス 2 が 20 PSI の圧力でした。定量のために、ピーク高さは内部標準を使用して正規化され、濃度はキャリブレーションとの比較によって決定されました。各アシルカルニチンについて作成された曲線。

MS-DIAL は、MCAD+/+ と MCAD-/- LC-MS の非ターゲットメタボロミクスデータのピークコールと統合に使用されました。他のすべての分析と視覚化は、Excel および GraphPad Prism (バージョン 8 および 9、graphpad.com) を使用して実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された非ターゲット質量分析データは、Metabolomics Workbench データベースに保管されています。生の GC-TOF ショットガンメタボロミクスデータは、アクセッション番号 ST001606 で入手できます。非ターゲット LC-MS データ、ST001633。これらのデータセットの分析は補足データ 1 ～ 4 に提供されています。この研究で生成された残りのデータはすべてソースデータファイルで提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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LC-MS 分析の技術支援については Lalla Fall 氏、本物の標準のキュレーションについては Shuo Han 氏、尿毒症溶質の提供については Tim Meyer 氏、LC-MS メソッド開発の支援についてはスタンフォード大学の ChEM-H メタボロミクスナレッジセンターに感謝します。および機器へのアクセス。この研究の一部は、フォード財団博士前期フェローシップおよび国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム (GRFP) から KMP に資金提供され、国立衛生研究所は DK110335 (DD)、GM142873 (DD)、AT011396 (DD)、DK101674 (JLS) を助成しました。、DK085025 (JLS)。 JLS と MAF はチャン・ザッカーバーグのバイオハブ調査員です。

カート・R・フィッシャー

現在の住所: Octant Bio、米国カリフォルニア州エメリービル

スタンフォード大学医学部微生物学および免疫学教室、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

カリ・M・プルス、ウィリアム・ヴァン・トロイレン、スティーブン・K・ヒギンボトム、マイケル・A・フィッシュバッハ、ジャスティン・L・ソネンバーグ、ディラン・ドッド

スタンフォード大学医学部病理学教室、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ハオチン・チェン、ユアンユアン・リウ、ジョン・B・ジャーマン、ティナ・M・コーワン、ディラン・ドッド

ChEM-H、スタンフォード大学、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

カート・R・フィッシャー & マイケル・A・フィッシュバッハ

スタンフォードヘルスケア、パロアルト、カリフォルニア州、米国

ジャスティン・マック & ビバリー・ウォン

スタンフォード大学生物工学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

マイケル・フィッシュバッハ

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

マイケル・A・フィッシュバッハ & ジャスティン・L・ソネンバーグ

ヒトマイクロバイオーム研究センター、米国カリフォルニア州スタンフォード

ジャスティン・L・ソネンバーグ

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Statement DD、JLS、MAF、および TMC がこの研究を考案し、設計しました。 KMP、DD、WVT、JBJ、YL、SH はマウス実験を実施し、サンプル調製を支援しました。 HC、DD、JM、BW、および CF が LC-MS アッセイを設計し、実行しました。すべての著者が知的貢献を提供しました。 KMP、HC、DD、JLS、MAF がこの論文を執筆し、すべての著者がフィードバックを提供しました。

ディラン・ドッドへの手紙。

DD と MAF は Federation Bio の共同創設者です。残りの著者は全員、競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Andre Marette と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Pruss、KM、Chen、H.、Liu、Y. 他。 MCAD を介した宿主微生物の共代謝により、馬尿酸を含む循環代謝産物が生成されます。 Nat Commun 14, 512 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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受信日: 2022 年 10 月 30 日

受理日: 2023 年 1 月 17 日

公開日: 2023 年 1 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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