一次繊毛は形態形成中のマイボーム腺の細胞パターンを制御するが、脂質組成は制御しない

Communications Biology volume 6、記事番号: 282 (2023) この記事を引用

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マイボーム腺 (MG) は、涙液層の脂質を生成する改変された皮脂腺です。 明瞭な視覚を維持する上でのそれらの重要な役割にもかかわらず、発生および疾患におけるMGの形態形成の基礎となるメカニズムは依然として不明瞭である。 繊毛を介したシグナルは、皮脂腺を含む皮膚付属器の発達にとって重要です。 したがって、我々は、発生中のMGの形態形成における繊毛の役割を調査しました。 ほとんどの細胞は初期の MG 発生中に繊毛が形成され、その後分化中に繊毛が分解されました。 成熟した腺では、繊毛細胞は主に近位腺の中心管の基底層に限定されていました。 ケラチン 14 発現組織における繊毛切除は、遠位端での増殖細胞の蓄積を破壊しましたが、全体的な増殖速度またはアポトーシスには影響を与えませんでした。 さらに、伸長中の細胞パターン形成の障害により、脂質組成は変化せずにマイバム体積が増加し、成熟 MG が肥大化しました。 したがって、繊毛シグナル伝達ネットワークは、MG 機能不全の治療法を設計するための新しいプラットフォームを提供します。

マイボーム腺 (MG) は、上まぶたと下まぶたの瞼板内に位置する全分泌腺です。 これらの改変された皮脂腺 (SG) は、分泌腺の中心管から分岐したいくつかの短い小管に分泌物を排出する分泌腺房のクラスターで構成されています。 分泌産物であるマイバム（細胞全体の脂質、タンパク質、核酸で構成される）は、最終的にまぶたの縁で放出されます。 マイバムはその後、まばたきするたびに、涙液層の最外層として眼の表面に広がります1、2。 この脂質が豊富な層は、まばたきの際にまぶたの潤滑剤として機能し、涙がまぶたに溢れるのを防ぎ、涙の蒸発を減らすため、眼の表面に重要な保護的役割を果たします1,3。

欠陥のある MG はマイボーム腺機能不全 (MGD) を引き起こします。これは「一般に終末管閉塞および/または腺分泌の質的/量的変化を特徴とする MG の慢性的びまん性異常」として定義されます4。 脂質分泌の減少は、涙液膜の不安定性に寄与し、世界的な有病率が 5 ～ 50% の範囲で最も一般的に遭遇する眼科疾患の 1 つであるドライアイ疾患 (DED) の悪循環に入りやすくする可能性があります。 DED は、房水欠乏性ドライアイ (ADDE) と蒸発性ドライアイ (EDE) という 2 つの主要な、相互排他的ではないカテゴリーにさらに分類されます6。 MGD は EDE および DED6、7、8 の主な原因と考えられています。 MGD を対象とした治療ソリューションの最近の開発には、眼潤滑剤、まぶたを温める装置、強力なパルス光が含まれており、主に MG 閉塞の緩和や脂質の置換に焦点を当てています9。 しかし、MG 萎縮を予防し、脂質産生を刺激する治療に対するニーズは満たされていません。 現在の有効な薬理学的標的におけるこの欠如は、主に、MGDの効率的かつ長期にわたる治療の標的となり得るMGの発生および再生の基礎となる分子ネットワークに関する知識が非常に限られていることに起因する。

ヒトの MG の形成は、まぶたの発達の封瞼期に相当する、妊娠 3 か月から 7 か月の間の胎児の発育中に起こります1。 マウスでは、MG の発生は胎生 18.5 日目 (E18.5) に始まり、出生後も継続します 10。 ヒトと同様、マウスにおける MG の発生は、MG の発生に不可欠なまぶたの発達の封瞼期に起こります 11,12。

MG の発生は、毛包およびそれに関連する SG を含む毛包脂腺単位の発生と類似点を共有していることが示唆されていますが、MG の発生と再生の基礎となる基本的なメカニズムは依然として十分に理解されていません。 毛包と同様に、MG は外胚葉シートから発生し、中胚葉に陥入して原基を形成します。 次に、まつげの毛髪基部と同様に、マイボーム腺基部は横方向の成長を発達させ、後に小管と脂腺腺房に分化します13。 マウスの発生では、E18.5で上皮プラコードが形成され、続いて間葉への陥入とプラコードの伸長、生後5日目(P5)あたりからMGの分岐が始まり、P1510までに成熟形態が獲得されます。

一次繊毛は、基底体に由来し、細胞膜から伸びる微小管をベースとした細胞小器官です。 軸索に沿ったタンパク質粒子の双方向移動である鞭毛内輸送（IFT）は、繊毛の適切な組み立てと維持を保証します14、15、16、17、18。 一次繊毛の機能不全は、繊毛病と呼ばれる不均一な疾患群を引き起こし、その一部は重度の発達欠陥を誘発し、組織発生における一次繊毛の重要な役割を浮き彫りにしています19。 一次繊毛は、皮膚、角膜上皮、毛包脂腺単位などの外胚葉由来組織の発達において重要な役割を果たしています20、21。 特に、一次繊毛は、細胞増殖と垂直移動の制御を通じて角膜上皮の肥厚を調節します22。 皮膚では、一次繊毛が表皮のケラチノサイトの過剰増殖を制限します 23,24。 さらに、一次繊毛切除は、毛包の形態形成停止 24、25、26、27、28、29、30 および毛の成長サイクルの調節不全 31 を引き起こします。 常染色体劣性毛様体症であるバルデ・ビードル症候群の患者は、毛孔性角化症や脂漏性皮膚炎などのいくつかの皮膚疾患に苦しんでいます32。 興味深いことに、一次繊毛切除は SG 小葉の過形成を誘導し、SG 発生における繊毛依存性の調節的役割を示しています 23。 しかし、これらの繊毛に関連した皮膚状態の病因と、SG の異常な拡大の根底にあるメカニズムは依然として不明です。 一次繊毛の役割はさまざまな外胚葉由来の組織で研究されていますが、MGの発生、維持、および機能におけるその役割は不明のままです。

この研究では、MG細胞は発生の初期段階で繊毛があり、マイボサイトは分化するにつれて一次繊毛を失うことを示します。 我々は、一次繊毛がMGの中心管の直径と全体のサイズを調節するために必要であることを実証します。 我々は、一次繊毛が発生中の腺内の増殖細胞と死滅細胞の空間分布を制御することによって初期のMG細胞のパターン形成を決定するメカニズムを提案します。 これらの発見は、繊毛を介したシグナル伝達経路がMGDに対抗する潜在的な治療標的であることを示唆しています。

MGの形態形成における一次繊毛の関与を決定するために、我々は条件付きノックアウトK14-Cre;Ift88fl/fl（ここではcKOと呼ぶ）を生成した。 このマウスでは、繊毛の組み立てと維持に必要な IFT 機構のサブユニットをコードする Ift88 遺伝子 33 が、MG 組織を含むケラチン 14 (K14) を発現するすべての上皮細胞で切除されています。 K14-Cre リコンビナーゼの発現は、mT/mG レポーターマウス系統 34 を使用して追跡されました (補足図 1)。 K14-Cre;Ift88floxed;mT/mGトランスジェニック系統では、赤色蛍光膜標的tdTomato（mT）を発現するカセットのCre依存性切除により、K14における膜標的緑色蛍光タンパク質（mG）の発現が促進された。 -発現組織（補足図1）。 MG における一次繊毛切除をモニタリングするために、毛様体膜に関連するタンパク質である ARL13B を免疫検出しました 35,36。 P3では、繊毛はコントロールマウスの事実上すべてのMG細胞に存在していました。 対照的に、cKO マウスの MG 細胞では繊毛が存在しないか、非常に短かった（補足図 1）。 前述したように、新生 cKO マウスの外観は一般に対照マウスの外観と類似していました 22,23。 発生中の眼瞼の癒合と開口の欠陥は MG の形態形成に影響を与える可能性があるため、我々はこれらのプロセスを詳細に分析しました 11。 cKO マウスとコントロール マウスの両方でまぶたの癒合と開瞼がそれぞれ E15.5 頃と P13 頃に発生し、以前の研究の結果が裏付けられました 22,23。 しかし、我々は、ほとんどの成体cKOマウスのまぶたの縁に沿って、対照マウスでは観察されなかった、多焦点の白色粒状から白亜質の脂漏性残骸の存在に気づきました（図1a）。

a 対照および cKO 成人 (6 か月) の目の代表的な写真。 矢印は白い沈着物を示し、cKO マウスでのみ観察されます。 b P6およびP8でOROで染色された足根板の代表的な画像。 ボックスで囲まれた領域は、高倍率で表示された領域を示します。 スケールバー、200 μm。 N、鼻。 T、一時的。 c MGの数とMGのサイズは、P6およびP8で定量化されました（P6でn = 20コントロールおよび5 cKOマウス、P8でn = 13コントロールおよび9 cKOマウス）。 マウスごとに、上眼瞼および下眼瞼におけるすべての個々の MG の MG 面積を平均することによって MG 面積を決定しました。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性はマンホイットニー検定を使用して評価されました。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。 d P21でOROで染色された足根板の代表的な画像。 ボックスで囲まれた領域は、高倍率で表示された領域を示します。 スケールバー、200 μm。 N、鼻。 T、一時的。 e P6およびP21でHEで染色されたコントロールおよびcKO MGの代表的な画像。 ボックスで囲まれた領域は、高倍率で表示された領域を示します。 スケールバー、200 μm。

瞼板のオイルレッドO（ORO）染色により、P6およびP8では、まぶた（上部および下部）あたりのMGの数が対照マウスとcKOマウスで同様であることが明らかになりました（図1b、c）。 ただし、cKO MGの染色領域は、P6およびP8でそれぞれ対照マウスの染色領域より29％および21％大きかった（図1c）。 P21のマウスで見られるように、成熟したMGは、cKOマウスと対照マウスの両方で互いに非常に近くに見え、個々の腺の正確な輪郭、したがってそれらの表面の測定が困難でした（図1d）。 しかし、MGは、対照マウスよりもcKOの足根板に密に分布しているようでした。 対照では隣接するMGの近位領域の間に未染色の病巣が見えましたが、cKOでは見えませんでした（図1dの矢印）。 さらに、同じ遺伝子型の男性と女性の間でMGの寸法に有意な差は観察されず（補足図2）、研究全体にわたって両性がプールされました。 MGサイズの違いにもかかわらず、組織学的分析により、基底および分化マイボサイトの形態が変異体と対照の両方で類似しており、変異体マウスでは管閉塞の兆候が観察されないことが明らかになりました（図1e）。

変異体 MG の大幅な拡大を考慮して、脂質の産生と組成が繊毛変異体で変化するかどうかを調べました。 足根板抽出物の脂質プロファイルは、定組成および勾配逆相超高速液体クロマトグラフィーと組み合わせた高分解能質量分析法 (MS) によって評価されました。 保持時間と質量電荷 (m/z) 比のユニークな組み合わせを持つ約 150 種類の分析物が同定されました。 対照野生型サンプルの代表的な質量スペクトルを図 2a ～ c​​ に示します。 主成分分析（PCA）では、対照サンプルまたはcKOサンプルの明らかなクラスター化は生成されず（図2d）、それらの化学組成が類似していることを示唆しています。 しかし、ワックスエステル (WE) ファミリーとコレステリルエステル (CE) ファミリーの 15 種類の主要な脂質種のセットのサンプルを分析したところ、対照マウスと比較して、cKO 変異体では産生される脂質の量が約 2 倍増加していることがわかりました。図2e)。 まとめると、MG の一次繊毛除去は、マイボ細胞の全体的な成熟プロセス、したがってマイバムの脂質組成に影響を与えることなく、MG のサイズの拡大と脂質生産の 2 倍の増加をもたらしました。

a コントロールマウスからの遊離コレステロール (Chl) とコレステリルエステル (CE) の分析シグナル。 b 対照マウスからのマイボームアンワックスエステル (WE) のプールの観察スペクトル。 (c) 対照マウスからのトリアシルグリセロール (TAG)、α,ω-ジアシル化ジオール (DiAD)、および (O)-アシル化 ω-ヒドロキシ脂肪酸のコレステリル エステル (Chl-OAHFA) のプールの観察スペクトル。 d コントロール (C、黄色の点) および cKO (M、緑の点) の LC/MS データに対して主成分分析 (PCA) を使用して生成されたスコア プロットは、明確なクラスター化がなく、マイボーム腺脂質のコントロールと変異体サンプルの強い重複を示しました。さまざまな種類のサンプルを分析し、それらの類似した生化学的組成を示します。 e ただし、一次繊毛切除により、対照マウスの脂質含有量と比較して、cKOマウスの足根板における全体的な脂質産生が増加しました（Ctrlの場合はn = 6、cKOの場合はn = 6）。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性はマンホイットニー検定を使用して評価されました。

MG サイズ制御における繊毛の役割についての洞察を得るために、Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP トランスジェニック マウスの発生中および成熟 MG における一次繊毛の時空間分布を決定することを試みました (図 3)。 このマウスは、単量体赤色蛍光タンパク質 mCherry に融合された繊毛膜関連タンパク質である ARL13B と、GFP に融合された中心小体タンパク質である Centrin2 を発現し、それぞれ赤色と緑色の蛍光標識された繊毛と基底体を生成します 35,36,37 、38。 MG のサイズと形態は瞼板内の位置に応じて異なるため（図 1b）、まぶたの側頭側にある最大の腺から始めて MG に番号を付けました（図 3a）。 この研究全体を通じて、図3a、bに示すように、変異マウスと対照マウスにおいて、足根板の同様の中央位置に優先的に位置する腺を分析しました。

a 類似の MG の比較を容易にするために、MG には側頭側 (MG#1) から鼻側 (MG#11) まで番号が付けられました。 四角で囲まれた領域は、以下のすべての実験について MG が研究された領域を示します。 b 共焦点顕微鏡で画像化された P3 における足根板全体。 MG は K14 に対する抗体で染色されました (白色)。 毛包 (* でマーク) も染色されましたが、毛幹が存在するため MG と容易に区別できました。 四角で囲まれた領域は、c および d で高倍率で表示された MG を示します。 スケールバー、100 μm。 c MG#7のImarisによる3D再構築 Arl13b-mCherry;Centrin2-GFPマウスでは、mCherryは一次繊毛を赤色でラベルし、GFPは基底体を緑色でラベルします。 P3 では、MG に沿って繊毛が見られました。 スケールバー、15 μm。 d MG#7 の中央で摘出した光学セクション。 基底体 (緑色) と一次繊毛 (赤色) は、MG 基底細胞 (黄色の点線で囲まれた) の頂端側に局在していました。 スケールバー、15 μm。 e P6 の代表的な MG 縦断面図。 MG (黄色の点線で囲まれた) は K14 に対する抗体 (白色) で染色され、核は DAPI (青色) で染色され、基底小体は GFP (緑色) で標識され、一次繊毛は mCherry (赤色) で標識されました。赤）。 MG 細胞は、腺の遠位端 (i)、形成中の腺房 (ii)、および形成中の中心管 (iii) を含む、MG に沿って繊毛を持っています。 スケールバー、15 μm。 f P25 における形態的に成熟した MG の代表的な縦断面図。 MG (黄色の点線で囲まれた) は K14 に対する抗体 (白色) で染色され、核は DAPI (青色) で染色され、基底小体は GFP (緑色) で標識され、一次繊毛は mCherry (赤色) で標識されました。赤）。 腺房 (i) には一次繊毛は見えませんでしたが、小管 (ii) および中央管 (iii) には一次繊毛 (矢印) がまだ存在していました。 スケールバー、100 μm。 Ac、腺房; CD、中央ダクト。 g 発生全体にわたる繊毛細胞の割合の定量化（各年齢に対して n = 3）。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性は、クラスカル-ウォリス検定を使用して評価されました。 明確にするために、グラフには統計的に有意な差のみが示されています。 h P12およびP25におけるMG内の繊毛細胞の空間分布。 繊毛細胞の割合は、特に P12 および P25 の MG の腺房および中心管で定量されました (各年齢につき n = 3)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性は、マン・ホイットニー検定(Ctrl対cKO)およびウィルコクソン符号順位検定(腺房対管)を使用して評価した。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。

P3では、MG細胞の70％以上が、基底細胞の頂端側から発生中の腺の中心に伸びる一次繊毛を示しました（図3c、d、g）。 P6およびP8での初期MG分岐中に、同様の割合のMG細胞が繊毛化されました（図3e、g）。 P6では、一次繊毛が伸長する遠位先端、発達中の管、および出芽する腺房に見られました。 しかし、中心管の中心に位置する成熟マイボ細胞の基底体には繊毛が見られませんでした（図3e、黄色の矢印）。 MGが成熟し続けるにつれて、繊毛細胞の割合は、P12およびP25でそれぞれ30％および12％まで徐々に減少しました（図3g）。 繊毛細胞の割合は、P12のMGの管と腺房で同様でした（図3h）。 しかし、P25では、一次繊毛は腺房に存在しませんでした（図3f、h）。 P25では、ほとんどの一次繊毛が中心管の近位領域の基底細胞上に検出されました。 それでも、いくつかは接続小管の基底細胞にも時々見られました（図3f）。 したがって、一次繊毛は発生中のMGの基底細胞に局在し、MGの発生が進行しマイボサイトが成熟するにつれて分解されました。 しかし、繊毛は成熟した腺の中心管の基底細胞上に残存しました。 まとめると、これらの結果は、主に分裂細胞と未分化細胞が関与する MG 形態形成の初期発生段階における繊毛の役割を示唆しています。

いくつかの研究では、細胞増殖には一次繊毛の吸収が必要であることが示されており、さまざまな上皮新生物における一次繊毛の減少または喪失が実証されています（39、40、41で概説）。 したがって、我々は、繊毛突然変異体の MG のサイズの異常な拡大が細胞増殖速度の増加によるものであるかどうかを調べました。 増殖速度は、EdU注射の6時間後にEdU陽性細胞の数を計数することによって決定され、DAPI核染色によって同定された細胞の総数に対して正規化された。 腺の増殖率を正確に評価するために、各腺の総 MG の厚さをカバーするまぶたの連続切片上の EdU 陽性細胞と DAPI 陽性細胞を数えました。 細胞増殖速度は、MG がそれぞれ伸長し、分岐し始め、成熟形態に達する P4、P6、および P21 で評価されました 10。 変異マウスとコントロールマウスの両方のMGにおける分裂細胞の全体的な割合は、P4で約40%、P6で約25%に減少し、P21でベースライン値の約5%に達しましたが、P21ではコントロールマウスとcKOマウスの間に有意差は検出されませんでした。分析されたいずれかの時点 (図 4a ～ d)。

a〜c 細胞増殖は、それぞれコントロール（a、b、およびc）およびcKO（a'、b'、およびc'）マウスのP4、P6、およびP21でMGのEdU染色によって評価されました。 スケールバー、100 μm。 *、毛包。 ニレ、まぶたの縁。 d、遠位。 p、近位。 d – e 増殖速度は、完全なMGのP4、P6、およびP21で定量化されました（d）、特に近位（p）半分（まぶたの縁から腺の中心まで）と遠位（d）半分（腺の中央から先端まで）MGのe． 増殖速度は、EdU 陽性核の数を DAPI で染色された核の総数に対して正規化することによって決定されました (n = 4/グループ)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性は、Mann Whitney 検定 (Ctrl 対 cKO) および Wilcoxon 符号付き順位検定 (遠位対近位) を使用して評価しました。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。 （ f ）細胞死は、それぞれ対照（ f ）およびcKO（ f '）マウスのP21でのMGのTUNEL染色によって評価されました。 スケールバー、100 μm。 *、毛包。 ニレ、まぶたの縁。 d、遠位。 p、近位。 （g – h 細胞死率は、完全なMG（g）、特に中心管（h）でP21で定量化されました。細胞死率は、TUNEL陽性核の数を、染色された核の総数に対して正規化することによって決定されました） DAPI (n = 3/グループ). データは平均 ± SD として表示されました. 統計的有意性は、Mann-Whitney 検定 (合計、Ctrl vs. cKO) および Wilcoxon 符号付き順位検定 (遠位 vs. 近位) を使用して評価されました。ns、非-有意、P ≥ 0.05。

さらに、腺の近位-遠位軸に沿った増殖細胞の分布を調べました。 対照マウスでは、細胞の 52% と 28% がそれぞれ P4 と P6 で腺の遠位半分で分裂していました。 対照的に、対照マウスの腺の近位半分では、P4およびP6でそれぞれ細胞の32%および22%のみが増殖していた。 したがって、対照MGの開発中、増殖細胞は近位領域よりも遠位領域でより豊富でした（図4a、b、e）。 対照的に、変異体では増殖細胞が腺の長さに沿って均一に分布していました（図4a'、b'、e）。 P21までに、近位-遠位軸に沿った増殖細胞の遠位濃縮はもはや目に見えなくなりました（図4c、e）。 したがって、MG発生中、一次繊毛切除は全体の細胞増殖速度を変化させませんでしたが、代わりに、分裂細胞を腺の遠位半分に優先的に集中させることに影響を与えました。 ただし、一次繊毛に関連する基底小体の数は、P3、P6、およびP8のMGの遠位半分と近位半分の間で有意な差はありませんでした（補足図3）。

次に、繊毛切除で観察された腺構造の混乱が、アポトーシス細胞の数または分布を同様に変化させるかどうかを評価しました。 我々は、TUNEL および DAPI 染色により、P21 の成熟 MG におけるアポトーシス細胞の割合を定量しました。 アポトーシス細胞の大部分が局在する小管、腺房および腺中央管で検出されたTUNEL陽性（TUNEL + ）細胞の全体的な割合は、対照マウスとcKOマウスの両方で同様でした（図4f、g）。 コントロールマウスとcKOマウスの両方のMGではアポトーシス細胞の空間的分離は検出されませんでしたが（図4g）、腺中央管のみを考慮した場合、TUNEL + 細胞のより高い割合が遠位半分に局在していました。対照マウスの近位半分（図4h）。 対照的に、cKOマウスの中心管では、アポトーシス細胞は腺の遠位半分と近位半分の間に均一に分布していました（図4h）。 したがって、一次繊毛の切除は細胞死の速度には影響を与えませんが、代わりにMG中心管内のTUNEL + 細胞の局在化に影響を与えます。 まとめると、これらの結果は、繊毛の欠如が増殖と細胞死の全体的な速度ではなく、分裂細胞とアポトーシス細胞の分布に影響を及ぼし、その後、変異体MGの構造とサイズを変化させることを示しています。

繊毛の欠如が MG の形態形成にどのような影響を及ぼし、異常に大きな腺をもたらすかを調べるために、MG 発生の初期の形態形成段階における細胞パターンの形成を調べました。 mT/mG マウスにおける Cre 依存性相同組換えの際に発現した mG レポーターにより、変異体とコントロールの両方で細胞分解能で MG 形態形成を追跡することができました。 P1では、まぶたの縁からの上皮の陥入がまぶた間充織に伸びると、変異体のマイボーム原原基は、対照で観察されたものと同様のサイズと全体の形状を示しました（図5a、b）。 しかし、対照の陥入上皮原基の細胞は、基底上細胞の層を取り囲む基底細胞の一層でよく組織化されているように見えましたが、変異体では、この細胞パターンはあまり明確ではないようで、基底層と内層は明確に認識できませんでした（図1）。 .5a、b)。 P3 MGによる形態形成の進行に伴い、変異体の原基は対照の原基よりも短くなりましたが、幅が広くなりました（図5c-g）。 さらに、腺の中心の細胞数と比較した基底細胞の数の比率は、cKO マウスでは大幅に減少しており、cKO MG の中心部分にはより多くの細胞があることが示されました（図 5h、i）。

a – b 共焦点顕微鏡で画像化された、P1 における足根板全体の代表的な概要。 MG は、mG 蛍光レポーターによって視覚化されました。 ボックスで囲まれた領域は、高倍率で表示された MG を示し、連続した光学セクションが表示されます。 スケールバー、50 μm。 c – d 共焦点顕微鏡で画像化されたP3の全マウント足根板の代表的な概要。 MG は、mG 蛍光レポーターによって視覚化されました。 四角で囲まれた領域は、e の高倍率で表示された MG を示します。 スケールバー、50 μm。 cKO マウスの MG 長さ (f) および MG 幅 (g) を対照に対して正規化しました (n = 5 マウス/グループ)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性はマンホイットニー検定を使用して評価されました。 h 基底細胞 (紫色) と中心細胞 (青色) を手動で色分けし、カウントしました。 i 基底細胞と中心細胞の間の比率を計算しました (n = 5 マウス/グループ)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性はマンホイットニー検定を使用して評価されました。

MG が発生し続けると、上皮の中心索内の細胞が P6 で拡張し、中心管が形成され始め、側枝が現れます 10。 P6およびP21では、変異体中心管の幅は、それぞれ対照よりも10％および30％大きかった（図6a〜d）。 細胞増殖、アポトーシス、および細胞サイズは、変異体と対照の両方の MG で変化しないままであったため、少なくとも発生初期段階では、両方の遺伝子型の腺の全体的な質量は同様のままであると考えられました。 足根板のホールマウントサンプルに二光子顕微鏡を使用して、P1、P3、またはP4で変異体MGと対照MGの間の全体の平均体積に有意な差は見つかりませんでした（図6e、f）。 対照的に、P8では、変異体腺の平均体積は対照腺の平均体積のほぼ2倍でした（図6g、h）。 最後に、腺房の数は両方の遺伝子型間で有意な差はありませんでした（図6i）。 したがって、一次繊毛は、成長中のMGの遠位端で増殖細胞の分離を促進し、それによってMG管の長さと幅のバランスの取れた成長が保証されます（図6j）。 繊毛の切除が既知の繊毛媒介シグナル伝達カスケードの結果を混乱させるかどうかを判断するために、成人の足根板におけるヘッジホッグ（Hh）、Wnt、またはNotch経路の転写標的または必須構成要素であることが知られている選択された遺伝子の発現レベルを調べた。定量的リアルタイム PCR (RT-qPCR) による cKO マウスとコントロール マウス。 変異体で検出されたWntおよびNotchシグナル伝達カスケードに関連する遺伝子の発現レベルは、対照で見つかったものと区別できませんでした（図6k）。 対照的に、我々は、対照と比較して、変異体において、転写因子およびHh経路の転写標的であるGli1遺伝子のmRNAレベルの有意な減少を検出した（図6k）。 しかし、Hh リガンドであるデザート (Dhh)、インディアン (Ihh)、およびソニック ヘッジホッグ (Shh) を含む Hh 経路の追加遺伝子と、サイクリン D および Ptch1 を含む転写標的の発現レベルは、両方とも変化しませんでした。 単一細胞分析を含む今後の研究により、MGの形態形成と再生における一次繊毛の役割についての理解がさらに深まるでしょう。

a〜d P6（a）およびP21（c）での代表的なMG縦断面と、P6（b）およびP21（d）での中心ダクト直径の定量化。 MG は mG 蛍光レポーターによって視覚化され、MG 中心管の直径 (白い点線で囲まれた) が測定されました (n = 5 マウス/グループ)。 スケールバー、100 μm。 e 2光子によって画像化されたP3における足根板全体の代表的な概要。 スケールバー、100 μm。 f Imaris を使用して Z スタックを 3D 再構成した後、P1、P3、および P4 での MG 体積を定量しました (P1 では n = 4 マウス/グループ、P3 では n = 5 マウス/グループ、P4 では n = 3 マウス/グループ)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性は、クラスカル-ウォリス検定を使用して評価されました。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。 g 2 光子によって画像化された P8 における足根板全体の代表的な概要。 スケールバー、100 μm。 Imaris を使用した Z スタックの 3D 再構成後に、P8 での MG 体積を定量化しました (n = 4 マウス/グループ)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性は、クラスカル-ウォリス検定を使用して評価されました。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。 i MGの分岐は、P8で腺ごとの腺房の数を計数することによって評価しました（n = 5コントロールおよびn = 4 cKO）。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性はマンホイットニー検定を使用して評価されました。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。 （ j ）cKOおよび対照における発生初期（P1からP3）中に起こるMG形態形成および細胞パターン形成のモデル。 k cKO およびコントロールの単離された足根板における Hh (Dhh、Ihh、Shh、CyclinD、Gli1、Ptch1)、Notch (Hes1、Hey1、Maml1、Notch1)、Wnt (Axin2) 標的遺伝子の RT-qPCR 分析は、成人期の対照と比較した変異体組織における Gli1 発現 (n = 7 対照および n = 5 cKO)。 データは平均値 ± SD として表示されました。 統計的有意性はマンホイットニー検定を使用して評価されました。 ns、有意ではない、P ≥ 0.05。

MG の主な機能は、有害な環境要因や乾燥から眼の表面を保護する脂質層であるマイバムを分泌することです 1,42,43。 いくつかの要因が MG の機能的欠陥を引き起こす可能性があり、これに対する効果的な長期治療法はありません。 明瞭な視覚を維持する上でのそれらの重要な役割にもかかわらず、MG の発生と維持の根底にある分子機構とシグナル伝達ネットワークは依然としてよく理解されていません。 私たちの研究は、MGのサイズと生成されるマイバムの量の制御における一次繊毛の重要な役割を明らかにしました。 これらの発見は、MGD治療の設計に重要な意味を持つMGの発生と維持の基本的なメカニズムに光を当てます。 今回我々は、繊毛を欠く変異マウスが、K14発現組織のIft88遺伝子の除去により、通常の2倍の脂質を含む異常に大きなMGを発生させることを示した。 しかし、腺の拡大は、増殖率やアポトーシス率の変化によっては達成されませんでした。 その代わりに、我々は、発生中の腺における繊毛の切除により細胞組織とその近位-遠位軸に沿った分裂細胞の局在が変化し、その細胞パターンが変化し、結果として腺の寸法が増加することを実証した。

蛍光標識された繊毛と基底体を有するトランスジェニック マウス モデルを使用して、我々は、一次繊毛が主に初期の MG 発生中にマイボサイト上に存在することを示しました。 したがって、繊毛欠損K14発現組織の発生プロセスが、増殖率やアポトーシス率の変化なしに成体マウスのMGをどのようにして大きくしたのかを説明するために、我々は対照マウスとcKOマウスで発生中のMGの形態形成と細胞パターンを調べた。 われわれは、P1では、癒合したまぶたの縁から出芽する制御腺の細胞パターンが、基底細胞の1つの境界層と、伸長する芽の中心にある基底上細胞の1層で組織化されているように見えることを発見した。 対照的に、この細胞パターンは繊毛変異体のMG芽では乱れており、細胞はほとんど識別できない層でランダムに組織されているように見えました（図5）。 P3 では、固形上皮索が足根板の間葉に陥入し続け、中央/基底上層の数が 2 または 3 に増加しました。P4 と P6 の間の伸長期では、分裂細胞の大部分が足根板の間葉に局在しました。対照では発生中の腺の遠位端に分布していましたが、変異体では腺の長さに沿って均一に分布していました。 したがって、MGの繊毛は、近位-遠位の伸長に必要な分裂促進シグナルの感知に不可欠である可能性があります。 我々は、成長中の腺内で分裂細胞を空間的に分離できないと、腺の遠位端での伸長プロセスが妨げられる可能性があると提案します。 増殖の違いは検出されなかったため、遠位端での成長が遅いと、結果的に陥入した上皮索の異常な横方向の拡張が生じる可能性があります。 実際、繊毛変異体の腺では中心/基底上細胞層の数が異常に4～5層に増加し、その結果、発達中の腺が対照腺よりも広く、また短くなっていることがわかりました。 この可能性と一致して、腺の総体積は少なくともP4までは変異体と対照の両方で同様のままでした（図6jのモデルを参照）。 P8 では、変異体 MG の体積は対照と比較して大幅に増加しました。 ただし、腺の長さは両方とも同様でした。 したがって、腺が成長するにつれて、抑制シグナルがその伸長を妨げ、最終的に腺の完全な形態的成熟で停止する可能性があると我々は仮説を立てています(P15)。 したがって、対照MGは伸長を停止しましたが、変異体腺は成長を続け、最終的には対照腺の長さに達しました。 しかし、変異体腺では中心管がより大きかったため、変異体 MG の全体的なサイズと脂質含有量は対照と比較して増加しました。 同様の動態は小管の形成中にも起こる可能性があります。 発生中のMGの遠位先端における分裂細胞の局在の決定における一次繊毛の役割を解明する今後の研究により、組織形態形成における繊毛の新たな役割が明らかになる可能性がある。

SG とは異なり、MG は構造的に毛包にリンクされていません 1。 しかし、MG を挿入するまつ毛の毛包が、その発育や恒常性に影響を与えるかどうかは不明です。 皮膚では、K14 発現組織の繊毛形成タンパク質が除去されると、Hh シグナル伝達経路の不活性化を介して毛包の変性が引き起こされます 23,29,44。 しかし、毛包の形成と維持における欠陥は生後わずか 3 週間で明らかとなり、この時点で MG はすでに成熟した構成に達しています 23。 したがって、この研究で報告されているように、MGに影響を与える繊毛依存性欠陥に対する毛包の間接的な役割を除外できます。 毛様体コンパートメントが Hh シグナル伝達経路の伝播に必要であること、および Ift88 の除去がいくつかの組織で Hh 応答性を阻害することは広く受け入れられています 45,46。 したがって、我々は、対照と比較した場合、変異体足根板において転写因子および転写標的遺伝子Gli1のmRNAレベルの低下を検出した。 皮膚における研究では、Hh 経路が SG の発生に重要であり、MG といくつかの基本的な特徴を共有していることが示されています 47。 したがって、Ift88 アブレーションによる繊毛欠損 MG の異常な拡大を示す我々の結果は、Hh 媒介 MG の発生と矛盾する可能性があります。 しかし興味深いことに、K14 発現細胞の繊毛を除去すると、Hh シグナル伝達の枯渇により毛の成長と維持が損なわれるだけでなく、マウスの尾の SG が肥大化して多葉化する結果となりました 23。 したがって、この証拠は、SGおよびMGにおける繊毛-Hhシグナル伝達軸における繊毛の異常かつ複雑な関与を示唆した。 この相互作用を徹底的に調査すれば、毛孔性角化症や脂漏性皮膚炎などの繊毛症に関連する皮膚関連症状とMGD32の両方に対処するための治療戦略を設計する際の基本的なメカニズムの洞察が明らかになる可能性があります32。

ここで我々は、マイボサイトが成熟するにつれて一次繊毛を失うことを示しました。 表皮や角膜上皮などの他の上皮と同様に、繊毛は基底細胞上に存在していましたが、細胞が分化して頂端に移動するにつれて分解されました22、23、24。 成熟した腺では、繊毛細胞は中心管の近位領域、および小管および腺房の基底層に限定されていました。 興味深いことに、成体 MG では、幹細胞の特徴を反映する分裂の遅い細胞が、中央管が腺房に移行する点の管に局在していることが実証されました 48。 したがって、周期の遅い細胞が繊毛を持っているかどうかを判断することは興味深いでしょう。 皮膚では、一次繊毛は、恒常性における表皮の層化において、Hh に依存しない毛包間役割を果たしています 23,24。 Ift88 を除去すると、増殖速度が増加し、基底様細胞による基底層の拡大が引き起こされました。 しかし、過剰増殖は腫瘍や水疱の形成には至りませんでした 23。 これは、MG の拡大には増殖速度の増加が関与しないことを示す我々の発見とは対照的です。 ただし、発生または修復中の高度に増殖している角膜上皮におけるIft88のアブレーションは、増殖​​速度に影響を及ぼさないことに注意する必要があります22。 細胞増殖は繊毛切除の二次的かつ間接的な効果である可能性があることを示唆しています。 興味深いことに、皮膚および角膜では、上皮基底細胞の一次繊毛が細胞増殖とは独立して Notch 経路を調節しました 22,24。 足根板組織のRT-qPCRからの我々の結果は、成体マウスのMGの一次繊毛がNotchシグナル伝達を伝達する必要がないことを示唆しているが、変異体と対照の間のNotch標的遺伝子のmRNAレベルの潜在的な差は、このアプローチの検出可能なマージン。 実際、我々は、成熟した MG では少数の細胞だけが繊毛を残していることを示しました。 したがって、単細胞レベルでの今後の研究により、Notch および MG の維持における繊毛の関与についてのより包括的な理解が得られる可能性があります。 興味深いことに、SG の前駆細胞における Notch シグナル伝達経路の抑制が腺の萎縮​​を引き起こすことが示されました 49。 対照的に、幹細胞コンパートメントの外側の Notch アブレーションは SG の拡大を促進しました 49。 別の研究では、K14 発現組織で Notch1 を除去すると、MG と置き換わる嚢胞様構造が形成されました。 したがって、MGs51における幹細胞ニッチ維持に関連して、単一細胞レベルでのNotch経路の形質導入における一次繊毛の関与の可能性を決定することは興味深いであろう。

脂質分析により、MG 発生中の繊毛の切除により脂質含有量が 2 倍増加することが示されました。 我々はMGサイズの調節に繊毛が関与していることを実証したが、繊毛がマイバム生成においてより直接的な役割も果たしているかどうかは不明のままである。 ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-γ (PPARγ) は、脂肪細胞と皮脂細胞の分化および脂肪生成の制御に関与するリガンド活性化転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーです 52,53。 さらに、PPARγはインビボおよびインビトロでのマイボサイトの分化にも関与しており、脂質生産に関係する遺伝子の上方制御に必要です54、55、56。 最近の研究では、傷害誘発性脂肪生成に関連して、Ift88 欠失による線維/脂肪生成前駆体 (FAP) の繊毛の除去により、PPARγ の生成と脂肪細胞への FAP の分化が阻害されることが示されています 57,58。 これらの研究は、MG における繊毛の除去が脂質量の増加とマイボサイトの質量の拡大につながるため、PPARγ 依存性脂肪生成またはマイボサイト分化における MG 繊毛の直接的な関与に反対するであろう。 しかし、ほとんどの細胞型とは異なり、FAP の一次繊毛および発達中の肢芽の細胞は、GLI3 リプレッサーの形成を促進することによって GLI1 および PATCHED1 の発現を阻害します。 その結果、繊毛の除去は Hh シグナル伝達活性の減少ではなく増加をもたらしました 59。 いくつかの研究で、脂肪生成および PPARγ 調節における Hh 経路の複雑な役割が示されています 60、61、62、63。 したがって、MGの発生と恒常性におけるGLIタンパク質の役割、そしてより広範にはHh経路の役割に取り組む今後の研究は、マイボサイトの分化、再生、マイボ形成の理解に重要な機構的洞察を提供するだろう。

現在まで、MGD および DED の治療選択肢は限られています。 マイバムの質と量を増加させようとする理学療法は、長期的に満足のいく結果を達成しませんでした64,65,66。 脂質含有人工涙液やエマルジョンの局所適用によって脂質層を置換することを目的とした他のアプローチは、眼表面の脂質層の複雑な構造と組成を考慮すると困難である 42,67 したがって、MG 再生と脂質産生を直接標的とすることで治療戦略を拡大する眼表面の不快感を軽減するだけでなく、影響を受けた患者の生活の質を改善する可能性があります。 この研究により、繊毛を介した経路が脂質組成に影響を与えることなくMGの増殖と脂質産生を制御していることが明らかになり、MGDと闘うための新たな治療標的となることが示唆された。

マウス系統 Ift88tm1Bky (ここでは Ift88fl/fl と呼びます)68、B6N.Cg-Tg(KRT14-cre)1Amc/J (K14-Cre、ジャクソン研究所ストック番号 018964)69、および Gt(Rosa)26Sor(tm4(ACTB) -tdTomato、-EGFP)Luo)/J (mT/mG)、Jackson Laboratory ストック番号 007676)34 は、混合 C57Bl/6、FVB および 129 遺伝的背景で維持されました。 Ift88 条件付きノックアウト (cKO) は、K14-Cre;Ift88fl/+ 雄と Ift88fl/fl 雌を交配することによって生成されました。 K14-Cre;Ift88fl/fl (cKO) 以外の対立遺伝子の組み合わせは対照 (Ctrl) とみなされました。 マウス系統 Tg(CAG-Arl13b/mCherry)1 K および Tg(CAG-EGFP/CETN2)3-4Jgg/KandJ (ここでは Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP)37 を Jackson Laboratory で購入しました (ストック番号 027967)。 。 すべての動物手順は、ジョンズ・ホプキンス大学の動物管理使用委員会のガイドラインと承認、および眼科および視覚研究における動物の使用に関する ARVO 声明に従って実施されました。

P6 および P21 マウスの上眼瞼および下眼瞼を切除し、PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で一晩固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン (HE) 染色は、標準的な手順に従って実行されました。 切片は、Olympus スライド スキャナ VS200 (Olympus、Center Valley、PA) で画像化されました。 P3 マウスのまぶたを切除し、PBS 中の 4% PFA で 30 分から 2 時間固定し、最適切断温度化合物 (OCT Tissue-Tek、Sakura Finetek、カリフォルニア州トーランス) に包埋しました。 凍結切片を一次繊毛染色のために処理しました。 冷アセトン (-20 °C) で 10 分間固定し、PBS 中の 0.5% Triton X-100 で 20 分間透過処理した後、切片をマウス抗アセチル化チューブリン抗体 (1:1000、T6793、Sigma-Aldrich、St) とともにインキュベートしました。ルイ、ミズーリ州）および/またはウサギ抗ARL13B抗体（1：800、17711-1-AP、ProteinTech Group、イリノイ州ローズモント）を2％BSA/0.1％Triton X-100/PBS中で4℃で一晩加えた。 次に、切片を二次蛍光抗体ロバ抗ウサギ Alexa Fluor™ 647 (1:500、A-31573、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム)、ロバ抗マウスフルオレセイン (FITC) (1:200、715-095) 中でインキュベートしました。 -150、Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.、ペンシルベニア州ウェストグローブ）およびロバ抗マウスローダミン（TRITC）（1:200、715-025-150、Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）を2% BSA/PBS中で2時間混合した。 切片を VECTASHIELD Antifade mounting Medium (H-1000, Burlingame, CA) でマウントし、Zeiss LSM880 共焦点顕微鏡 (Zeiss, Jena, Germany) で画像化しました。

P1、P3、P4、および P8 K14-Cre;Ift88fl/fl;mT/mG マウス (cKO) および K14-Cre;Ift88fl/+;mT/mG (Ctrl) 同腹仔のまぶたを解剖し、PBS 中の 4% PFA で固定しました。 １時間放置し、ＰＢＳで洗浄した。 固定中に、足根板を覆う結合組織と筋肉の大部分が手動で除去されました。 MG を 90% グリセロールにマウントし、LSM880 共焦点顕微鏡 (P1 のサンプルの場合) または LSM710/NLO 二光子顕微鏡 (P3、P4、および P8 のサンプルの場合) で画像化しました。 MG 全体にわたって 1 または 2 µm ステップで連続光学切片が取得されました。 Imaris (Bitplane、コネチカット州サウスウィンザー) を使用して Z スタックを 3D 再構成した後、MG の体積を定量化し、MG あたりの腺房の数を手動で数えました。

P6、P8、および P21 マウスのまぶたを切除し、PBS 中の 4% PFA で 1 時間固定し、PBS で洗浄しました。 固定中に、足根板を覆う結合組織と筋肉の大部分が除去されました。 MG を ORO 溶液 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) 中で室温 (RT) で 1 時間染色し、蒸留水ですすぎ、90% グリセロールにマウントし、Olympus MVX10 解剖スコープ (Olympus) で画像化しました。 MG サイズは、Fiji70 で測定された個々の MG の MG 面積を平均することによって決定されました。

P3、P6、P8、P12、および P25 Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP マウスのまぶたを解剖し、4% PFA/1% Triton X-100 (Mallinckrodt Pharmaceuticals、英国ステインズ アポン テムズ) で 1 時間固定しました。 PBSで。 次に、まぶたを MG 全体で K14 染色するか、OCT に埋め込むように処理しました。 MG 全体の場合、染色前に、足根板を覆う結合組織と筋肉の大部分を除去し、足根板を 2% BSA/1% Triton X-100/PBS を用いて室温で 1 時間透過処理しました。 ホールマウントサンプルおよび凍結切片の MG は、K14 に対するウサギポリクローナル抗体 (1:1000、905301、BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ) で染色されました。 核は凍結切片上で DAPI で対比染色されました。 MG ホールマウント (P3、P6、および P8) および凍結切片 (P12 および P25) は、Zeiss LSM880 共焦点顕微鏡で画像化されました。 連続光学切片を 1 μm ステップで取得しました。 Imaris を使用して Z スタックを 3D 再構成した後、Surfaces ツールを使用して MG の輪郭を描き、Spots ツールを使用して MG 内の一次繊毛と基底小体をカウントしました。 Centrin2-GFP 標識中心小体間の距離が 2 μm 未満の場合、単一の基底小体と見なされます。 補足図4に示すように、基底小体の数は核の数と類似しているため、MGの繊毛細胞の数は、一次繊毛の数を基底小体の数に対して正規化することによって決定され、パーセントで表されました。

P4、P6、および P21 のマウスに 50 mg/kg EdU (EdU-Click 594、baseclick、ドイツ) を 1 回腹腔内注射し、他の場所で記載されているように 6 時間後に屠殺しました 71。 まぶたを解剖し、OCT で急速冷凍しました。 20 ミクロンの凍結切片をメーカーの指示に従って処理しました (EdU-Click 594、baseclick、ドイツ)。 簡単に説明すると、切片をPBS中の4% PFAで15分間固定し、PBS中の0.5% Triton X-100で20分間透過処理し、次いで室温、暗所で反応カクテルで30分間染色した。 MG は、mT/mG 蛍光レポーターを使用して位置を特定するか、ウサギ抗 K14 ポリクローナル抗体 (1:1000、905301、BioLegend) を使用して染色しました。 核をDAPIで対比染色した。 切片は、横川共焦点スピニングディスクを備えたライカ DMI6000 顕微鏡またはツァイス LSM880 共焦点顕微鏡で画像化されました。 各凍結切片について、連続光学切片を 2.45 μm ステップで取得しました。 各マウスについて、連続凍結切片を処理して MG の全体を取得しました。 Imaris を使用して Z スタックを 3D 再構成した後、Surfaces ツールを使用して MG の輪郭を描き、Spots ツールを使用して各 MG 内の EdU 陽性核と DAPI 陽性核をカウントしました。 定量化は、上まぶたの中央に位置する MG で実行されました。 MGあたりの細胞増殖率は、EdU陽性核の数をDAPI陽性核の数に対して正規化することによって決定した。 MG の近位部分 (まぶたの縁から腺の中央まで) と遠位部分 (腺の中央から先端まで) を分離して、EdU 陽性および DAPI 陽性の核の定量化も実行されました。

P21 マウスのまぶたを切除し、PBS 中の 4% PFA で一晩固定し、パラフィンに包埋しました。 72に記載されているように、In situ細胞死検出キットTMR Red（Roche Applied Science、マンハイム、ドイツ）を使用して、切片をアポトーシス免疫蛍光染色のために処理しました。 切片を 10 mmol/L Tris/HCl (pH 7.4) 中の 10 μg/mL プロテイナーゼ K を用いて室温で 15 分間透過処理し、次に暗所で 37 °C で反応混合物を用いて 1 時間染色しました。 核をDAPIで対比染色した。 切片はZeiss LSM880共焦点顕微鏡で画像化されました。 TUNEL 陽性核と DAPI 陽性核を、互いに 20 μm 離れた 3 つの連続切片で計数しました。 MGあたりの細胞死率は、TUNEL陽性核の数をDAPI陽性核の数に対して正規化することによって決定した。

足根板を解剖によって分離し、すぐに RNAlater (AM7020、ThermoFisher、Waltham、MA) に浸し、-20 °C で最大 1 か月間保存しました。 ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州ジャーマンタウン）を製造業者の指示に従って使用して、まぶたからＲＮＡを抽出した。 SuperScript III 逆転写酵素キット (18080051、ThermoFisher) を製造元の指示に従って使用して、1 マイクログラムの RNA を逆転写しました。 定量的 PCR は、アニーリング温度 60 °C の 2 ステップ サイクルを使用するマシンである CFX96 qPCR (BioRad、Hercules、CA) で 20 μL の SYBR グリーン PCR マスター ミックス (4309155、ThermoFisher) を 2 連で使用して実行しました。 定量化は、Gapdh と Polr2a の幾何平均を正規化として使用する 2-ΔΔcT 法 73 を使用して実行されました 74。 プライマー配列を表 1 に示します。

マイボーム脂質は、クロロホルム:メタノール (3:1、体積:体積) 溶媒混合物による 3 回の連続抽出を使用して、4 °C で外科的に切除したマウス足根板 (各マウスから 4 枚) から抽出しました。 抽出物 (3 x 1 mL) をプールし、圧縮窒素流下 37 °C で溶媒を蒸発させました。 油状残留物を 1 mL の LC/MS 品質イソプロパノールに再溶解し、窒素フラッシュしたクリンパシールした HPLC 2 mL オートインジェクター バイアルに分析前に -80 °C で保存しました。

グラジエントおよびアイソクラティック逆相液体クロマトグラフィー/高分解能飛行時間大気圧化学イオン化質量分析 (LC/MS) 分析は、対応して Acquity UPLC C18 (1 mm × 100 mm; 1.7 µm 粒子) を使用して実施されました。サイズ）および Acquity UPLC C8 カラム（2 mm × 100 mm; 粒子サイズ 1.7 μm）カラム（両方とも米国マサチューセッツ州ミルフォードの Waters Corp. 製）を使用します。マウスおよびヒトのマイバムに関する以前の出版物で詳細に説明されています 75、76、77。 。 実験ごとに 0.5 ～ 1.0 μL のサンプル溶液を注入しました。 Waters Acquity M-Class バイナリー超高性能 LC システム (UPLC、Waters Corp.) を 20 μL/分の流量で操作しました。 分析物は、添加剤として 5% の 10 mM ギ酸アンモニウムを含むアセトニトリル/イソプロパノール均一濃度溶媒混合物を使用して溶出されました。 検体は、高分解能 Synapt G2-Si QToF 質量分析計 [ZSpray インターフェース、IonSabre-II 大気圧化学イオン化 (APCI) イオン源、および LockSpray ユニット (すべて Waters Corp. 製) を装備] を使用して検出されました。 すべての実験は陽イオンモードで実施されました。 脂質のほとんどは、(M + H)+ および (M + H – H2O)+ 付加物として検出されました。 主要な脂質分析物は、MassLynx v.4.1 ソフトウェア パッケージ (Waters Corp.) の EleComp ルーチンを使用して同定されました。 ただし、トリアシルグリセロールやコレステリルエステルなどの一部の化合物は、ソース内で自発的に断片化して (M + H - 脂肪酸)+ 種を生成し、さらに (M + Na)+、(M + K)+ として特徴付けられました。 、および (M + NH4)+ 付加物。 最後に、主要な分析物のクロマトグラフィーの保持時間と質量スペクトルを、本物の脂質標準のそれらと比較しました (入手可能な場合)。 変異マウスのMGリピドームの詳細な解析結果は別途報告する予定である。

MG による総脂質生産量は、最近記載されているように、アイソクラティック LC/MS APCI 実験で記録された脂質抽出物の総イオンクロマトグラムに基づいて推定されました 77。 リピドミクスデータの偏りのない、ターゲットを絞らない分析は、Progenesis QI および EZinfo ソフトウェア パッケージ (Waters Corp.) を使用して実施されました。 主成分分析 (PCA) アプローチを使用して、対照サンプルと cKO サンプル間の差異を評価しました。

各実験について、少なくとも 2 頭の異なる同腹子からの対照と cKO 変異同腹子を比較しました。 データは平均値 ± SD として表示されました。 マン・ホイットニー検定を使用してcKO変異体と対照マウスを比較し、ウィルコクソン符号付き順位検定を使用して同じ腺の異なる領域(腺房と管、およびMGまたは中央管の近位半分と遠位半分)を比較しました。クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を使用して、MG 発生全体にわたる腺あたりの繊毛細胞の割合と MG 発生全体にわたる MG 体積を比較しました。 統計テストは、オンライン Web 統計計算ツール https://astatsa.com/ または RStudio78 を使用して実行されました。 AP 値 < 0.05 は有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

主要な図と補足的な図のソース データは補足データ 1 として提供されます。この研究の結果を裏付ける追加データは、合理的な要求に応じて責任著者 (CI) から入手できます。

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著者らは、このプロジェクトの初期段階での関与について Qing Liu 氏、技術支援についてジョンズ・ホプキンス大学顕微鏡施設のホク・ウェストフォイル氏、パラフィンセクションについてジョンズ・ホプキンス大学の参照組織学中核施設、およびWilmer Cornea Group の有益な意見と議論に感謝します。 この研究は、国立眼科研究所、国立衛生研究所からの助成金 (EY030661 から CI、EY024324 および EY027349 から IB)、ウィルマー眼科研究所への中核助成金 (EY001765)、NIH 所長室からの助成金 ( S10RR024550、ジョンズ・ホプキンス大学の顕微鏡施設、SC Kuo宛）。 アイジンガー家からの助成金による。 ウィルマー・アイ・インスティテュート・シード・ファンドによるCIへの寄付。 RPB からウィルマー眼科研究所への無制限の助成金によるものです。

セリーヌポータル

現在の住所: ソルボンヌ大学、INSERM、CNRS、Vision Institute、17 rue Moreau、F-75012、パリ、フランス

イヴォンヌ・リン、ヴァルニ・ラストーギなどの著者も同様に貢献しました。

ジョンズ・ホプキンス大学医学部眼科ウィルマー眼科、ボルチモア、メリーランド州、21231、米国

セリーヌ・ポータル、イヴォンヌ・リン、ヴァルニ・ラストーギ、サミュエル・チーフン・イー、ジェームス・W・フォスター、カルロ・アイオミニ

ジョンズ・ホプキンス大学医学部、分子および比較病態生物学部、ボルチモア、メリーランド州、21205、米国

コーネリア・ピーターソン

テキサス大学サウスウェスタン医療センター眼科、ダラス、テキサス州、75390、米国

アンバー・ウィルカーソン & イーゴリ・A・ブトビッチ

テキサス大学サウスウェスタン医療センター、生物医科学大学院、ダラス、テキサス州、75390、米国

イーゴリ・A・ブトビッチ

ジョンズ・ホプキンス大学医学部細胞生物学部、ボルチモア、メリーランド州、21231、米国

カルロ・イオミニ

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C.Portal.、IB、CI が研究を考案し、設計しました。 C.Portal、YL、VR、JF、AW、IB、CI は実験を実施し、データを分析および視覚化しました。 C.Peterson と SY は概念的および実験的な指導を提供しました。 IB と CI は資金を獲得しました。 C.Portal、IB、および CI は、すべての著者からの編集とフィードバックを加えて論文を執筆しました。 CI はプロジェクトを監督および管理しました。

カルロ・イオミニへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Duarte Barral と他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Tiago Dantas と Eve Rogers。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Portal, C.、Lin, Y.、Rastogi, V. 他一次繊毛は形態形成中のマイボーム腺の細胞パターンを制御しますが、脂質組成は制御しません。 Commun Biol 6、282 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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受信日: 2022 年 8 月 4 日

受理日: 2023 年 2 月 27 日

公開日: 2023 年 3 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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