人間の嗅粘液の働きと年齢

Scientific Reports volume 13、記事番号: 971 (2023) この記事を引用

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匂い物質は嗅粘液に覆われた嗅覚ニューロンによって検出されます。嗅粘液に関する研究は存在するものの、その成分、機能、個人差については十分に理解されていないままです。ここでは、嗅粘液の収集と嗅覚心理物理学的検査を組み合わせた人体研究について説明します。私たちの分析により、嗅粘液には総タンパク質、無機元素、生体異物代謝分子などの溶質が高濃度で含まれていることが明らかになりました。高濃度により、臭気物質の特定のレパートリーを捕捉または代謝する能力が得られます。私たちは、臭気物質の代謝が私たちの嗅覚を変化させるという証拠を提供します。最後に、嗅粘液の量は年齢に応じて減少します。追跡実験では、臭気物質の受容体による高感度検出における粘液の量の重要性が再現されました。これらの発見は、嗅粘液の分子プロセスの包括的な全体像を提供し、嗅覚低下の潜在的な原因を示唆しています。

臭気物質に関する情報は、危険を発見し、食べ物を選択して味わい、認識するだけでなく他の個人とコミュニケーションするために使用されます。嗅覚能力の低下は、身の危険にさらされるリスクを高め、食欲の低下、身体的および精神的問題、そして最終的には生活の質 (QOL) の低下につながります1,2。 2019 年のコロナウイルス感染症のパンデミックによって、嗅覚障害が頻繁に引き起こされるため、嗅覚の重要性がさらに強調されています 3。嗅覚機能は一般に、加齢やアルツハイマー病などの神経変性疾患の発症に伴って低下します4。高齢化社会が進む中、加齢に伴う嗅覚の低下も急増しています。効果的な治療戦略を開発するには、嗅覚障害の根底にある分子機構を理解することが必要です。

吸入された臭気物質は、鼻腔の上部にある嗅裂 (OC) に到達します。 OC 内に散在する嗅覚ニューロン (OSN) は、約 400 個の嗅覚受容体 (OR) を使って匂い物質を検出し、嗅球を介して匂い情報を高次脳領域に伝えます5。さらに、新たな証拠は、臭気物質が OR によって認識される前に重要なプロセスが発生する可能性があることを示唆しています。哺乳類の OC は、ボーマン腺と支持細胞から分泌される嗅粘液の薄い層で覆われています6。嗅粘液には、臭気物質結合タンパク質（OBP）、代謝酵素、生体無機要素などのさまざまな成分が含まれています7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21。これらの成分は臭気物質と相互作用する能力があるため、揮発性物質を OR の臭気物質結合部位に輸送したり、臭気物質の酵素代謝を通じて非毒性構造および/または臭気物質に対する親和性の高い構造に輸送したりすることにより、ヒトの効率的な嗅覚において重要な役割を果たします。 OR。粘液の継続的な流れは、粘膜の効率的な洗浄と臭気物質の着実な除去を保証する可能性があり、これは臭気物質への曝露後の感度を回復するための重要なステップを構成します。分析に十分な純粋な嗅粘液をサンプリングすることが難しいため、嗅粘液の機能と知覚におけるその重要性についての直接的な証拠はまれです。いくつかの研究では、洗浄された鼻腔から生理食塩水として嗅粘液を取得しており、これにより希釈が生じ、周囲の領域からの不純物が含まれています7、8。人間の参加者から純粋な嗅粘液サンプルを直接収集した研究者もいますが、その機能については限られた洞察しか報告していません9、10、11、13、14。

加齢に伴う嗅覚の低下は 65 歳以上の人口に広く蔓延していますが、治療法は確立されていません。この低下は、感受性、識別、識別、適応からの回復など、嗅覚スキルのいくつかの側面で報告されています23、24、25、26。加齢臭の潜在的な原因がいくつか提案されています27。基底細胞異常を含む神経上皮の年齢依存性変性は、ヒトだけでなく動物モデルでも一貫して観察されています 28、29、30、31、32。この変性は OSN の数の減少につながり、嗅球の萎縮性変化を引き起こします 33,34。以前の研究では、OR の発現レベルの加齢に伴う変化が示唆されました 35 が、別の研究では、OR は老化中に安定した発現パターンを持つことが示されました 36。高次脳領域の変化は、加齢に伴う機能障害に関与しています37。しかし、これらの変化が嗅覚の低下にどのような影響を与えるかは依然として不明である。私たちは、加齢に伴う嗅覚感度の低下と嗅粘液プロテオームとの関連研究を実施しました10。いくつかのタンパク質が嗅覚過敏症と関連していることが判明したが、高齢者の感受性が低下している臭気物質の検出に直接関与しているタンパク質はないようだ。したがって、加齢に伴う嗅覚障害の主な原因はまだ解明されていない。

本研究により、ヒトの嗅粘液の機能と加齢に伴う変化が明らかになりました。私たちは、純粋な嗅粘液の収集と嗅覚検査を組み合わせた研究を実施しました。また、観察された機能的関連性を説明するために、追跡調査の in vitro および in vivo 実験も実施しました。

人間における純粋な嗅粘液の基本的な特性と機能についての説明が不足しています。私たちは、感覚障害のない20～67歳の健康な参加者30名から直接嗅粘液を採取しました。局所リドカインの点滴後、内視鏡を使用した直接視覚下で、中鼻甲介と上鼻中隔の間の嗅覚溝（OC、図1a）、および下鼻甲介と下鼻中隔（INM）の間の嗅覚溝に神経外科用パッドを配置しました。 5 分後、パッドに吸収された嗅粘液を収集し、その後の分析に供しました。

嗅粘液の基本特性と個人差。 (a) この研究で採取された粘液の位置を示す人間の鼻腔の概略図。粘液サンプルを嗅裂 (OC) および下鼻道 (INM) から収集しました。 (b) 30 名の参加者から採取した鼻汁量の分布と中央値 (赤い水平線)。各点は、被験者の左右の鼻孔からの粘液の平均量を表します。 (c) 収集された INM 粘液の量の天候依存性。 INM 粘液の量を OC 粘液の量に対して正規化しました。ひげプロットは、雨天 (n = 6) および晴天 (n = 24) グループの中央値、第 1 四分位数と第 3 四分位数、および上限と下限を示します。 (d) OC 粘液 (n = 30)、INM 粘液 (n = 29)、および唾液 (n = 30) における総タンパク質濃度の分布。 (e) OC 粘液中のタンパク質の量と濃度の相関関係 (n = 30)。（ f – i ）OC粘液（n = 29）、INM粘液（n = 29）、および唾液（n = 30）中のMg、Fe、Cu、およびZn濃度の分布。唾液中には銅イオンは検出されなかった。 (j) OC 粘液中の女性特有の Zn の濃縮。 14 人の女性参加者と 15 人の男性参加者の粘液中の亜鉛濃度がプロットされています。 (k) OC 粘液中の総グルタチオン (tGSH)、酸化型グルタチオン (GSSG)、および還元型グルタチオン (rGSH) の濃度 (n = 30)。（ l ）細胞培養培地に補充されたCuCl2の濃度を増加させた場合の、0.1 mMまたは1 mMのtert-ブチルメルカプタン（tBM）に対するOR2T11発現HEK293T細胞の活性化の用量反応分析。データは、3 回の独立した実験からの平均値 ± SE として示されています。 OR2T11 なしでトランスフェクトされた細胞もアッセイされました (モック)。 (m) OC 粘液中の Cu 濃度と嗅覚閾値スコアとの間に有意な関連性は見られませんでした (n = 28 参加者)。スピアマン相関も統計的に有意ではありませんでした (P > 0.05)。有意性はマンホイットニー U 検定で評価されました。 *、P = 0.0255; **、P = 0.0043。

収集された粘液サンプルの量は参加者間でかなり異なり、正規分布に従っていませんでした（P < 0.01、シャピロ・ウィルク正規性検定、図 1b、補足表 1）。 OC 粘液サンプルの重量は、30 人の参加者において鼻腔あたり 7 ～ 144 mg (中央値、36.9 mg) の範囲であったのに対し、INM 粘液サンプルの重量は 0 ～ 135 mg (中央値、45.2 mg) の範囲でした。独立した手順によって鼻孔の両側から収集された OC 粘液の量には相関関係があったため、これらの変動は技術的な問題によって引き起こされたものではありません (スピアマンの rho = 0.50、P < 0.01)。この結論は、各被験者から得られたOC粘液量とINM粘液量との間の有意な関連性によっても裏付けられ（スピアマンのrho = 0.56、P <0.01、補足図1a）、収集された粘液量の個人差が原因であることを示唆しています内因性要因による。

INM 粘液量の個人差は、サンプリング日の固有因子および湿度という環境因子と関連していました。 INM粘液の量は、晴天（相対湿度、42％）で収集された場合、雨天（71〜100％）よりも少ないようであり、INM粘液の脱水が示唆されています（補足図1b）。対照的に、収集されたOC粘液の量は天候によって異なりませんでした。 INM粘液の天候依存性は、OC粘液の量を個別に変化させて正規化した値として分析した場合に有意でした（図1c）。したがって、INM 粘液は、吸入した乾燥した空気が OC 粘液に到達して脱水する前に加湿するのに重要です。そうしないと、気管気管支粘膜で報告されているように、OC 粘液の機能が損なわれます 38。一方、天候に依存しないことから、OC 粘液の量の個人差は主に内因子に起因することが示唆されています。

OC 粘液の基本的な特性、特に総タンパク質と無機元素の濃度についてはほとんど説明されていません。この研究では、まず PierceTM ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを使用して、サンプリングされた体液の総タンパク質濃度を測定しました (図 1d)。 OC 粘液には、INM 粘液や唾液よりも高いタンパク質濃度が含まれていました。注目すべきことに、OC粘液のタンパク質濃度も個人間でかなり異なり、6.2〜20.8 mg/mLの範囲であり、OC粘液の収集量と負の関係を示しました（図1e）。

高度な生体異物代謝には、その活性中心を構成する高濃度の酵素と無機元素が必要です。唾液の Cu を除くすべてのサンプルから、4 つの微量生体無機元素 (Mg、Fe、Zn、Cu) の濃度を定量することに成功しました。他の 5 つの元素、Al、Cr、Mn、Ni、Co の濃度は定量下限 (OC および INM 粘液については 100 ppb、唾液については 5 ppb) を下回っていました。全体として、OC 粘液には、Zn を除いて、INM 粘液または唾液よりも高濃度の無機元素が含まれていました（図 1f–i）。亜鉛の濃度はOC粘液とINM粘液の間で差がなく、女性特有の濃縮を示しました（図1j）。生体異物の代謝と解毒の目的と一致して、OC粘液中の低分子量抗酸化物質であるグルタチオン39の濃度が個別に異なることが検出されました（図1k）。グルタチオンの濃度は鉄濃度と相関していました（補足図1c）。参加者からの等量の INM 粘液の混合物からも同様の濃度のグルタチオンが検出されました: 163 μM の酸化型グルタチオン (GSSG) と 23 μM の還元型グルタチオン (rGSH)。対照的に、唾液には検出可能なレベルのグルタチオンは示されませんでした。

OC 粘液中の Cu の高濃度は、血清中の濃度と比較した場合でも顕著でした (平均濃度: OC 粘液中 4.8 ppm (75 μM) 対血清中 1.1 ppm)。鼻洗浄液の測定 (42 μM)15,40。 OSN が硫黄臭気物質の高感度検出に Cu を利用しているという事実を考慮すると、この結果は合理的であると思われます 15。 OC粘液中のCu濃度は12.6〜189μMの範囲であり、硫黄化合物であるtert-ブチルメルカプタン（tBM;図1l）に対するOR発現細胞の応答性を高めるのに有効な濃度範囲と同様でした。しかし、この変数は、tBMに対する嗅覚感度の個人差を説明しませんでした（図1m）。この矛盾は次のことを示唆しています。(1) タンパク質に結合した Cu イオンと遊離 Cu イオンを識別するための方法論的な限界。 (2) 以前に示唆されているように、硫黄臭気物質を検出する OR の遺伝的変異など、より支配的な要因の存在。

OC 粘液の重要な機能的側面は、OBP の機能に基づいて提案されています。それらの臭気物質結合能力の目的は、疎水性臭気物質を効率的に可溶化し、それらをORに送達することであると考えられてきた9、22、43、44。ただし、これは人工的に生成された OBP を使用した in vitro 分析のみに基づいています。したがって、OC粘液自体がこの能力を持っており、結合した臭気物質の嗅覚に寄与しているかどうかは不明のままです。

少なくとも 2 つの推定上の OBP がヒト嗅粘液で発現されていましたが、それらの臭気物質結合活性は特徴付けられていませんでした。この研究では、OC粘液の臭気物質捕捉活性を評価しました。 OC 粘液を調査する前に、我々は実験を確立するために、よく特徴付けられている哺乳類の OBP である Sus scrofa 臭気物質結合タンパク質 1 (pigOBP) を使用しました 45,46。まず、精製した組換え pigOBP を、蛍光リガンド 1-アミノアントラセン (1-AMA) を使用した十分に確立された競合結合アッセイに供しました 44、45、46。 pigOBP と 1-AMA 複合体からの蛍光が既知のリガンドであるシトロネロールの結合により消光されるという以前の研究の結果が確認されました (図 2a-c)46。この結合アッセイを使用して、アンブレトリド (Amb) と l-メントンは、pigOBP に対して高い親和性を持つ新規リガンドとして同定されました (図 2b、c)。競合結合アッセイでは複数の臭気物質を試験するために大量の OC 粘液が必要であるため、異なるタイプの実験が使用されました。 pigOBP 溶液をガラスバイアル中で調製し、3 つのリガンドと混合しました (図 2d)。 pigOBP 溶液からヘッドスペースに放出されたリガンドの量を吸収し、固相マイクロ抽出 (SPME) に続いてガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) を使用して測定しました。競合結合アッセイにおいて pigOBP に対する親和性が高いリガンドは放出が遅くなり、ヘッドスペース内の濃度が低くなりました (図 2e、f)。放出の遅延は、競合リガンド1-AMAの添加によってブロックされたため、pigOBPの臭気物質捕捉特性によって引き起こされました（図2g）。これらのデータは、ヘッドスペース内の臭気物質の量に基づいて粘液サンプルの臭気物質捕捉活性を評価するための実験を検証した。

嗅粘液の臭気物質捕捉特性。 (a) 臭気物質に対する pigOBP の競合結合アッセイ。データは、ビヒクル (Tris-HCl)、10 μM pigOBP、1 μM 1-AMA、およびそれらの混合物からの蛍光を表します。 (b) pigOBP-1-AMA 複合体が増加する濃度の臭気物質に曝露されたときの蛍光の変化。蛍光は、ビヒクルおよびpigOBPと1-AMAの混合物からの値を使用して正規化した。エラーバー、3 回の反復にわたる標準偏差。 (c) 臭気物質の化学構造。 (d) 臭気物質のヘッドスペース濃度に基づく臭気物質結合能力を定量化するための実験手順。 (e、f) pigOBP の臭気物質捕捉能力。 pigOBP溶液から放出される3つの臭気物質を抽出し、SPME-GC/MSで分析しました。 (e) pigOBP は、用量および親和性に依存して溶液からの臭気物質の放出を減少させました。 (f) 臭気物質濃度に応じた 30 μM pigOBP の臭気物質捕捉特性。 (g) pigOBP 溶液からの 1-AMA 誘発臭気物質放出の添加。データはピーク面積パーセントとして示されており、pigOBPを含まない臭気物質溶液から検出されたピーク面積が100%に設定されています。 (h) OC 粘液の臭気物質捕捉能力の個人差。 10 倍に希釈した OC 粘液から放出される臭気物質の相対ヘッドスペース濃度。臭気物質には、最終濃度が 500 μM になるようにエタノールを加えました。 OC粘液を含まない各臭気物質のピーク面積は、エタノールのピーク面積で正規化した後、100%に設定されました。 (i) OC 粘液の能力の臭気物質濃度依存性。 10 倍に希釈した OC 粘液から放出される臭気物質の相対ヘッドスペース濃度 (最終濃度は 5 ～ 500 μM)。 (j) 臭気物質捕捉能力と OC 粘液のタンパク質濃度の相関関係 (n = 28)。 (k) 臭気物質捕捉能力とAmbに対する知覚感受性との関連性。 OBP、臭気物質結合タンパク質。 PEA、フェニルエチルアルコール。

30 人の参加者から得た等量の OC 粘液の混合物の臭気物質捕捉特性が調査されました。以下の 3 つの臭気物質をテストしました。(1) Amb、pigOBP に対して最も高い親和性を持ちます。 (2) ムスコン、その優れた香りの性質により重要な香料。 (3) フェニルエチルアルコール (PEA)。三叉神経への影響が小さいため、嗅覚研究に使用される最も一般的な臭気物質です 47。 3 つの臭気物質のヘッドスペース濃度は、OC 粘液と混合した場合、INM 粘液、唾液、または生理食塩水と混合した場合よりも著しく低かったが、収集されたサンプルの量が限られていたため、統計分析に必要なアッセイの反復を行うことはできませんでした（補足図）。 2)。 Amb の能力は依然として明らかであり、OC 粘液を 10 倍希釈で適用した場合でも個人差が示されました (図 2h)。この徐放は、OC粘液と混合したAmbの濃度に依存しており、観察されたpigOBPの特徴と一致していた(図2i)。ヘッドスペース内の Amb 濃度の低下が OC 粘液の分解によって引き起こされた可能性は排除できます。これは、有機溶媒で抽出して GC/MS で分析すると、OC 粘液中に残っている Amb が検出可能であったためです (Amb の 81% が食塩水から抽出されました)。 Amb捕捉特性は、OC粘液中のタンパク質濃度と正の相関がありました（図2j）。

次に、OC粘液の臭気物質捕捉活性が知覚と関連しているかどうかを調査しました。その結果、それらの間に相関関係は観察されなかったため、それがAmbの高感度検出の決定要因ではないことが示されました（図2k）。 OC 粘液に Amb の捕捉活性が完全に欠如していた 2 人の参加者は、30 人の参加者と比較して平均的な知覚感度スコアを示しました (7.5 および 3、0 ～ 15 以内、平均スコア: 4.9)。要約すると、この研究は、ヒトのOC粘液が嗅覚過敏性と関連しない有意な臭気物質結合能力を示すという証拠を提供する。

次に、ヒトOC粘液の代謝能力とその個人差について説明します。まず、OC 粘液関連サンプルで代謝されることが報告されているため、実験用に 6 つの臭気物質が選択されました (エステル: p-クレシル酢酸 [pCA] 1 およびトランス-2-ヘキセニル酢酸 15; アルデヒド: ベンズアルデヒド 23 およびオクタナール 25;ケトン: 2'-メトキシアセトフェノン 28 およびアセトフェノン 30)7,20,48,49。これらの臭気物質は、収集された OC 粘液 (すべての参加者からの等量の混合物) と混合され、その酢酸エチル抽出物が GC/MS を使用して分析されました。結果は、OC粘液が以下の代謝を誘導することを示した：エステルの加水分解により、p-クレゾール2（代謝産物のトータルイオンクロマトグラム（TIC）ピーク存在比として99％）およびトランス-2-ヘキセノール16（16％）が生成される。そしてアルデヒドの還元と酸化により、ベンジルアルコール24（51％）、オクタノール26（33％）、およびオクタン酸27（50％）が生成されます。図3a〜d、補足図3a）。しかし、2 つのケトン、2'-ヒドロキシアセトフェノン 29 とサリチル酸メチル 31 に由来する代謝産物は、それらを酸化する CYP の遺伝子発現が OC50 で報告されているにもかかわらず、検出されませんでした。

嗅粘液の酵素活性。（a〜d）嗅裂（OC）粘液の推定酵素活性と結果として生じる代謝産物の検出。臭気物質は生理食塩水または OC 粘液中でインキュベートされました。反応物を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）で分析した。全イオンまたは抽出されたイオンのピークの強度を、OC粘液媒介変換を受けなかったエステル19のピーク面積に対して正規化した。灰色と青色のバーは、それぞれ正規化された総イオン強度 20,000 と 2000 を表します。黄色のバーは、抽出されたイオン強度 50 を表します。(e) OC 粘液と下鼻道 (INM) 粘液および唾液の酵素活性の比較。各酵素変換における生成物の量は、OC 粘液中の代謝産物のピーク面積を 100% に設定した正規化値として表示されます。 (f) OC 粘液の酵素活性の個人差およびタンパク質濃度との関連。個々の × 10 OC 粘液のエステラーゼ活性は、酢酸 p-クレジル ( pCA) を OC 粘液に適用しました (n = 29)。 (g) エステラーゼ活性と OC 粘液中のカルボキシルエステラーゼ 1 (CES-1) 濃度との関連 (n = 29)。緑とマゼンタの線は、それぞれ INM と OC 粘液の平均値を示します。 (h) OC 粘液と CES-1 の基質選択性。組換え CES-1 は OC 粘液と同一の反応性を示さなかった。 OC粘液は、CES-1を完全に阻害するCES阻害剤(ビス(4-ニトロフェニル)リン酸)下で残留活性を示した。検出されたピーク面積のサンプル間の変動は、代謝されていないエステル 19 のピーク面積を使用して補正されました。 (i) 10 倍に希釈した OC 粘液または CES-1 溶液における pCA から p-クレゾールへの変換率の時間経過。反応は、10 倍希釈 OC 粘液中では pCA の添加後 5 分間まで、CES-1 溶液中では 40 分間まで直線的に進行しました。（ j ）10倍に希釈したOC粘液またはCES-1溶液におけるpCA代謝のミカエリス-メンテンプロット。さまざまな濃度の pCA を添加し、各時点での変換率を測定しました。 ND、検出されません。

エステルの加水分解に対する OC 粘液の顕著な能力により、我々は構造と活性の関係を調査することになりました。追加の実験を行って、pCA を陽性対照として一連のエステル臭気物質をテストしました (代謝産物の TIC ピーク存在比として 97%)。結果は、OC 粘液がフェノールエステル (酢酸 2-フェニルエチル 3 [43%]、酢酸アニシル 5 [8%]、酢酸シンナミル 7 [16%])、脂環式エステル (酢酸 1-メンチル 9 [14%]) を変換したことを示しました。 ])、脂肪族エステル (酢酸シス-3-ヘキセニル 11 [19%]、酢酸シトロネリル 13 [25%]、図 3a)。対照的に、立体障害のあるエステル (酢酸リナリル 17、酢酸テルピニル 19、および酢酸イソボルニル 21) は変換されませんでした。観察された代謝は、INM粘液または唾液よりもOC粘液によってより顕著に誘導され、OC粘液中の溶質濃度が高いことと一致しました（図3e、補足図3b）。

次に、OC粘液のエステラーゼ活性の個人差を、pCAからp-クレゾールへの変換に焦点を当てて分析した。反応はpCAの添加後最大5分間直線的に進行したため、比較は5分の変換率に基づいて行われました（図3iを参照）。 1 人の参加者は、収集された粘液の量が不十分だったため、この分析から除外されました。変換率 (モル比) は参加者間で大きく異なり、5 ～ 45% の範囲であり、平均値は 18% でした。エステラーゼ活性は、OC粘液の量と負の相関があり、総タンパク質などのさまざまな成分の濃度と正の相関がありました（図3f、補足表1）。

OC粘液中で高いエステラーゼ活性を引き起こす分子も調査されました。 CES-1 は、げっ歯類を用いた以前の研究でこの反応に寄与すると推定されていました 7。酵素免疫吸着法 (ELISA) により、CES-1 濃度は INM 粘液や唾液よりも OC 粘液の方が高いことが示されました (平均濃度: 5.73 μg/mL、1.24 μg/mL、および 0.06 μg/mL、それぞれ、図3g）。しかし、CES-1 は OC 粘液のエステラーゼ活性を完全には説明していませんでした。 OC粘液中のCES-1濃度は、総タンパク質の濃度よりもエステラーゼ活性の個人差が小さかった（44％対53％、図3f、g）。さらに、OC 粘液は、組換え CES-1 溶液とは異なる基質選択性を示しました。組換えCES-1は、酢酸アニシル5および酢酸シトロネリル13に対するOC粘液の反応性を再構成しなかった（図3h）。さらに、OC粘液は、CES阻害剤のベンジルおよびリン酸ビス（4-ニトロフェニル）（BNPP）下で残留活性を示し、等濃度の組換えCES-1によって媒介される反応を完全に阻害しました（図3h、補足図3c）。最後に、同等の濃度の組換えCES-1を含む溶液は、酵素動態分析においてOC粘液よりも低い反応性を示しました（図3i、j）。これらの結果は、酵素活性を担う別の酵素の存在を示しました。

以前の研究では、人間の唾液中の臭気物質の酵素変換率が低いと、臭気の知覚にわずかに影響を与えることが報告されました8。我々は、OC粘液の劇的なエステラーゼ活性が基質の臭気知覚に大きな影響を与えているという仮説を立てました。我々は、以前の研究8に基づいて嗅覚適応パラダイムを使用して感覚研究を実施しました。嗅覚順応は、同一の臭気物質に長期間曝露された後の臭気物質特有の感度の低下という現象として広く知られています (図 4a、b)51。したがって、現在の研究では、p-クレゾールに対する嗅覚感受性は、p-クレゾールへの事前曝露後に減少しましたが、ムスコンの長時間の匂いによっては誘発されませんでした（図4c、d）。対照的に、pCAの事前曝露は、その代謝物であるp-クレゾールの知覚強度の有意な減少を誘発し、これはpCAがOC粘液中でp-クレゾールに変換されることを示唆している。この結果の別の説明は、pCAの匂いを嗅ぐとORの脱感作が誘発され、これがp-クレゾールの認識に主要な役割を果たしているというものである。しかし、我々の in vitro アッセイの結果では、この可能性は排除されました。 HEK293T細胞で発現した378個の試験されたヒトORの中で、OR9Q2がp-クレゾールに対して最も感受性の高い受容体であることが判明した（図4e、補足図4）。その後の機能特性評価により、OR9Q2 は pCA に対して感受性がないことが示されました (図 4f、g)。したがって、pCA による適応が p-クレゾールによる例外的な適応と一致する理由は、pCA から p-クレゾールへの変換が鼻腔内で起こるためです。しかし、生体内での反応速度論に関する情報が不足しているため、人間が pCA の匂いを嗅いで pCA の代謝と p-クレゾールの生成の混合物を知覚するかどうかはまだ不明です。

酵素変換が知覚に及ぼす影響。 (a、b) 嗅覚受容体 (OR) の異なるサブセットの活性化および脱感作による、p-クレゾールまたは酢酸 p-クレシル (pCA) の嗅覚適応を示すモデル。 (c) 実験適応スキームと官能評価。各被験者は、1 番目のボトルと 3 番目のボトルの知覚強度を評価しました。どちらも p-クレゾールが染み込んだ綿球が入っています。 2 番目のボトルには、蒸留水 (無臭)、p-クレゾール、ムスコン、または pCA といった適応刺激が含まれていました。参加者は、p-クレゾールの匂いを嗅ぎ、無臭から強い臭気まで95mmスケールで知覚された臭気の強度を記録するように依頼されました。 (d) 各試験サンプルに長時間暴露した後の p-クレゾールの知覚強度の変化 (n = 8)。対照（無臭）と比較した統計的に有意な変化は、等しくない標準偏差を用いた一元配置分散分析（ANOVA）およびホルム・シダックの多重比較検定によって決定されました。 *、P = 0.0303; **、P = 0.0012。 (e) p-クレゾールについてのヒト OR のスクリーニング。 x 軸に沿って列挙された 378 個の OR のそれぞれが HEK293T 細胞で発現され、p-クレゾール (1 mM) で刺激されました。 OR の活性化は、CRE 制御ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用してモニタリングされました。 y 軸は、刺激された細胞からのシグナルを同じ OR を発現する非刺激細胞からのシグナルで割った OR 活性の増加倍数を示します (2 回のスクリーニング反復からの平均値)。 (f、g) OR9Q2 活性化のカルシウムイメージング。 (f) 応答細胞の代表的な応答追跡。トレースの周囲の紫色の縦線は、50 セルからの標準偏差を表します。トレースの上の水平線は、1 mM pCA および 0.3 mM p-クレゾールによる刺激の継続時間を示します。（ g ）3回の独立した実験からの、0.3 mMまたは1.0 mMの各臭気物質に応答する細胞の割合（平均±SE）。（ h ）l-メントールおよびl-酢酸メンチルによる一過性受容体電位メラスタチン8（TRPM8）活性の用量反応曲線。 HEK293T細胞で安定して発現したTRPM8におけるカルシウムイオン流入依存性の蛍光を測定した。蛍光強度は4μMイオノマイシンで正規化しました。データは 3 回の独立した実験からのものです (平均 ± SE)。

人間の匂いを嗅ぐ時間は 1 ～ 2 秒です。私たちは、酵素変換の反応速度が、嗅ぎの中での知覚に影響を与えるほど十分に速いかどうかを調べました。基質と混合した製品のみに由来する特定の臭気質の発生を評価することは困難であるため、より明確な指標として、身近な体性感覚である冷却を使用した。 l-メントール 10 またはその酢酸塩、酢酸 l-メンチル 9 を嗅ぐと清涼感が引き起こされ、これは明らかに評価可能です52。冷感は、体性感覚ニューロンの一過性受容体電位メラスタチン 8 (TRPM8) の活性化によって引き起こされる可能性が最も高くなります 53。 l-メントール10とは対照的に、酢酸l-メンチル9はTRPM8活性を示さなかった(図4h)。この矛盾は、サンプリングされたOC粘液を使用して実証されたように、酢酸l-メンチル9を代謝してl-メントール10を生成するin vivoのOC粘液活性の存在の証拠を示しています（図3a）。さらに重要なことは、この結果は、酵素による変換反応が、嗅ぐだけで匂いの知覚に影響を与えるのに十分な速さであることを実証していることです。したがって、鼻の外側の化学的性質の知覚スナップショットは、知覚する前に嗅粘液によって編集されます。

嗅覚感度は一般的に年齢とともに低下します。有意な年齢関連の低下を示した以前の研究の参加者よりも若い参加者（年齢範囲：20～67歳）をテストしたところ、年齢と2つの臭気物質（PEAおよびtBM）に対する嗅覚感度との間に負の関係は検出されませんでした（補足図5)。対照的に、現在の研究では、Ambに対する知覚感度が年齢に依存して低下することがわかりました（rho = - 0.45、P < 0.05、図5a）。この結果は、私たちのOC粘液サンプルが、加齢に伴う嗅覚の低下のある参加者のグループから収集されたことを示しました。したがって、加齢に応じた変化と嗅覚感度の低下を示すOC粘液サンプルから候補因子を特定することができました。

加齢に伴う嗅覚の低下と嗅裂粘液の変化との関係。 (a – f) 年齢に関連する要因。 X 軸は参加者の年齢を示し、Y 軸はアンブレトリドの嗅覚閾値 (Amb; a、n = 28)、嗅裂 (OC) 粘液の量 (b、n = 30)、下嗅覚の量を表します。鼻道（INM）粘液（c、n = 30）、OC 粘液中のタンパク質濃度（d、n = 30）、10 倍に希釈した OC 粘液中での p-酢酸クレジル（pCA）から p-クレゾールへの変換率（e 、n = 29)、およびOC粘液から放出されるAmbの相対ヘッドスペース濃度(f、n = 28)。 (g) 嗅粘液の年齢依存的変化をグラフでまとめたもの。 OC粘液は加齢とともに量が減少し、成分濃度が増加します。（h）異なる量の培地（0〜50μL）で覆われた嗅覚受容体（OR）発現細胞の活性化をアッセイするための実験手順。これは、OC粘液量の年齢依存的減少を模倣します。臭気物質(100μM)で飽和させた綿球を各プレートウェルの細胞の上に置いた。 (i、j) 蒸気相から拡散する Amb または p-クレゾールに対する cOR5A2 または OR9Q2 発現細胞の応答。応答は、50 μL 条件での最大応答で正規化されました。各線は、3 つの独立した実験からの平均応答を示しています。縦の陰影は標準誤差を表します。

さまざまな加齢関連要因が嗅覚感度の低下を引き起こす可能性があると提案されています10、27、28、29、30、31、33、34、35、37。しかし、これらの候補因子の変化を嗅覚感度の低下と結び付ける機械的な説明の例はまだありません。この研究では、年齢に応じた新たな変化が発見されました。 OC粘液量の前述の個人差は、年齢と有意に相関していました（rho = 0.66、P < 0.001、図5b）。高齢の参加者は若い参加者よりもOC粘液の量が60％少ないことが示されました（平均：20代の参加者では59.1±21.0mg、60代の参加者では23.5±10.6mg）。 INM粘液も年齢に依存して減少したため（rho = - 0.35、P = 0.056）、したがって、OC粘液を加湿するのに十分に機能しなくなりました（図5c）。対照的に、タンパク質濃度と酵素活性は増加し、OC粘液の量の減少が水分含有量の減少によって引き起こされたことを示しました（図5d、e）。加齢に伴うOC粘液中の総タンパク質濃度の増加にもかかわらず、Ambの捕捉活性は強化されませんでした（図5f）。これはおそらく推定上のOBPの特異的な減少および/または他の未知の因子の存在によるものと考えられます。）アクティビティに関連付けられた10。

加齢に伴う溶質濃度と酵素活性の増加は、硫黄やエステルなどの限られた範囲の臭気物質に対する臭気識別能力の障害を説明できる可能性があります。しかし、Amb (図5a) や他の一般的な臭気物質に対する嗅覚の障害は説明できません。むしろ、OC粘液の量の減少は、OSNの脂質二重層への脱水媒介損傷とOR構造の歪みによる、一般的な臭気物質に対する嗅覚感度の低下を説明する可能性が高い。これは以前の研究と一致しています。ある研究では、マウスの嗅粘液の量が減少すると嗅覚感度が低下することが実証されました54。別の研究では、生まれたばかりのウサギの粘液量を増やすと嗅覚感度が上昇することが報告されました16。

現在の研究では、臭気物質に応答したOR活性化に対するOC粘液量の減少の影響を再構成しました（図5g、h）。臭気物質を液相で刺激した多くの以前の研究8、15、19、41とは対照的に、各ORを発現するHEK293T細胞に気相で臭気物質を提示することで、より実用的な条件下でORの活性化を評価できるようになりました。。臭気物質溶液で飽和させた綿球を、96 ウェルプレートの各ウェルの細胞の上に置きました (図 5h)。綿球から揮発した臭気物質は培地を通って OR 発現細胞に到達し、その応答はリアルタイム GloSensor™ を使用してモニタリングされました。不揮発性細胞刺激剤（すなわち、フォルスコリン）を試験したときに反応が観察されなかったという発見によって示されるように、気相刺激が観察された。 Amb および p-クレゾールの気相に対する OR5A2 (以下、cOR5A2) および OR9Q2 のコンセンサスバージョンの活性化をモニタリングしました 55。結果は、OR 発現細胞をカバーする培地の量が少ないと最大応答が低下することを示しました。培地の量を60％減らすと（50μLから20μLに）、cOR5A2とOR9Q2の応答振幅はそれぞれ33％と35％に減少しました（図5i、j）。この実験では、OC 粘液の物理的および生化学的特性は再構成されませんでした。 HEK293T 細胞に対する OC 粘液のかなりの毒性により、より生理的な条件での実験が妨げられました。したがって、OC 粘液量の違いが OR 活性化に異なる影響をもたらした可能性を排除することはできません。それにもかかわらず、これは、潜在的なメカニズムの説明とともに、加齢に応じた嗅覚感度の低下の原因因子を提案した最初の研究である。

本研究では、ヒトのOC粘液の特徴について詳しく説明しました。 OC 粘液には、総タンパク質、無機元素、グルタチオンなどの溶質が他の体液よりも高濃度で含まれています。私たちの機能分析により、以前に示唆されていたOC粘液の機能と香りの知覚へのその寄与に関する結論が得られます。 OC 粘液は顕著な臭気物質捕捉能力を示しますが、これは臭気物質に対する知覚過敏性を説明するものではありません。さらに、今回の研究では、OC粘液における臭気物質の代謝が知覚に関与していることが判明した。最後に、本結果は、加齢に伴う嗅覚感度の低下の潜在的な原因として、OC粘液量の年齢依存的な減少を示しています。

この研究により、OC粘液中の溶質の濃度とその個体差が明らかになりました。我々の結果は、臭気物質結合能力、高度な生体異物代謝、銅を介した臭気認識など、OC 粘液機能のこれまでの影響を説明する重要な情報を提供します9,41,43。さらに、今回のデータは、以前に報告されたタンパク質組成と併せて、OC 粘液の再構成を可能にし、d ブロック要素としての Zn や性特異的特性としての Zn など、新たな特性の機能的重要性を調査するのに役立ちます 56,57。 OC 粘液の想定される機能は嗅覚に限定されず、有害な化合物から OSN を保護したり、感染を予防したりすることが含まれます。開示された生データは、嗅粘液の機能を複数の観点から理解するための将来の研究の基礎を提供します（補足表1）。

OC 粘液の最も広く想定されている機能は、OBP を介した臭気物質の輸送と濃縮です。実際、最近の研究では、OR による臭気物質の認識におけるヒト OBP の潜在的な機能がテストされました。しかし、彼らはリガンドを一切含まずに人工的に生成された OBP をテストしました。したがって、OC粘液が臭気物質を捕捉してその感知を促進する能力があるかどうかという問題は未解決のままでした。私たちの in vitro および in vivo 実験では、OC 粘液には劇的な臭気物質結合能力があると結論づけました。しかし、嗅覚の感受性の個人差については説明できませんでした。これは、すべての OBP 遺伝子が欠失した場合でも同等の感度で臭気物質に応答できる昆虫モデルの結果と一致しています 58。我々は、OC粘液の臭気物質捕捉活性がOSNの微小環境から臭気物質を迅速に除去して、長期にわたる適応から確実に回復し、有害物質の蓄積による損傷を防ぐことに貢献しているのではないかと推測している59。

この研究では、動態解析により OC 粘液のさまざまな高度な生体異物代謝が明らかになりました。最近の 2 つの研究では、選択された臭気物質に対するヒト OC 粘液由来サンプルの酵素活性が報告されています 8,14。ただし、これらの研究は人工的な条件下でサンプルを評価しました。ある研究では、洗浄された鼻腔から生理食塩水として OC 粘液が得られましたが、これにより、下鼻道 (INM) からの粘液など、周囲領域からの不純物の希釈と混入が引き起こされた可能性があります 8。実際、この研究では、OC粘液の比較的高い酵素活性は検出されませんでした。別の研究ではOC粘液を直接収集しましたが、アルデヒドの減少は補酵素を補充した希釈OC粘液でのみ検出されました14。現在の研究では、希釈や処理を行わずにOC粘液をテストし、より広範囲の臭気物質に対するその活性を調査しました。特に、酵素活性の個人差は反応速度論に基づいて決定されており、エンドポイント測定に基づいて以前に報告された比較よりも正確な情報が提供されます8,14。私たちの結果は、無傷のOC粘液が臭気物質を変換する優れた能力を持っていることを実証しました。 INM粘液が吸入臭気物質の酵素変換のためのより広い表面積を提供するという事実を考慮すると、単位質量当たりのINM粘液の容量がOC粘液よりも低いことが、知覚に大きく寄与する可能性が高いことに注目します。この能力の解明により、十分なレベルの酵素変換を達成した後にのみ OR を活性化するプロ臭気物質の設計が可能になる可能性があります。

この研究での最も重要な発見は、年齢に依存したOC粘液量の減少でした。私たちの観察と一致して、これまでの研究では、老化が水分恒常性の異常を引き起こし、粘液が薄くなり、他の組織の機能が低下することが示されています60、61、62。鼻腔ではボーマン腺の加齢変性と粘液分泌が観察されました28。水分含有量の減少と溶質濃度の増加は、おそらく乾燥を介した OSN の機能不全を引き起こすだけでなく、粘液層の粘度の増加にもつながります。これにより、吸収された臭気物質の拡散速度が低下し、その結果、OSN による臭気物質分子の検出効率が低下します。粘液濃度の増加（つまり、脱水）は、粘液の流れの速度を低下させ、臭気物質を含む物質を除去することが知られています63,64。粘液の除去が遅くなり、量が減少すると、有害な揮発性物質や感染性微生物の蓄積が相乗的に増加し、神経上皮やボーマン腺が損傷され、老化が促進される可能性があります。今回の証拠は、OC粘液中の水分の回収が、高齢者のQOL低下の原因である嗅覚障害の有効な治療法となる可能性を示唆している。

参加者は雪だるま式サンプリングによって集められ、報酬が支払われました。 20歳から60歳までの日本人成人30人が研究に参加した。参加者には、病歴や鼻内視鏡検査に基づく副鼻腔炎症の主観的または客観的な証拠はありませんでした。妊婦は除外されました。研究プロトコールは花王株式会社および江戸川病院の倫理審査委員会によって承認され（承認番号：T141-180620）、ヘルシンキ宣言原則に従って実施されました。すべての参加者はインフォームドコンセントを提供しました。

3 つの化合物 (PEA、Amb、および tBM) の嗅覚閾値が測定されました。臭気物質の購入源を補足表 2に示します。感覚閾値は、3 つの代替強制選択手順を使用して、無臭の鉱油 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で希釈した臭気物質を使用して収集されました。臭気物質溶液の最高濃度は次のとおりです。PEA 1000 ppm。 Amb 10,000 ppm。 tBMは1ppmです。これらを２倍に１５倍に希釈し、各臭気物質の１６希釈液を調製した。各試験では、参加者にランダムな順序で 3 セットのボトルが提示されました。1 セットには臭気刺激物質が含まれ、他のセットには希釈剤 (ブランク) のみが含まれていました。各セットを順番に嗅いだ後、参加者は臭いの入ったボトルを特定するよう求められました。認識や品質の識別は必要ありませんでした。誤った検出ごとに、次に低い濃度が提示されました。最初の試行は最低濃度で開始し、2 回連続して正しく検出された場合、2 番目の試行では 4 倍高い濃度が提示されました。 2 回目の試験で 2 回連続して正確に検出された場合、臭気物質が正しく特定されるまで、次に高い濃度が与えられました。 2 回目の試験で臭気物質の最初の濃度が特定されなかった場合は、次に低い濃度が提示されました。最初と最後の正しい検出の平均濃度が閾値スコアとして特定されました。濃度は溶液の希釈時間 (15 ～ 0) として表示されました。最低濃度の検出は 15 としてスコア付けされ、最高濃度の誤検出は 0 としてスコア付けされました。2 人の参加者の閾値テスト中にプロトコルに間違いがあったため、彼らの閾値スコアは除外されました。

口を水ですすいだ後、全唾液をプラスチックチューブに直接採取した。サンプルを遠心分離し（10,000 rpm、10分間）、必要になるまで-80℃で凍結しました。唾液は臭気閾値検査と同日に全量採取され、嗅粘液は1～3週間後に江戸川病院で採取された。粘液サンプルは、神経外科用パッド (BEMSHEETS XR、0.7 × 0.7 cm、KAWAMOTO Corporation、大阪、日本) を使用して収集されました。パッドは最大約 150 mg の水を吸収でき、収集された粘液の量はすべて 150 mg 未満でした。次にパッドを、20ゲージの針で底に穴を開けたチューブの中に入れました。別のチューブを穴の開いたチューブの下に置き、遠心分離しました（10,000 rpmで10分間）。採取した鼻汁は使用するまで−８０℃で冷凍保存した。 1 人の被験者では、左右どちらの鼻腔からも INM 粘液が採取されませんでした。ある被験者では、採取中に左側の INM に置かれたパッドが口に落ちました。右鼻腔から採取した INM 粘液のみをすべての分析に使用しました。嗅粘液を 5 日間収集しました (参加者 6 名/日)。この時期、天気は晴れの日もあれば雨の日もありました。

タンパク質濃度は、BSAを標準としてBCAタンパク質アッセイを使用して決定されました。 CES-1の濃度は、CES-1 ELISAキット(RayBiotech; Peachtree Corners、GA、USA)を使用して測定した。グルタチオン濃度は、GSSG/GSH 定量キット (DOJINDO、熊本、日本) を使用して測定しました。前述のように、INM 粘液の 1 つのサンプルを除いて、左側と右側から収集した同量の粘液を混合して分析しました。

N-メチル-2-ピロリドン (NMP; キシダ化学株式会社、大阪、日本; エレクトロニクス産業用) および硝酸 1.38 (60%; 関東化学株式会社、東京、日本; エレクトロニクス産業用)業界）を使用して検量線溶液とサンプル希釈を調製しました。 SPEX CertiPrep (XSTC-13 元素混合標準溶液、10 μg/mL、5% HNO3; SPEX、Metuchen、NJ、USA) を検量線の標準溶液として使用しました。 5μLのOC粘液とINM粘液の混合物（左右の混合）または100μLの唾液上清を5mLの1%硝酸含有NMPに溶解しました。自動測定は、自動測定サンプラー ESI SC2 DX に接続され、ソフトウェア Qtegra によって制御される Thermo Fisher Scientific (米国マサチューセッツ州ウォルサム) の誘導結合プラズマ質量分析計 (ICP-MS) iCAP Qs を使用して実行されました。 1%硝酸含有NMPで希釈したサンプルを4℃に設定した石英サイクロンチャンバーに自己吸引により直接導入しました。炭素の蓄積を防ぐために、酸素がプラズマに導入されました。ヘリウムガス衝突条件をZnの測定に適用しました。低温プラズマおよび 1% NH3-He ガス衝突反応条件が、Zn を除くすべての元素に適用されました (補足表 3)。

検量線は、1%硝酸添加NMP溶液を用いて、濃度0、0.1、0.2、0.5、1、5、10、50、100ng/mLで作成した。すべての元素について直線性 (r > 0.999) が得られ、注入サンプルの定量下限は 0.1 ng/g (OC および INM 粘液については 100 ppb、唾液については 5 ppb) であることが確認されました。サンプルは濃度が高すぎて、Na、K、Ca の濃度を測定できませんでした。したがって、Mg については 0.1 ppb ～ 100 ppb、その他については 0.1 ～ 10 ppb の範囲で標準曲線を作成しました。ブランクサンプルは、神経外科用パッドを Milli-Q 水に浸し、その水を嗅粘液として収集することによって調製されました。粘液または唾液サンプル中の Mg、Fe、Cu、および Zn の濃度は、ブランクサンプルよりも高かった。 1 つの OC 粘液サンプルの鉄濃度は他のサンプルよりも高かった (約 40 ppm、他のサンプルの平均は 1.67 ppm)。このサンプルには少量の血液が含まれていた可能性があります。したがって、このサンプルの ICP-MS データは分析から除外されました。

pigOBPをコードするDNAは、GenScript遺伝子合成サービス（GenScript Biotech Corp.、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して合成されました。合成された遺伝子は基本的に NM_213796.1 と同じ配列です。ただし、C 末端に F88W 変異 46 および His6 タグを持ち、N 末端のシグナルペプチド配列をコードする 15 アミノ酸配列を持たないタンパク質をコードします。合成した遺伝子を EcoRI および XhoI 制限酵素で消化し、pET-22b (Merck Biosciences、米国ウィスコンシン州マディソン) にクローニングしました。これにより、N末端pelBリーダー配列を有するpigOBPをコードする最終発現ベクターが得られた。 pigOBP は、大腸菌 BL21(DE3) 株と Ni カラムを使用して GenScript によって発現および精製されました。濃度は、BSAを標準としてブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して決定されました。 pigOBP は、ウエスタンブロット分析でマウス抗 His mAb (GenScript) を使用して検出されました。

測定は前述のように実行されました46。臭気物質溶液 (Amb、l-メントン、およびシトロネロール) は、EtOH 中の 100 mM ストック溶液として調製されました。 1-AMA (Accu Standard Inc.、米国コネチカット州ニューヘイブン) を EtOH 中の 1 mM ストック溶液として調製しました。 pigOBPは、リン酸緩衝生理食塩水中の60μMストック溶液として調製されました。ストック溶液を凍結し、アッセイ用に 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) で希釈しました。 50 μL の試験溶液を 96 ウェル黒色プレート (Corning Inc.、Corning、NY、USA) に加えました。溶液の蛍光発光は、EnSight マルチモードプレートリーダー (PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で記録されました。

Amb、l-メントン、およびシトロネロールを含む臭気物質混合溶液 (40 μL) を、さまざまな濃度の pigOBP の存在下または非存在下で 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 中で調製しました。次に、溶液を 2 mL ヘッドスペースバイアル (Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ、米国) にピペットで移し、ポリテトラフルオロエチレン (PTFE)/シリコン隔膜スクリューキャップで密封し、水中で 37 °C で 5 分間加熱しました。 SPME ファイバー (ポリジメチルシロキサン [PDMS]/ジビニルベンゼン [DVB]、df 65 μm、SUPELCO, Inc.、米国ペンシルベニア州ベルフォンテ) をバイアルのヘッドスペースに 30 分間曝露します。 SPME デバイスはサンプリング前に調整されました。 Agilent 5975C 質量選択検出器 (Agilent Technologies) に接続された Agilent 7890A ガスクロマトグラフを使用しました。 GC/MS に使用した分析カラムは、アミン用 DB-WAX カラム (60 m × 内径 0.25 mm、ジーエルサイエンス、東京、日本) でした。ヘリウム (99.99995%) を定圧モード (56.07 kPa) でキャリアガスとして使用しました。インジェクター (脱着) 温度は 250 °C でした。 SPME ファイバーの脱着はスピットレスモードで行い、脱着時間は 1 分でした。オーブン温度プログラムは、6 °C/分で 40 °C (4 分) ～ 240 °C の範囲でした。電子イオン化は、35 ～ 300 m/z のスキャン範囲で MS に使用されました。イオン源の温度は 230 °C に維持されました。

エタノールに溶解した Amb、ムスコン、および PEA を含む臭気物質混合溶液 (0.2 μL) を、2 mL ヘッドスペースバイアル (Agilent Technologies) 内の 20 μL の生理食塩水、BSA 溶液、嗅粘液、変性 OC 粘液、および唾液に添加しました。これは、PTFE/シリコン隔膜スクリューキャップで即座に密閉されました。ヘッドスペース臭気物質は、前述のように SPME GC/MS を使用して分析されました。 GC/MS 分析カラムは VF-WAXms カラム (30 m × 内径 0.25 mm、Agilent Technologies) でした。臭気物質の抽出イオンクロマトグラム (EIC) ピーク面積 (Amb の場合は m/z = 252、ムスコンの場合は 238、PEA の場合は 91) は、サンプル間のエタノール EIC ピーク面積 (m/z = 45) に従って調整されました。 SPMEで抽出した後、水溶液を水(80μL)で希釈し、酢酸エチル(100μL)を加えた。溶液をボルテックスして、有機層中の残留臭気物質を抽出した。有機層をGC/MSを使用して分析した。注入されたサンプルは、スプリットモード (10:1) で 1 μL でした。

CES-1 阻害剤 (BNPP およびベンジル) および組換え CES-1 は、それぞれ TCI (日本、東京) および R&D Systems (米国ミネソタ州ミネアポリス) から購入しました。酵素反応のために、臭気物質混合物 (0.2 μL、エタノール中 10 mM) を 20 μL の生理食塩水、唾液、INM 粘液、OC 粘液、希釈サンプル (生理食塩水で)、および CES-1 溶液 (50 mM Tris-HCl、 pH 7.5)、CES-1 阻害剤の有無にかかわらず (BNPP の場合は水溶液、ベンジルの場合はジメチルスルホキシド [DMSO] 溶液、最終濃度 100 μM)。溶液を37℃で1時間インキュベートし、次に80μLの水で希釈した。酢酸エチル(100μL)を溶液に加えた:二相溶液をボルテックスして臭気物質と代謝産物を抽出した。有機層を収集し、前述のように GC/MS を使用して分析しました。濃度は、EIC ピークの面積を使用して決定されました。さまざまな酢酸塩の構造活性関係の分析では、エステル 19 のピーク面積は実験全体でほとんど変化せず、対応するアルコールは検出されませんでした。したがって、実験間のピーク面積は、ピーク面積を使用して調整されました。

pCA の酵素反応の時間経過を決定するために、1.6 μL の pCA (エタノール中 10 mM) を 160 μL の 10 倍希釈した OC 粘液、CES-1 溶液 (0.57 μg/mL)、およびビヒクルに添加しました。次に、pCA添加後0、1、5、10、20、40、60、120分後に反応液を20μL採取し、37℃でインキュベートし、GC/MSを行った。ミカエリス・メンテン値を決定するために、希釈した OC 粘液または CES-1 溶液に、最終濃度 50、100、250、500、および 1000 μM で pCA を添加しました。反応溶液を 37℃で 5 分間（希釈 OC 粘液）または 40 分間（CES-1 溶液）インキュベートし、反応速度を GC/MS 分析によって測定しました。ミカエリス・メンテン値 Vmax および Km は、GraphPad Prism ソフトウェア (GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して計算されました。 pCA (最終濃度 = 100 μM) を使用して、個々の OC 粘液サンプルの酵素反応性を測定しました (インキュベーション時間 = 5 分)。

pCAは0.1%鉱油溶液として調製されました。蒸留水中のｐ－クレゾール濃度は０．００１％であった。臭気物質溶液 (1 mL) を 110 mL ガラスバイアルに入れた。ムスコンをバイアル内の滅菌綿球 (1.0 mg) に直接塗布しました。ヘッドスペースを平衡化するためにバイアルを開けたままにした。ミスセンス変異は報告されなかったため、OR9Q2 遺伝子型を持つ参加者の数は決定されませんでした。 8 人の参加者に p-クレゾールの匂いを嗅いでもらい、知覚された匂いの強度を無臭から強い匂いまで 95 mm スケールで記録しました。次に、被験者に 1 つのサンプル (水、p-クレゾール、ムスコン、または pCA) を与え、2 分間吸入してもらいました。 p-クレゾールは別のバイアルで再度提示され、参加者は知覚された臭気の強度を再度評価するように求められました。強度変化は次のように計算されました: 脱感作前の値を 100% として正規化し、次に脱感作後の値と比較しました。ランク付けは、正の値 (脱感作後の p-クレゾールの強度の増加) または負の値 (脱感作後の p-クレゾールの強度の減少) のいずれかで、最小値は - 100 (脱感作後に臭気は感じられない) でした。各テストでは、同じ臭気物質を使用した 2 つの別々の試験がサンプル A として提示されました。別々の時間に提示された p-クレゾールの参加者ランキングを比較して、信頼性を判断しました。ランキングの差が 30% を超える場合、評価は信頼できないとみなされ、強度ランキングは恣意的に割り当てられました。その後、結果は分析から除外されました。参加者には、脱感作の影響を逆転させるために各試験の間に 10 分間の休憩が与えられました。

Dual-Glo™ ルシフェラーゼアッセイ (Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) を前述のように実施しました 55。簡単に説明すると、FLAG-Rho タグ付き OR、cAMP 応答エレメント (CRE)/luc2PpGL4.29、pRL-CMV、および RTP1S を、ポリエチレンイミン Max (PEI-MAX、Polysciences、ペンシルベニア州ウォリントン、 USA）ポリ-D-リジンでコーティングされた96ウェルプレート（Corning）またはポリ-D-リジンでコーティングされた384ウェルプレート（Corning）の各ウェルについて。 15 分間のインキュベーション後、細胞懸濁液をトランスフェクション溶液に加えました。トランスフェクションの 24 時間後、培地を除去し、トランスフェクトされた細胞を DMEM で希釈した臭気物質溶液で刺激しました。96 ウェルおよび 384 ウェルのプレートを密閉し、37 °C で 3 ～ 4 時間インキュベートした後、ルシフェラーゼを添加しました。レポーター遺伝子の活性を測定しました。臭気物質誘発活性は、CRE:luc比(ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で割ったもの)または増加倍数(Luc(N)をLuc(0)で割ったもの)として計算した。 Luc(N) は特定の臭気物質で刺激されたウェルの CRE:luc 比であり、Luc(0) は特定の非刺激ウェルの CRE:luc 比でした。データ分析は、Microsoft ExcelまたはGraphPad Prismソフトウェアを使用して実行されました。

実験は前述のように行われました65。細胞を、ポリ-D-リジンでコーティングされた35 mmのガラス底ディッシュ（株式会社イワキ、千葉、日本）に播種しました。次に、細胞に Rho-OR9Q2、Gα15、および PEI-MAX を含む RTP1S をトランスフェクトしました。 24 時間のインキュベーション後、Fura-2/AM をロードした細胞をリンガー液 (140 mM NaCl、3 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM グルコース、および 10 mM HEPES [pH 7.4]) で洗浄しました。そしてカルシウムイメージングを行った。リンガー液中の一連の臭気物質を、蠕動ポンプを使用して流速 2.0 mL/min で細胞に連続的に適用しました。細胞内 Ca2+ レベルは、AQUA COSMOS (浜松ホトニクス、静岡、日本) を使用して 340 または 380 nm での励起により 510 nm での Fura-2/AM 蛍光として検出されました。

GloSensor™ cAMP アッセイシステム (Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) は、臭気物質 (Amb または p-クレゾール) の蒸気相に対するリアルタイム OR 応答に対する培地の量の影響を評価しました。 HEK293T 細胞を、96 ウェル黒色プレート (Corning、アリゾナ州グレンデール) 上で 30 ng/ウェルの RTP1S プラスミド、67.5 ng/ウェル OR9Q2 プラスミド、または 30 ng/ウェルの cOR5A2 プラスミド、および 67.5 ng/ウェル 20F プラスミド (Promega) でトランスフェクトしました。、米国）。トランスフェクションの 24 ～ 40 時間後、DMEM (Thermo Fisher Scientific) を、4% GloSensor cAMP 試薬 (Promega) を含む 50 μL の CO2 非依存培地 (Thermo Fisher Scientific) に置き換えました。 37 ℃で 2 時間平衡化した後、培地の容量を 0 ～ 50 μL まで 10 μL ずつ調整しました。その直後に、7 mm の綿球 (オオサキメディカル、名古屋、日本) を各ウェルの培地の上に置きました。プレートを機能的薬物スクリーニングシステム (FDSS)/μCELL (HAMAMATSU Photonics、静岡県、日本) にロードしました。 37℃で20分間平衡化した後、150μLの臭気物質水溶液を50μL/秒で各綿球に自動的に適用した。細胞の発光を5秒間隔で60分間測定しました。各時点で、臭気物質で刺激された細胞からの生の発光値から、刺激されていない細胞からの値が差し引かれました。 50μL条件における最大値に対する各減算値の割合を正規化レスポンス(%)とした。

カルシウム流入アッセイは、FDSS/μCELL を使用して実行されました。 TRPM8 が安定して発現する細胞は、以前に記載されているように得られました 66。細胞をポリ d-リジンでコーティングした 96 ウェルプレート (Corning) に 20,000 細胞/ウェルで播種し、一晩培養しました。次に細胞を、2 μM Fluo4-AM、0.5 mM プロベネシド、および 0.01% Pluronic F-127 を添加したリンガー液とともに 37 °C で 1 時間インキュベートしました。細胞を１回洗浄し、アッセイ緩衝液で回収した。続いて、プレートを FDSS に挿入し、細胞と試験サンプルを 5 分間プレインキュベートしました。アッセイバッファーを 37 °C に予熱し、FDSS 内で 30 °C でアッセイを実行しました。最大[Ca2+]i応答をピーク蛍光強度比(ピーク蛍光強度/基礎蛍光強度)として測定し、4μMイオノマイシンに対する応答のパーセンテージとして表した。

この論文で議論されているすべてのデータは、原稿または SI 付録で入手できます。

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参加者の匂い適応を評価する方法を確立してくれたマデリン・エイブラハム氏、手術室のプラスミドを生成してくれた小林麻里さん、粘液収集について江戸川病院のメンバーに感謝します。

Junkichi Yokoyama

現住所：千葉県柏市新柏2-1-1 名戸ヶ谷病院耳鼻咽喉科・頭頸部外科

Sensory Science Research, Kao Corporation, 2606 Akabane, Ichikai-machi, Haga, Tochigi, Japan

Tomohiro Shirai, Dan Takase, Chisaki Uehara, Naoko Saito, Aya Kato-Namba & Keiichi Yoshikawa

花王株式会社分析科学研究部和歌山県和歌山市港1334

Kuniyuki Nakanishi

東京都江戸川区東小岩2-24-18 江戸川病院耳鼻咽喉科・頭頸部外科

Junkichi Yokoyama

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TS、概念化、方法論、検証、正式な分析、調査、データキュレーション、執筆 - 元の草案の準備、執筆 - レビューと編集、およびプロジェクト管理。 DT、方法論、調査、執筆 - 原案の準備。 JY、調査および監督。 KN、調査。 CU、調査。 NS、調査および監督。 AK-N、調査。 KY、概念化、方法論、検証、形式的分析、調査、執筆 - 原案の準備、執筆 - レビューと編集、視覚化。

Correspondence to Keiichi Yoshikawa.

JY を除く著者は花王株式会社の社員です。花王株式会社は、p-クレゾールのヒト臭気物質受容体に関する特許（P6588715）を保有しており、鼻粘液への水を投与する方法およびORの蒸気刺激方法に関する特許を出願している。現在開発中または市販されていると宣言できる製品はありません。この研究は、花王株式会社から著者への給与を提供していただきました。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

白井哲也、高瀬大輔、横山純ほか人間の嗅粘液の機能と年齢による変化。 Sci Rep 13、971 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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受信日: 2022 年 11 月 10 日

受理日: 2023 年 1 月 10 日

公開日: 2023 年 1 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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