多様で希少な微生物分類群がディープウォーター・ホライゾン深層に反応した

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メトリクスの詳細

ディープウォーター ホライズン (DWH) 油井の爆発は、分散した炭化水素の巨大なプルームを生成し、メキシコ湾の深海の微生物群集を大きく変えました。 異なる微生物集団の大幅な濃縮が観察されましたが、石油流出後のガス、石油、分散剤の生分解に関与する特定の微生物生態型の存在量と豊富さについてはほとんど知られていません。 今回我々は、シクロクラススティカス、コルウェリア、オセアノスピリラ科に属する、これまで認識されていなかった近縁な分類群の多様性を記録し、湾の深海における放流前、放流中、放流後の放流場からの距離が徐々に離れていくそれらの時空間分布を説明する。放電。 細菌の 16S リボソーム RNA 遺伝子 V4 ～ V6 領域の 454 タグのパイロシークエンシングから生成されたデータセットに高感度の計算手法 (オリゴタイピング) を適用することにより、運用分類単位以下のレベル (配列類似性 0.2%) で個体群動態の検出が可能になりました。 ）。 深海サンプルの生物地球化学的特徴は、総細胞数、短鎖アルカン (C1 ～ C5) の濃度、栄養素、(着色された) 溶解有機および無機炭素、およびメタン酸化速度によって評価されました。 統計分析により、異なる生態型を表す可能性が高いオリゴタイプの生態学的に関連する動態を形成する環境要因が解明されました。 主要な炭化水素分解物質は、メキシコ湾のゆっくり拡散する天然炭化水素の浸透に適応していたが、DWH 流出時に遭遇した状況に対処できなかったか、あるいは競争に打ち勝ったようだ。 対照的に、多様で希少な分類群が急速に大量に増加し、大規模な深海の石油流出やおそらくその他の大規模な擾乱の際に、特殊な亜集団と潜在的な生態型の重要性が強調されました。

2010年のディープウォーター・ホライゾン（DWH）海洋掘削プラットフォームの爆発と沈没に続き、史上最大の外洋炭化水素放出により、前例のない量のガスと石油がメキシコ湾北部（以下、メキシコ湾）の深海に放出された。 DWH 事故の初期、損傷したライザーパイプが切断される前に、破損したライザーパイプから現れる顕著な噴流として水柱への炭化水素の注入が発生し、マコンド坑口付近の深海の化学的性質が変化しました。 水柱に上昇する石油とガスの噴流は冷たい海水を巻き込み(Johansen et al., 2001; Socolofsky et al., 2011)、大量の炭化水素に富む深層水プルームを生成し、それが井戸の南西でその蛍光によって検出された。特徴（Camilli et al., 2010; Diercks et al., 2010; Hazen et al., 2010）、光散乱プロファイル（Diercks et al., 2010）、および特定の炭化水素の濃度の上昇による（Camilli et al. ., 2010; Diercks et al., 2010; Valentine et al., 2010; Joye et al., 2011; Kessler et al., 2011b; Reddy et al., 2012）および分散剤 Corexit（Kujawinski et al., 2011）。 深層水のプルームは、少なくとも長さ 35 km、幅 2 km の領域で、深さ 1000 ～ 1300 m に広がりました (Camilli et al., 2010)。

DWH 放出の初期段階で、炭化水素の影響を受けた深海水には、オセアノスピリラム、シクロクラスティクス、コルウェリア、シュードアルテロモナス、ロドバクテラル目、メチロトローフに関連する細菌集団が著しく豊富に存在していた (Mason et al., 2012; Reddy et al., 2012; Redmond and Valentine 、2012;バレンタイン他、2012）。 現場での観察や実験室での発見は、これらの細菌がプルーム内の油の生分解において重要な役割を果たしているということを示しています。 炭化水素存在量の組成変化は、微生物による石油由来の短鎖および高分子量アルカンの優先的利用を示唆する一方（Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b）、局所的な溶存酸素異常（Joye et al., 2011） ；Kessler et al.、2011a、2011b）は、広範な好気性アルカン呼吸を示しました（Valentine et al.、2010; Crespo-Medina et al.、2014）。 さらに、安定同位体探査と単細胞ゲノミクスにより、炭化水素の分解に関与する微生物集団、またはプルーム内で炭化水素の分解を調整する代謝遺伝子の濃縮が同定され、コルウェリアはエタンとプロパンを酸化する可能性が高く(Redmond and Valentine, 2012)、オセアノスピリルムはシクロヘキサンを分解する( Mason et al., 2012) および多環芳香族炭化水素 (PAH) を利用した Cycloclasticus (Yakimov et al., 1998)。

大規模なマーカー遺伝子データセットをよく特徴付けられた環境パラメータと組み合わせて使用​​する微生物群集の記述は、変化した生態学的条件に対する細菌集団の動的応答を評価するための強力な方法を提供します。 16S リボソーム RNA (rRNA) 遺伝子配列分類群の割り当ての一般的なアプローチは、ランダムな配列決定エラーの影響を最小限に抑えることを目的として、配列類似性閾値 (たとえば 97%) に基づいて操作分類単位 (OTU) を特定するのが一般的です (Huse et al. 、２０１０年；クニンら、２０１０年）。 環境サンプル間の OTU の分布パターンは、微生物集団の生態学的機能を推測するために頻繁に使用されますが、このアプローチでは、さまざまな生態型を反映する 16S rRNA 遺伝子配列の小さな変動は検出されません (Ward, 1998; Eren et al., 2013)。 エコタイプの概念は、微妙に異なる遺伝的要素を持つ系統のコレクションを記述しており、遺伝的特徴と（ほぼ）完全な生態生理学的可能性を維持しながら、わずかに異なる生態学的ニッチを占有する能力を提供します（Konstantinidis and Tiedje、2005）。 密接に関連した個体群の生態学的特徴は、例えば新しい基質上での増殖や、環境条件に応じて複数の代謝を行う代謝可塑性によって示される可能性がある(Konstantinidis et al., 2006)。 このような代謝の柔軟性は、DWH 流出後に存在する多様な分類群にとってほぼ確実に有利であった。たとえば、密接に関連したコルウェリアの生態型は、エタン、プロパン、ベンゼンまたはその代謝副産物を酸化した可能性があるためである (Redmond and Valentine, 2012)。

変動する地球化学的条件（生態型など）に応答する密接に関連した微生物分類群の配列間の環境関連の差異を解決するには、サブOTU解決を可能にするバイオインフォマティクスアプローチが必要です（Tikhonov et al.、2014）。 オリゴタイピングは、日常的なクラスタリング戦略が単一の OTU に収束するであろう 16S rRNA 遺伝子アンプリコンリード内の微妙なヌクレオチド変異を区別します (Eren et al., 2013)。 シャノンのエントロピーの生態学的に強力な指標は、配列決定誤差などの確率的変動を無視し、情報が豊富なサイトを使用して、類似した配列を、さまざまな生態学的状況からサンプリングされた群集内の個別の微生物集団を表すオリゴタイプに分解します。 オリゴタイプの非類似性のしきい値は、OTU クラスタリングを使用して得られる一般的に使用される 3% に対して、0.2% という低い値にすることができます。

この研究では、DWH 深水炭化水素プルームの微生物の多様性を、これまで試みられていなかった範囲まで掘り下げました。 我々は、炭化水素の分解に関与する主要な微生物の認識されていないレベルの多様性を報告し、湾岸深海への石油、ガス、分散剤の注入に対する微生物の時空間的反応について説明する。 サンプルは、放電前、放電中、放電後、放電現場のすぐ近く、および放電現場から遠ざかるにつれて採取されました (表 1)。 我々は、細菌の16S rRNA遺伝子のオリゴタイプ解析を通じて、近縁な分類群の微生物集団動態を調査した。 プルーム流体の地球化学的特徴は、おそらく異なる生態型を表す、密接に関連する微生物分類群の相対存在量の観察された顕著な変化を引き起こす環境要因を特徴づけた。

サンプルは、メキシコ湾北部 (表 1、補足図 S1)、クルーズ R/V ペリカン (PE 10-20、2010 年 3 月)、R/V ウォルトン スミス (WS1010、2010 年 5 月/6 月)、R/V で入手されました。 V オシアナス (OC468-2、2010 年 9 月)、R/V アトランティス (AT18-2、2010 年 11 月)、R/V エンデバー (EN496、2011 年 7 月)、R/V エンデバー (EN510、2012 年 6 月) および R/V ファルコー(FA006、2012 年 11 月)。 DWH 坑井はミシシッピ キャニオン ブロック 252 (緯度 28.7381、経度 -88.3659、以下 MC252) にあります。 DWH の放出によって影響を受けたサンプルは、プルーム内 (水深 1000 ～ 1300 m)、プルームの上、またはプルームの下で採取されました。 さらに、深海のプルームの影響を評価するために、約 105,000 km2 のエリアにわたってさまざまな場所からサンプルを採取しました。 サンプルの識別を容易にするために、サンプルには番号 (1 ～ 20) が付けられ、流出に対するサンプリング時間 (排出前、排出中、排出後) を示すために「PRE」、「DUR」、「POST」と指定されました。サンプリング場所別（海洋エネルギー管理局が定義する、サイトのリースブロック番号で示されます）。 元の巡航サンプルの指定を表 1 に示します。サンプルは、サンプリング時間の関数としてのガスとオイルの放出量の違いによって特徴付けられました (補足表 S1)。 固有のサンプルは、2012 年 11 月に DWH の影響を受けた地域 (19-POST-MC252) で直接採取されました。 私たちの知る限り、これはこれまでに回収された坑口に最も近いサンプルです（坑口までの距離は 72 m）。 もう 1 つのユニークなサンプル (20-POST-MC253) は、MC252 のわずか東に位置する新たに発見された湧水から採取されました。 この湧出源はまだ仮説の段階ですが、MC252 貯水池に由来する可能性があります。 両方のサンプル (19-POST-MC252 および 20-POST-MC253) は、海水が堆積物の表面近くで回収され、遠隔操作の車両サンプリング中の目視観察に基づくと、いくらかの堆積物を含んでいたため、両方のサンプル (19-POST-MC252 および 20-POST-MC253) は、遠洋性および底生性の微生物群集の混合物を反映している可能性があります。粒子。 2010 年 3 月から 2012 年 11 月までの時系列サンプリングにより、DWH 現象による風土病の遠洋微生物個体群の破壊と再構築の程度を推定することができました。 さらに、湾岸の深海環境に蔓延するガスや石油を分解するバックグラウンド微生物群集を解明するために、湾岸北部の天然炭化水素湧出場所のサンプリングが行われました。

ミシシッピ キャニオン ブロック 118 にある湧出地 (以下、MC118 と呼びます) は、ミシシッピ州パスカグーラの南約 150 km (平均緯度 28.8522、平均経度 -88.4928)、MC252 から北北西 26 km、水深 900 に位置しています。メートル。 MC118 の湧出量は深層水プルームの影響を受けましたが、我々は DWH 油の放出が始まる 1 か月前の 2010 年 3 月にこの場所でサンプリングを行いました (1-PRE-MC118 および 2-PRE-MC118; 表 1)。 MC118 からのこれらのサンプルは、深海の炭化水素プルームが約 6 ～ 8 週間後に分散したこの地域に特有の自然の遠洋性背景湧出群落を反映しています。 一般に、MC118 湧出物は、天然ガスと石油の排出、Beggiatoa (Lloyd et al., 2010)、メタンアイスワーム、および化学共生のムール貝とアサリを含む化学合成生物群集によって特徴付けられ、高い炭化水素フラックスと高い微生物活動のバックグラウンド率を示しています(ボウルズら、2011)。

MC118 と同様に、グリーン キャニオン ブロック 600 (以下、GC600) に位置する湧出地は、広範なガスと石油の浸出、大型動物相 (化学共生貝やムール貝を含む) の浸出、堆積物表面と豊富な炭酸塩露頭に定着する微生物マットによって特徴付けられます (Roberts et al.、2010）。 GC600 地域は MC252 の南西 260 km (平均緯度 27.3696、平均経度 -90.5693) にあり、DWH 深層水プルームの直接的な影響は受けませんでした。 GC600 で採取されたサンプル (17-POST-GC600 および 18-POST-GC600; 表 1) は、DWH 石油放出 (2012 年 6 月および 11 月) の余波における天然の遠洋性湧出群落を表しています。 GC600 は、メキシコ湾の水深 1250 m で最も活発な天然油の湧出物の 1 つであり、以前に詳細に説明されました (Joye et al., 2010; Roberts et al., 2010; Hu et al., 2012)。 。

導電率（塩分）、温度、深さ、クロロフィル蛍光、ビーム透過、および油蛍光を測定するための CTD ロゼットには、10 リットル 12 個（R/Vs Walton Smith、Pelican）または 20 リットル 24 個（R/ vs オケアナス、アトランティス、エンデバー、ファルコー) ニスキンボトルが水サンプルの収集に使用されました。 遠隔操作車両またはマルチコアラーに取り付けられた 1 リットルのニスキンボトルを使用して、追加の水サンプルが収集されました。 ロゼットまたは個々のニスキン ボトル (遠隔操作車両/マルチコアラー) を回収した後、きれいな (酸洗浄、Milli-Q 洗浄および乾燥) シリコン チューブの一部をポートに取り付け、水をタンクに排出することによって水サンプルを収集しました。事前に洗浄した（HCl に浸し、MQ で洗浄し、乾燥させた）ボトル。 ボトルは充填前に 3 回サンプル洗浄されました。 研究室では、細胞数の計測、分子分析、地球化学のためのサブサンプルが収集されました。 細胞数サンプルはホルマリン (最終濃度 4%) で固定され、分析まで -20 °C で保存されました。 分子分析のために、ペリスタルティックポンプを使用してステリベックスフィルターを通して1リットルの海水を濾過することによって細胞を濃縮しました。 フィルターを液体窒素中で急速冷凍し、DNA 抽出まで -80 °C で保存しました。 CH4/短鎖アルカンのサブサンプルを除き、地球化学サンプルはシリンジを使用してボトルから取り出し、0.2 μm フィルター (Gelman Acrodisk または Target cellulose) に通し、その後さまざまな分析のために等分して固定しました (「地球化学」を参照)セクション）。 すべての地球化学サンプルバイアルは、使用前に酸洗浄され、超純水ですすぎ、500 °C で燃焼されました。

サンプルの pH は、認定標準で校正された高インピーダンス電位計を使用して直ちに測定されました。 アンモニウム (NH4+) 濃度の分析のために、0.2 μm で濾過したサンプル 1 ml を 200 μl のフェノール試薬とともに保存しました。 固定サンプルは 4 °C で保存され、インドフェノール比色法 (Solorzano、1969) を使用して 1 ～ 2 日以内に分析されました。 栄養素（(NOx-=硝酸塩 (NO3-) + 亜硝酸塩 (NO2-)、亜硝酸塩 (NO2-) およびリン酸塩 (PO43-)) および溶解有機炭素のサンプルを 0.2 μm フィルターに通し、清潔な Nalgene ボトルに入れて 400℃ で冷凍しました。以前に記載されているように（Joye et al., 2004）、分析まで -20 °C 溶存有機炭素は、島津全有機炭素分析装置（TOC-V、島津製作所、京都、日本）を使用して酸性化（pH<2）した状態で測定しました。 CO2 フリーの空気で 15 分間スパージした後のサンプル フィルター (Gelman Acrodisk および Target セルロースフィルター) 溶解有機物のブランク (フィルターを通過したmilliQ 水) を並行して実行しましたが、重要ではないことがわかりました。

メタンまたは短鎖アルカン (エタン、プロパン、ブタン、ペンタン) の定量では、ヘッドスペース抽出 (R/Vs Pelican、Walton Smith クルーズ) または真空超音波処理 (その他すべて) を使用して 750 ml の水サンプルからガスを回収しました。クルーズ）（Crespo-Medina et al.、2014）。 回収されたガスの量を記録し、ガスサンプルを定量的に血清バイアルに移しました。 アルカンは、後にガスクロマトグラフィーを使用して定量化されました。 溶解した無機炭素の分析では、0.2 μm で濾過したサンプル 1 ml を、He パージおよびクリンプシールした 6 ml ヘッドスペースバイアルに注入し、その後、0.1 ml の濃リン酸で酸性化しました。 メタンまたは短鎖アルカン (メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン) および溶存無機炭素は、炎イオン化検出器 (0.5 m Haysep DB プレカラムと 2 m の Haysep DB プレカラムを備えた Shimadzu GC 14A) を備えたガスクロマトグラフで測定しました。正確な定量のために二酸化炭素をメタンに変換するための Carbosphere カラム (Alltech Instruments、米国イリノイ州ディアフィールド)) およびメタン生成装置 (島津製作所)。 溶解した無機炭素の同位体組成は、Picarro iCO2 キャビティ リングダウン分光システムを使用して 0.5 パーセントの精度で測定されました。 溶解油の良い代用物である着色溶解有機物 (Diercks et al., 2010) は、ロゼット フレームに取り付けられた WetLabs ECO-FL 蛍光光度計 (Philomath、オレゴン州、米国) を使用して定量されました。

メタンの酸化速度は、トリチウム化 (3H) CH4 放射性トレーサー技術を使用して測定されました (Carini et al., 2005、Crespo-Medina et al. 2014)。 サンプリングした深さごとに、海水サンプル（生サンプルを 3 つ（n=3）、死滅させたコントロールを 1 つ）をシリンジに取り付けた Tygon チューブで収集し、7 ml ガラス シンチレーション バイアルに気泡を入れずに下から上に満たしてあふれさせました。サンプルをヘッドスペースなしでバイアルに充填します。 対照サンプルについては、500μlのエタノール(96%)を直ちに添加して微生物の活動を停止させた。 バイアルは直ちに、スクリューキャップで固定された気泡のないブチルゴム隔壁で密封されました。 サンプルはトレーサー注入まで (通常 12 ～ 36 時間以内) 4 °C で保存されました。 場合によっては、レートを決定する前に長期間の保管が必要になることもありました（たとえば、放射性同位元素隔離用バンが不足しているクルーズの場合）。 私たちは、数週間までの保管ではメタンの酸化速度が変化しないことを発見しました（Crespo-Medina et al. 2014 の補遺を参照）。 気密シリンジを使用して、C3H4 トレーサー溶液の 100 μl アリコートをブチルセプタムを通して各サンプルに注入し、サンプル ml-1 あたり約 75,000 dpm のトレーサー活性を得ました。 サンプルを暗所でその場温度で48時間インキュベートしました。 インキュベーションは、生物学的活性を停止するのに役立つ200μlのエタノールでサンプルを修正することによって終了した。 標識された C3H4 は、サンプルを水和空気で少なくとも 25 分間パージすることによって除去されました。 シンチレーションカクテル (Scintiverse BD、Fisher Scientific、ハンプトン、ニューハンプシャー、米国) を加え、Beckman 6500 液体シンチレーションカウンター (Beckman Coulter、米国カリフォルニア州ブレア) を使用してサンプルの 3H2O 活性をカウントしました。 メタン酸化速度定数 (k) は次のように計算されました。

(ここで、A=活性、t=時間) にその場での CH4 濃度を乗算して、メタン酸化速度を決定します。

個々の細胞の総数は、標準的な方法（Hobbie et al., 1977）に従ってアクリジンオレンジ（AODC）で染色した後、落射蛍光顕微鏡によって測定されました。 DNA 抽出は、以前に記載されているように (Sinigalliano et al., 2007)、溶解酵素溶液 (Qiagen) と組み合わせて Gentra Puregene Kit (Qiagen、Valencia、CA、USA) を使用して、ステリベックス フィルター全体 (サンプル収集セクションを参照) から実行されました。 ; ゼトラー、2013)。 DNA 抽出物は、PCR 増幅まで -80 °C で保存されました。 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V5 および V4 ～ V6 領域は、タグ パイロシーケンスで分析されました (Thor Marteinsson et al., 2013)。 我々は、以前に記載されているように（Huse et al., 2010）配列リードの品質管理とトリミングを実行し、Global Alignment for Sequence Taxonomy（GAST; Huse et al., 2008）と海洋生物研究所（MBL）が厳選したSILVAを使用して分類を割り当てました。データベース バージョン 108 (Quast et al.、2013)。 トレースはシーケンス リード アーカイブに送信され、Bioproject ID PRJNA234441 で入手できます。

配列エラーアーチファクトを最小限に抑えるために、すべての配列をアンカートリミングしました。 これを達成するために、V3V5 および V6V4 リード (補足表 S2) を保存領域 (それぞれ 371 または 362 塩基対のリード長) にトリミングしました。 続いて、UCLUST (Edgar、2010) を使用して、97% の類似性しきい値に基づいて配列を OTU にクラスター化しました (補足表 S3)。 各クラスターからの代表的な配列が選択され、GAST を使用して分類が割り当てられました (Huse et al., 2008)。

多様性指数（Good のカバレッジ、Shannon 指数、Richness、Eveness、Inverse Simpson）と Morsita–Horn 指数を決定するために、R（R-Core-Team、2012）とビーガン パッケージ（Oksanen et al.、2013;補足表）を使用しました。 S4)。 2 つのサンプル (6-DUR-MC335、8217 リード、および 17-POST-GC600、84 リード) は、他のすべてのサンプル (>21,500 リード) よりもリード数が大幅に少なかったため、希少化されませんでした。 他のすべてのサンプルの希薄化は 100 回計算され、平均化された 100 個の OTU テーブルが生成され、各サンプルの各 OTU の希薄化観察の平均値が表示されました。 Mann-Whitney-Wilcoxon 分析では、レア化されたデータがレア化されていないデータと統計的に異ならないことが検証されました (P=0.8252)。 アルファ ダイバーシティ インデックスは、非希薄化 OTU テーブル、ランダム希薄化 OTU テーブル、および平均化 (100 回の計算) 希薄化 OTU テーブルに対して計算されました。 ダイバーシティ推定値 (補足表 S4) は、非希薄 OTU テーブルと希薄 OTU テーブルの間でわずかに変化しました。 オリゴタイピングのための情報を保持するために、レア化されていない OTU テーブルの使用を進めました。 私たちは配列観察を群集の 0 ～ 100% の相対存在量データに変換し、すべての OTU とすべてのオリゴタイプ (以下を参照) に加え、Colwellia、Oceaniserpentilla、Cycloclasticus、SAR11 についてもモリシタ・ホーン ベータ多様性指数を計算しました。オリゴタイプは個別に。

系統解析には、ARB ソフトウェア パッケージ (Ludwig et al., 2004) と ARB SILVA のデータベース SSURef111 (Pruesse et al., 2007) を使用しました。 ほぼ全長の 16S rRNA 遺伝子配列の系統樹が最尤法解析によって計算され、その後、ツリー全体のトポロジーを変更することなく、倹約基準によってオリゴタイプ配列が系統樹に挿入されました。

オリゴタイピング (Eren et al., 2013) を使用して、Colwellia (26,217 配列)、Oceaniserpentilla (168,045 配列)、Cycloclasticas (41,714 配列) 属に割り当てられた V6V4 配列と、SAR11 (64,701 配列) のヌクレオチドを評価しました。レベル。 これらの微生物群は遍在し、時系列にわたって広く分布しており、Colwellia、Oceaniserpentilla、Cycloclasticas は油分解微生物群集の主要なメンバーであり、オリゴタイピングによるミクロ多様性検査の理想的な候補となっています。

対象の各属に分離されたサンプル内で観察されたすべての配列が抽出され、その標的属の全長 16S rRNA 配列からなるテンプレートに位置合わせされ、一貫した開始位置と終了位置にトリミングされました。 各ヌクレオチド位置のエントロピーが計算され、13 ～ 19 個の情報豊富な位置がオリゴタイピングに寄与しました。 シーケンスは V6 から V4 領域に向かって進み、リードの長さ (>450 bp) に沿ってエラーが増加したため、関心のある高エントロピーの位置を V6、V5、および V4 領域の最もノイズの低い領域に限定しました。 。 属が出現するサンプルの少なくとも 10% で観察され、少なくとも 1 つのサンプルで 0.1% 以上豊富に存在し、最も豊富な固有配列がその属の全リードの 0.05% であったオリゴタイプを保持しました。 オリゴタイピング手順の詳細な例は、補足資料に記載されています。

完全な OTU データセットと同様に、結果として得られるオリゴタイプ存在量テーブルの希薄化の効果を比較しました。 テーブルをサンプルの最小読み取りカウント (17-POST-GC600 の場合は 32) に限定すると、統計的に異なるプロファイルが生成されました (MWW、P<0.01)。 次に低い深さ (2856、1-PRE-MC118) への希薄化は、完全なオリゴタイプ コミュニティ プロファイル (MWW、P=0.5101) と統計的に異ならず、オリゴタイプ配列の 80% が破棄されました。 環境パラメータと希少データとの間の相関試験では、希少でないオリゴタイプ存在量を用いた分析よりも 2 倍以上の関係が得られました (データは示されていません)。 偽陽性のリスクを軽減するために、オリゴタイピング分析では希少データを使用しませんでした。

我々は、R（R-Core-Team、2012）、パッケージビーガン（Oksanen et al.、2013）およびq値（Klaus and Strimmer、2012）を使用して、測定された環境パラメータとオリゴタイプ存在量の間の関係を評価しました。 スピアマンのノンパラメトリック順位相関係数 ρ を、各オリゴタイプ分布および環境パラメーターに対して計算しました。 q<0.05での複数のテストに対するStoreyの誤検出率補正を使用して、有意な(P<0.05)相関を保持しました。

湾岸では、海底からのガスと原油のゆっくりとした拡散した自然浸透 (Behrens, 1988; Kennicutt II et al., 1988; Aharon, 1994) により、硫酸塩還元菌やメタンなどの活性な炭化水素分解微生物群集が維持されています。酸化細菌（Orcutt et al., 2010; Kleindienst et al., 2012）。 天然ガスと石油のゆっくりとした入力とは著しく対照的に、DWH の石油排出は 2.6 ～ 3.6 × 105 トンのガスと 5.9 ～ 8.4 × 105 トンの石油を放出し (Joye et al., 2011; McNutt et al., 2012)、湾の微生物集団と地元で前例のない炭化水素負荷。 在来細菌群集に対する深海のプルームの時間的影響は、2010 年 3 月から 2012 年 11 月の間、以下「放出前」(PRE)、「放出」(DUR) および「放出後」(POST) と呼ばれる条件で調査されました。 生物地球化学および水路データ (補足表 S1) はプルームの中心を定義しました。 「プルームサンプル」はメタン濃度＞10μMおよび/または水深1000～1300m（排出中）を示しましたが、「非プルームサンプル」はメタン濃度はより低いものの、依然としてDWH石油排出による影響の証拠を保持していました（メタン濃度が 10 nM を超え、10 μM 未満、および水深が 1000 m を超えるか 1300 m 未満）。 プルーム集団と天然の油分解細菌群集を比較するために、我々は 2 つの天然炭化水素湧出所、MC118 および GC600 から深海のサンプルを入手しました (Orcutt et al., 2005; Bowles et al., 2011)。

私たちのサンプルの場所は坑口の南西に集中しています。 深海のプルームの南西への伝播は、大陸斜面に沿った湾北部の平均循環に寄与する反時計回りの流れと一致しています。 しかし、複雑な深浅地形と相互作用する平均流の不安定性を通じて、直径最大 40 km の低気圧および高気圧の渦がこの地域で継続的に生成されており (Cardona and Bracco, 2015)、それらがプルームを他の方向に移動させた可能性があります。少なくとも散発的には。 地域的な海洋モデルとの数値積分により、プルームのパターンと方向が時間とともに変化し、約 1 週間北東に伝播した後に南西に移動し、プルーム内の水塊が炭化水素源と複数回接触したことが示唆されました (Valentineら、2012)。 坑口周囲の循環は無秩序な性質を持っているため、微生物群集が変化するまでにどれくらいの時間がかかったのかを計算したり、坑口のすぐ近くの水が何回変化したかを評価したりすることは不可能です。半径5km以内）が噴出する炭化水素噴流と接触した。 しかし、明らかに、2010 年 5 月か 6 月に採取した水は、放出される炭化水素噴流の影響を直接受けており、井戸に蓋をした時期 (2010 年 7 月) をかなり過ぎて採取されたサンプルには、この暴露の後遺症が明らかでした。

微生物群集は、16S rRNA 遺伝子の V3V5 および V6V4 領域の 454 タグ パイロシーケンスに基づいて分析されました (補足表 S2)。 これら 2 つの領域を使用した分類学的同定の比較は、可変領域の選択が計算された OTU の数に影響を与えることを示しましたが、配列決定された領域の選択とは無関係に、マイナー集団と優勢集団については同じ一般的な傾向が V3V5 と V6V4 で観察されました（補足）表S3)。 V6V4 ベースのシーケンスはより包括的なデータセットを提供したため、その後、詳細な分析のために選択されました。

すべての OTU の相対存在量に基づくモリシタ・ホーン指数を使用して、サンプル間の微生物群集の非類似性を測定しました。 放流中に坑口に最も近い地点 (0.5 km 離れた距離) から採取した水サンプルは、実質的な変化の兆候を伴う微生物群集を反映していました (11-DUR-MC252、10-DUR-MC252、12-DUR-MC25 および 9) -DUR-MC252;図1）バックグラウンドコミュニティ（1-PRE-MC118および2-PRE-MC118;モリシタ・ホーン指数0.2〜1;図1a）と比較しました。 DWH サイト近くの 3 つのサンプル (11-DUR-MC252、10-DUR-MC252、および 12-DUR-MC252) も、下流、つまり坑口から 7 ～ 27 km 離れた微生物群集から収集されたサンプルとは異なりました (森下ホルン指数 0.1 ～ 0.9; 図 1a)。 同じ場所で異なる深さのサンプルを比較したところ、プルームはDWH放流場近くの1000メートル直下を中心とした層に垂直に閉じ込められており、南西のより深い水域に移動するにつれてより広い深さにわたって分散したことが示された。 その結果、坑口近くのプルームの中心部（9-DUR-MC252）の微生物群集は、ブロック 335（6-DUR- MC335) (Camilli et al., 2010) の水平速度推定値を使用して放水井から得られたデータと、坑井の下流およびその近くのサンプルが 2 日間隔で、流れの方向に関して年代順に逆に採取されたことを示しています。

OTU (a) およびオリゴタイプ (Oceaniserpentilla、Cycloclasticus、Colwellia、および SAR11; b) に基づいて、DWH 放出前、放出中、放出後に採取されたサンプルからの深海の微生物群集の非類似性を示すヒートマップ。 DWH の影響を受けたサイトは、メキシコ湾、MC118 (1-PRE-MC118 および 2-PRE-MC118) および GC600 (17-POST-GC600 および 18-POST-GC600) の天然炭化水素湧出物と比較されました。 0 から 1 までの非類似性尺度 (青、白、赤として色分け) は、Morisita-Horn 指数を使用して計算されました。

以前の研究 (Hazen et al., 2010; Redmond and Valentine, 2012; Valentine et al., 2012) と一致して、サンプル間のすべての OTU を比較すると、プルームサンプルでは非プルームサンプルと比較して微生物群集組成の変化が観察され、有意な変化が見られました。プルーム内の多様性が減少します。 例えば、退院前のサンプルからの配列は、811 個と 980 個の細菌 OTU (それぞれ 1-PRE-MC118 と 2-PRE-MC118) にクラスター化していましたが、プルームの影響を受けた領域 (7-DUR-MC295、9-DUR-MC252、 8-DUR-MC295および6-DUR-MC335）は、細菌OTUの数が少なかった（199〜548;補足表S3）。 DWH プルームはコミュニティ全体の豊かさを犠牲にして、特定の微生物集団を豊かにし、微生物の多様性を減少させました。 特定の生物および/または個体群は、高濃度の短鎖アルカン (Joye et al., 2011; Supplementary Table S1)、長鎖アルカン、PAH (Reddy et al., 2012) およびジオクチルナトリウムなどのプルーム条件下で潜在的に繁殖した可能性があるが、スルホコハク酸塩（Kujawinski et al., 2011）、微生物集団の他の成分は存在量の減少を示し、検出下に落ちたか、あるいは坑口とその下流の両方で不活性化および/または死滅した可能性がありました。 対照的に、最も多くの細菌 OTU が観察されたのは、湧出部 GC600 の多量の天然メタンプルームからの放出後のサンプル (18-POST-GC600; 1640 OTU) でした。 坑口エリアから回収された 2012 年のサンプルは、底層水サンプリング中に堆積物がわずかに撹乱されたため、遠洋および底生微生物の影響を受けた可能性があります (19-POST-MC252 および 20-POST-MC253、それぞれ 2997 および 6835 OTU)。

放線菌、バクテロイデス属、クロロフレキシ属、デフェリバクテレス属、SAR11、SAR324 および SAR86 が退院前サンプルで優勢でした (1-PRE-MC118 および 2-PRE-MC118、図 2)。 これらのグループは通常、遠洋水域で観察されます (Swan et al., 2011)。 2010 年 5 月と 6 月の DWH 原油排出中、プルームサンプル中の細胞数は、バックグラウンドの深層海水と比較して一桁増加しました（1 ～ 2 × 105 細胞 ml-1 から最大 2 × 106 細胞 ml-1。補足）表 S1) は、ガスと石油の注入によって成長率が増加したことを示唆しています。 現時点では、ガンマプロテオバクテリアはプルームサンプルの全配列の 43 ～ 98% を構成していましたが (図 2、補足表 S3)、放出前サンプルの全配列のより控えめな 23 ～ 29% でした。 オセアナイセルペンティラ（以前はDWHオセアノスピリラムと呼ばれていた、例えば、Hazen et al., 2010; Redmond and Valentine, 2012）の炭化水素分解者に属するガンマプロテオバクテリア、ColwelliaまたはCycloclasticus、最大94%を構成（Oceaniserpentilla; 8-DUR-MC295）、分泌物サンプル中の全細菌配列の 35% (Colwellia; 6-DUR-MC335) および 47% (Cycloclasticus; 5-DUR-MC250 および 6-DUR-MC335)。

異なる水深 (603 ～ 1564 m) と 2 つの天然炭化水素湧出所の垂直横断面に沿った、時系列 (排出前、原油排出中、排出後) にわたる細菌集団の相対的な存在量、MC118 (1-PRE-MC118)および 2-PRE-MC118) および GC600 (17-POST-GC600 および 18-POST-GC600)。 細菌群集は、細菌 16S rRNA 遺伝子の V6V4 領域の 454 パイロシーケンスを使用して分析されました。 サンプリング日、具体的な水深および場所を表 1 に示します。

2010 年 9 月、深海のプルームの生物地球化学的特徴は大幅に減衰しました (たとえば、メタン濃度は坑口付近で約 1 nM でした。補足表 S1; Crespo-Medina et al., 2014)。 この時点で、退院前のサンプルでは検出不能であったメチロファーガ属のメチロトローフ細菌が濃縮され、全配列の 7% を占めました (14-POST-MC422; 図 2)。 興味深いことに、メチロファーガは、GC600 の 1 つのサンプル (全配列の 1 ～ 2%、17-POST-GC600、図 2) と、2012 年 11 月に DWH の影響を受けた地域から回収された 2 つのサンプル (直接採取されたサンプルを含む) でも検出されました。坑口上 (20-POST-MC253 および 19-POST-MC252)。 メチロファーガは既知のメチロトローフであり、複雑な石油生分解の副産物を分解する可能性がありますが、ヘキサデカンも酸化する可能性があり、これらの微生物は自然の湧出場所での炭化水素循環において重要な役割を果たす可能性があります。 さらに、退院前および退院サンプル（全配列の 4% および 14%、それぞれ）。 メチロファーガと同様に、バクテロイデス属はメタンや石油由来の化合物の生分解による二次代謝産物を消費する可能性があります。

Alteromonas 属のメンバーは、退院後の環境で開花しました (全配列の 29%、14-POST-MC422、図 2)。 これらの分類群は、存在量は減少しますが (1-PRE-MC118; 2%、17-POST-GC600; 9%、および 18-POST-GC600; 11%)、自然湧出サンプルにも存在し、固有の PAH 分解物質として機能する可能性があります ( Jin et al.、2012; Math et al.、2012)。 豊富な天然の炭化水素湧出地である GC600 からのサンプルには、シュードアルテロモナスの集団も豊富に含まれていました (全配列の 40%、18-POST-GC600)。 これらの微生物は PAH を分解する可能性もあります (Hedlund および Staley、2006)。 偽アルテロモナスは自然湧出および放流後のサンプル (全シーケンスの 2 ～ 7%) からのみ検出され、放流中に収集されたサンプルからは検出されませんでした。 この微生物群が排出中の環境条件に対処できなかった可能性があります。 あるいは、これらの生物は非常に急速に反応して、私たちがサンプリング作業を行っている間に開花したり崩壊したりしたため、見逃された可能性があります。

オリゴタイピングは、毒性微生物と非病原性微生物（Eren et al., 2011）、宿主特異的糞便指標細菌（McLellan et al. ., 2013)、海洋 SAR11 オリゴタイプ (Eren et al., 2013)、および海綿宿主微生物群集における宿主特異性 (Reveillaud et al., 2014)。 重要なのは、この方法は 16S rRNA 遺伝子の複数コピーの発生に起因する合併症の影響を受けないことです。 たとえば、2 つの異なるオリゴタイプが同じゲノムに由来する場合、それらはそのゲノムを含むデータセット内で常に同時発生するはずです。 これは現在のデータセットでは検出されませんでした。 その代わり、オリゴタイプには異なる出現パターンがあり、これは複数の遺伝子コピーの存在によっては説明できません。 したがって、オリゴタイピングは 16S rRNA 遺伝子配列の多様性の解釈を強化し、特定の生態型レベルでの微生物集団の生態学的に関連する変化の定量化を可能にします (Ward, 1998; Eren et al., 2013)。 私たちは、21 個の Oceaniserpentilla オリゴタイプ (その属のすべてのリードの 97.4% に相当)、31 個の Cycloclasticus オリゴタイプ (92.4%)、および 26 個の Colwellia オリゴタイプ (94%) を解決しました。 各オリゴタイプは、NCBI nr データベースの配列と最低 96% の類似性を持っていました。 Oceaniserpentilla のオリゴタイプは、配列決定された Oceaniserpentilla haliotis (NR_042641.1) の代表と 97 ～ 99% 類似していました。 Cycloclasticus のオリゴタイプは、Cycloclasticus zancles (NC_021917.1) および Cycloclasticus sp. と 96 ～ 100% 一致しました。 P1 (NC_018697.1); そして、Colwellia のオリゴタイプは Colwellia psychrerythraea (NC_003910.7) と 96 ～ 100% 類似していました。

また、微生物群集の別の遍在メンバーに対する手順が、明確な意味のある生態学的シグナルを欠く分布パターンを生成するかどうかを評価するために、64 701 個の SAR11 分類配列に対してオリゴタイピングを実行しました。 同様の方法で、98 個のオリゴタイプを生成する 14 個の高エントロピー ヌクレオチド位置を選択しました。 生成されたすべての SAR11 オリゴタイプは、NCBI nr データベースの代表と少なくとも 98% 類似していました。 他のオリゴタイピング分類群を用いた手順とは対照的に、オリゴタイピングの反復当たりのヌクレオチド位置の数を増加しても、サンプル内の SAR11 オリゴタイプの差異的な存在量パターンは区別されませんでした。

オリゴタイピングを介してこの包括的な空間的および時間的に多様なデータセットを調査すると、モリシタ・ホーン指数はすべてのOTUについて得た結果と比較して非常に類似したパターンを明らかにしました（図1aおよびb）。これは、微生物群集の変化が主に変動によって説明されることを示唆しています。 Oceaniserpentilla、Cycloclasticus、Colwellia のオリゴタイプに含まれます。 退院サンプル中のオリゴタイプ組成は、退院前および退院後のサンプルとは異なっており（モリシタ・ホーン指数はそれぞれ0.5〜1;図1b）、独特のエコタイプが退院前、退院中、退院後の特定の時期に発生したことが示されました。

サブOTUレベルでの相対存在量を調べると、意味のある生態学的変動を反映する、オセアニアセルペンティラ、シクロクラスティクス、コルウェリア内のこれまで認識されていなかった異なる分類群が明らかになりました。 深海のプルームで炭化水素の利用可能量が非常に多かったとき、放出中に収集されたサンプルに豊富なオリゴタイプは、炭化水素の利用可能量がはるかに低かった自然の湧出物やプルーム外のサンプルを支配するものと比較して、独特の集団を表しました。 生態学では、r および K 戦略家の概念は、個体群の増加率と特定の環境の収容力を指します (Andrews および Harris、1986)。 私たちは、原油流出時に炭化水素が豊富な深海のプルームに濃縮された分類群は、より安定した条件の環境に生息する成長の遅いKストラテジストと比較して、変化する条件に迅速に対応できる急速に成長するRストラテジストであったと提案します。 自然の浸出は、ゆっくりとした拡散またはパルス状の急速な炭化水素の浸透によって特徴付けられますが（K 戦略対 R 戦略）、DWH の放出は明らかに R 戦略にとって有利な環境ニッチを提供しました。

潜在的なシクロアルカン酸化剤であるオセアナイセルペンティラ (Mason et al., 2012) の分布の重大な変化が、排出前条件と比較して DWH 油排出に応じて検出されました。 Oceaniserpentilla のオリゴタイプ分布を調査すると、退院前サンプル (1-PRE-MC118 および 2-PRE-MC118; モリシタ・ホーン指数 1.0; 補足図 S2a) は、他のすべてのサンプルと類似していませんでした。 退院前に豊富に存在するオリゴタイプ (type_18、type_19、図 3) は、DWH 退院中または退院後に検出されませんでした。 ほぼ全長の 16S rRNA 遺伝子配列とオリゴタイプ配列の系統解析に基づくと、排出前オリゴタイプ (type_18、type_19) は、DWH 油排出とは関連しない分類群と密接に関連しており、おそらく自然の背景群落を反映していると考えられます。 対照的に、放出中に、spp.に関連するさまざまなOceaniserpentillaオリゴタイプ（type_01、type_02、type_10;図3）が観察されました。 以前の研究で DWH オイルプルームサンプルで検出されました (たとえば、受託番号 JN015209、HM587888-90; 補足図 S3; Hazen et al., 2010)。 放出後、豊富な Oceaniserpentilla オリゴタイプ (それぞれ、type_10、⩽6%、type_16、⩽5%、type_21、⩽92%、すべてのオリゴタイプ; 図 3) は、spp. と密接に関連していました。 DWH 油の排出中に検出されたもの (例えば、登録番号 HM587889、JN015210; 補足図 S3; Hazen et al., 2010)。 湾岸海水を用いた 13C-エタンおよび 13C-プロパンの安定同位体探査実験中に同定された（例えば、登録番号 JN018486、JN018459; Redmond and Valentine、2012）。 DWH の排出とは関係ありません。 流出中および流出後のオセアナイサーペンティラのオリゴタイプ（タイプ_10、タイプ_21）の変化と、DWH 原油流出後に豊富になったオリゴタイプ（タイプ_16、全オリゴタイプの 25%、18-POST-GC600）の変化が長期にわたる影響を反映しているかどうかは依然として不明である。 - 流出による長期的な影響。

DWH 原油流出事故で重要な役割を果たした、Oceaniserpentilla オリゴタイプ (a)、Cycloclasticus オリゴタイプ (b)、および Colwellia オリゴタイプ (c) の相対的な存在量。 オリゴタイピングにより、特定のエコタイプのレベルで 16S rRNA 遺伝子配列の多様性を解釈できるようになりました。 オリゴタイプの動態は、退院前、退院後、および退院後のサンプルでモニタリングされました。

Cycloclasticus に属する潜在的な PAH 分解者 (Dyksterhouse et al., 1995) の場合、エコタイプ分布は退院前と退院中に同様でした (モリシタ・ホーン指数 <0.1～0.5; 補足図 S2b)。 退院後、3 つのサンプルは同様の Cycloclaasticus エコタイプ (14-POST-MC422、15-POST-MC298、および 16-POST-MC297; モリシタ ホーン指数 <0.1 ～ 0.3) を明らかにしましたが、追加の 3 つのサンプルは独特でした (18-POST) -GC600、19-POST-MC252および20-POST-MC253;モリシタ・ホルン指数0.9〜1）。 DWH 事件前に検出された主要なオリゴタイプ (type_01、すべてのオリゴタイプの 74 ～ 94%、1-PRE-MC118 および 2-PRE-MC118、図 3) は、DWH 事件中に大量に存在していました (すべてのオリゴタイプの 29 ～ 81%)。退院後（全オリゴタイプの最大 34%、19-POST-MC252）。 この oligotype_01 は系統学的に spp に属します。 以前の研究で深海のプルームサンプルで検出されました（登録番号JN018748、JN018827、JN018869、JN018988およびHQ222992;補足図S4;Redmond and Valentine、2012;Valentine et al.、2012）。 さらに、退院後のサンプル（最大 100% および 44%、15-POST-MC298 および 16-POST-MC297; 図 3）に豊富に含まれる Cycloclasticas オリゴタイプ (type_02、type_07) が spp. とクラスター化されていました。 以前の DWH 研究 (HQ433397、JN019017、HQ222993; Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b; Redmond and Valentine, 2012) のサンプルで検出されました。 これらのオリゴタイプの分布は、湾岸の天然炭化水素湧出物に生息するサイクロクラスティクスが明らかにDWH排出による環境変動に耐えることができ、おそらく事故中に石油の生分解に関与したことを示している。

推定上の短鎖アルカン分解物質を含むコルウェリア（レドモンドとバレンタイン、2012）の場合、オリゴタイプ分布により、退院前（モリシタ・ホーン指数<0.1;補足図S2c）と退院中（モリシタ・ホーン指数0.1）で同様のパターンが明らかになりました。 -0.8)、それぞれ。 時系列全体で 1 つのオリゴタイプ (type_04) が検出されました。 系統解析により、このオリゴタイプは、自然の湧出サンプルと DWH の影響を受けたサンプルの両方で検出された生物と密接に関連していることが示されました (図 4; 登録番号 JN018846; Redmond and Valentine, 2012)。 天然の炭化水素の湧出物に存在する物質は、DWH 放出中に深海に存在する高濃度のガス、石油、分散剤に対処することができました。 しかし、このオリゴタイプの相対存在量は、退院前サンプルと比較して退院中に大幅に減少しました（全オリゴタイプの 72 ～ 86% から 0 ～ 13%、図 3）。流出。 これと一致して、DWH 排出中に最も豊富なコルウェリア オリゴタイプ (type_01、⩽43%、type_02、⩽56%、type_03、⩽25%、type_05、⩽22%、type_06、⩽24%、type_07、⩽13%) type_08、および type_08、それぞれ全オリゴタイプの ⩽8%; 図 3) は、以前の研究 (たとえば、受託番号 JN018749、JN018846、および JN019018; Redmond and Valentine, 2012) で深海のプルームサンプルで検出された微生物と密接に関連していました。 13C-メタン、13C-エタン、および13C-プロパンを用いた安定同位体探索実験で同定された微生物（登録番号JN018467、JN018427、JN018472およびJN019018; Redmond and Valentine、2012; 図4）。 排出中にサンプルを支配していたコルウェリアのオリゴタイプ（DWH 油流出時の相対存在量 > 5%、図 4）は、系統発生的に異なるクラスターの形成とは対照的に、16S rRNA 遺伝子ツリーとコルウェリア科全体に散在する配列において驚くほど多様であるように見えました。 DWH 油流出時に検出されたコルウェリアの系統的多様性は、このグループの生理学的多様性と、さまざまな環境条件に応答する能力を反映している可能性があります。 興味深いことに、Colwellia sp. DWH 汚染水から MC252 油で分離された RC25 (Bælum et al., 2012) は、以前の報告で DWH 油の排出中に検出された分類群のいずれとも、またはここで報告されたコルウェリアのオリゴタイプのいずれとも密接に関連していません (図 4)。 品種は Colwellia sp. RC25 (Bælum et al., 2012) は貴重なモデル生物として機能しますが、その生理機能 (基質の好み、最適な生育条件、活動など) は、DWH 排出中に優勢だったコルウェリア生態型の生理機能を反映していない可能性があります。

Colwellia オリゴタイプ (太字) と密接に関連する種の系統関係。 文化的な代表者も含めて。 ツリーは最尤法分析によって計算されました。 DWH 石油排出中に潜在的により活性が高かったオリゴタイプは赤色のフォントで示されています。 球の色分けは、図 3 のオリゴタイプの標識に対応しています。さらに、メタンおよび/またはメタン酸化と有意に相関するオリゴタイプは、[CH4] および/または [MOx] で標識されています。 同じオリゴタイプにクラスター化されたリードの数はフルネームで示されます。 バーは、10% の推定配列相違を表します。

さらに、環境パラメーターと、R (R-Core-Team、2012)、パッケージ vegan (Oksanen et al.、2013)、および qvalue (Klaus and Strimmer、2012) を使用して、サンプル全体にわたる Colwellia、Cycloclasticus、Oceaniserpentilla のオリゴタイプの分布との関係を評価しました。 。 各オリゴタイプ分布および環境パラメーターに対するスピアマンの順位相関係数 ρ と、q<0.05 での複数のテストに対するストーリーの誤検出率補正は、有意な (P<0.05) 相関を示しました。 オリゴタイピングにより、異なるエコタイプを表す 16S rRNA 遺伝子の微妙な変異が解決されるため (Ward, 1998; Eren et al., 2013)、環境パラメータと有意に相関するオリゴタイプは異なるエコタイプを表す可能性が高いと主張します。 6 つの Colwellia オリゴタイプ (types_01、02、03、04、06、09)、3 つの Cycloclasticus オリゴタイプ (types_04、06、30)、および 1 つの Oceaniserpentilla オリゴタイプ (type_17) の相対存在量は、深海の炭化水素プルーム中のメタン濃度の上昇を強力に追跡しました。 これらの同じサンプルには、溶解油の良い代用となる、高濃度の有色溶解有機物も含まれていました (Wade et al., 2013; Supplementary Table S5)。 多様なコルウェリア オリゴタイプの連続開花は、特定の短鎖アルカン、分散剤、または他の有機化合物の異なる基質の好みなど、異なる生態学的ニッチ間の移行を反映している可能性があります。 さらに、メタン酸化速度の測定値が高いほど、3 つの Colwellia オリゴタイプ (type_01、04、および 06) および 3 つの Cycloclasticus オリゴタイプ (type_01、06、および 30) の存在量が高いことと相関していました。 現在まで、Colwellia も Cycloclasticus もメタン酸化剤であることは知られていません。つまり、それらのゲノムはメタンを酸化する代謝能力を明らかにしていません (Lai et al., 2012; Mason et al., 2014)。 しかし、これらのオリゴタイプとメタン酸化速度との正の相関関係は、このプロセスへのオリゴタイプの間接的な関与（例えば、共代謝産物や反応副産物の酸化による）、またはメタン酸化剤との共存（例えば、プルームサンプル中、メタン、アルカン、PAH が共存する場所）、あるいはメタンを酸化する未認識の可能性がある可能性があります。

推定上の油酸化細菌のコミュニティ継承で観察されたパターンを真実にするために、遍在するコミュニティメンバーであるSAR11をオリゴタイプ化し、この手順が明確な生態学的意味を欠くパターンを生成しないことを確認しました（補足図S2dおよびS5、補足表S3）。 私たちは、SAR11 個体群と環境パラメータの関係も評価しました。 27 個の SAR11 オリゴタイプの相対存在量は、細胞数、メタン濃度 (タイプ_42、66、および 90)、およびメタン酸化速度 (タイプ_37、42、43、66、および 90; 補足表 S5) と負の相関がありました。 したがって、オリゴタイピングは、SAR11 の既知の生態学的および代謝戦略から予想されるように、炭化水素動態における SAR11 の役割を示唆しませんでした。 ペラギバクター属のゲノムエネルギー需要の低下と、貧栄養の外洋条件における炭素飢餓に合わせて最適化されています（Stendler et al.、2011）。 メキシコ湾北部の深部では、SAR11 の存在は減少しますが、Colwellia、Cycloclasticus、Oceaniserpentilla などの炭化水素関連ガンマプロテオバクテリアのメンバーが優勢です (Giovannoni et al., 2005)。 興味深いことに、2 つの SAR11 オリゴタイプ (タイプ 68 および 73) は、NOx (亜硝酸塩と硝酸塩) 濃度と強い正の相関関係を示しました。 SAR11 は海洋海水環境に世界的に豊富に存在するが (Morris et al., 2002)、海洋 SAR11 とアンモニウム濃度および硝酸塩濃度との負の相関関係 (Eiler et al., 2009) と正の相関関係 (Teira et al., 2009) の両方が報告されている。 。 したがって、SAR11 メンバーは、栄養素の利用可能性によって定義される生態学的ニッチに特化している可能性があります。

湾岸の DWH 石油流出の影響を受けた自然の湧出物や地域から得られた空間的および時間的に多様なデータセットにおけるサブ OTU レベルでのオセアナイセルペンティラ、シクロクラスティクス、およびコルウェリアのオリゴタイプの相対的な存在量を評価したところ、これらの炭化水素のこれまで認識されていなかったレベルの多様性が明らかになりました。劣化者と、DWH 事件の間の時間の経過に伴う分類群分布の明らかな進化。 自然の湧出物に生息する特定の生態型は、深海のプルーム条件に潜在的に対処できる可能性があります。 しかし、Oceaniserpentilla、Cycloclasticus、および Colwellia の内方成長は、天然の炭化水素の湧出では通常観察されない分類群によって支配されていました。 培養および生理学的実験、および機能遺伝子とマーカー遺伝子の両方の追加分析を通じて、これらの潜在的に特殊化された生態型の将来の特徴付けは、海洋環境におけるそれらの生態学的関連性の知識を進歩させるでしょう。 さらに、このような分析は、石油流出時にそれらの支配力の増大を引き起こした環境要因についてのより多くの洞察を提供するでしょう。

オリゴタイピングは、この急性の環境撹乱中の異なる生態型を表すと思われる微生物分類群の応答を非常に正確に定量化する方法を提供しました。 同様に、このアプローチは、富栄養化、ハリケーン、津波、気候変動などの他の急性および慢性の環境摂動に応じた分類群の進化を評価するのに適しています。 多様で存在量が少ない、おそらく特殊な分類群が数週間以内に DWH 炭化水素注入に反応しました。 希少な生物圏のこれらのメンバーが大規模な摂動の後に活動と存在量を高める能力は、湾岸の自然微生物集団の多様で大きな代謝能力を示しています。

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この研究は、米国国立科学財団の生物化学海洋学プログラム (OCE-1043225 から SBJ)、NOAA 国立海中科学技術研究所 (SBJ に対する賞番号 0710028 および 0810031)、BP/The Gulf of of of からの助成金によって支援されました。 「メキシコ湾への石油およびガス投入による生態系への影響 (ECOGIG)」コンソーシアム、およびスローン財団の深層炭素観測所および海洋生物センサス プログラム (MS 宛) を支援するメキシコ研究イニシアチブ。 これは ECOGIG コントリビューション 203 であり、データは GRIIDC 取得番号 (UDI: R1.x132.134:0079) で保管されています。

サラ・クラインディエンスト

現在の住所: 4現在の住所: 応用地球科学センター、エバーハルト カールス大学テュービンゲン、72074 テュービンゲン、ドイツ。

シャロン・グリム

現在の住所: 5現在の住所: ミシガン大学地球環境科学部、米国ミシガン州アナーバー、

メリッツァ クレスポ メディナ

現在の住所: 6現在の住所: プエルトリコのインターアメリカン大学、環境教育、保全および研究センター、サンフアン、プエルトリコ、

ジョージア大学海洋科学部、アテネ、ジョージア州、米国

サラ・クラインディエンスト、メリッツァ・クレスポ＝メディナ、サマンサ・B・ジョイ

ジョセフィン ベイ ポール センター、海洋生物学研究所、ウッズホール、マサチューセッツ州、米国

シャロン・グリム & ミッチェル・ソーギン

ジョージア工科大学地球大気科学部、米国ジョージア州アトランタ

アナリサ・ブラッコ

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サマンサ・B・ジョイへの手紙。

著者は利益相反がないことを宣言します。

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転載と許可

Kleindienst、S.、Grim、S.、Sogin、M. 他。 多様で希少な微生物分類群が、ディープウォーター ホライズンの深海の炭化水素プルームに反応しました。 ISME J 10、400–415 (2016)。 https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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受信日: 2014 年 10 月 31 日

改訂日: 2015 年 5 月 21 日

受理日: 2015 年 6 月 3 日

発行日: 2015 年 7 月 31 日

発行日：2016年2月

DOI: https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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