可逆的 PDLLA の合成、特性評価、および応用

Scientific Reports volume 6、記事番号: 19077 (2016) この記事を引用

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この研究では、一連の注射可能な熱可逆性および熱ゲル化 PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーが開発され、in vitro と in vivo の両方で熱ゲル化システムの体系的な評価が行われました。 臨界ゲル濃度を超える PDLLA-PEG-PDLLA 水溶液は、インビトロまたはインビボで体温付近で 2 分以内に自発的にヒドロゲルに変化する可能性があります。 分子量、ブロック長、ポリマー濃度を調整すると、ゾルゲル転移挙動とヒドロゲルの機械的特性を調整できます。 ゲル化はコポリマーミセルの物理的相互作用により熱可逆的であり、ゲル化中に結晶化は形成されませんでした。 このポリマーの細胞毒性と溶血はほとんど見られず、ヒドロゲルを小動物に注射した後の炎症反応は許容可能でした。 インビトロおよびインビボ分解実験により、物理的ヒドロゲルは数週間もその完全性を保持し、最終的には加水分解によって分解されることが示されました。 側壁欠損腸剥離のラットモデルを使用したところ、未治療の対照群や市販のヒアルロン酸（HA）抗ヒドロゲルと比較して、PDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルで治療した群では術後癒着の大幅な減少が見られました。密着性ハイドロゲル基。 したがって、この PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルは、医療用途の注射可能な生体材料の有望な候補となる可能性があります。

温度感受性ポリマーヒドロゲルは、持続的な薬物送達、細胞カプセル化、組織再生、および術後癒着防止のための有望な生体材料として広く研究されています1、2、3。 一般に、ポリマー水溶液は室温以下ではゾル（溶液）状態であるが、投与後は生理的温度に応じて自発的に非流動性ゲルに変化する。 このようなユニークな特性により、薬剤や細胞をゾル状態で混合するだけでポリマー水溶液に簡単に組み込むことができ、その後、対応する製剤を標的組織に注入してその場でスタンディングゲルを形成し、制御された薬物送達デポーとして機能します。足場材とか。 一方、このような化学反応を起こさず、侵襲性を最小限に抑えたアプローチは、医療用途にとって非常に有益です4,5。

ポリ（エチレングリコール - プロピレングリコール - エチレングリコール）で構成される市販のトリブロックコポリマー（プルロニクスまたはポロクサマー）は、温度誘発性の可逆的なゾル - ゲル転移を示し、いくつかの薬物の持続送達について報告されています 4,6。 残念ながら、ポロクサマーは非生分解性であり、潜在的に毒性があり、投与後の注射時に急速に侵食されるため、生物医学用途での有用性はある程度制限されます 7,8。 したがって、ブロックコポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（PEG）と生分解性ポリエステル（ポリ（乳酸）（PLA）9,10、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）11,12、ポリカプロラクトン（カプロラクトン）（PCL）13,14 およびポリ（カプロラクトン共乳酸）（PCLA）3,15 は、生分解性および生体適合性の熱ゲル化ポリマーを得るために開発されており、過去数十年にわたって目覚ましい進歩が見られました。

特に、PEG-PLLA-PEG コポリマーが最初の生分解性および感熱性ハイドロゲルとして Jeong らによって開発されて以来、PEG/PLA をベースとした熱ゲル化コポリマーが注目を集めています9。 PEG-PLLA-PEGトリブロックコポリマーは、最初に調製したMPEG-PLLAジブロックポリマーを、カップリング剤としてヘキサメチレンジイソシアネート(HMDI)を使用してカップリングすることにより、2段階で合成した。 トリブロックコポリマーの水溶液は、温度が上昇するにつれてゲル-ゾル転移を起こし、このヒドロゲルからのデキストランのインビトロ持続放出が研究されました。 その後、星型の PLLA-PEG16 および PEG-PDLLA-PEG トリブロック 17 共重合体が同様のゲル - ゾル転移を有することが判明しました。 しかし、上記のこれらのコポリマーのゲル-ゾル転移特性は、高温でのタンパク質や一部の薬物のカプセル化には適さない可能性があり、高温でのヒドロゲルの注入は患者にとって不快なものです5。 したがって、体温付近の下限臨界溶液温度（LCST）を有するPEG/PLAベースのヒドロゲルを見つけるために多くの試みが行われました。 ポリ(L-ラクチド) (PLLA) ブロックとポリ(D-ラクチド) (PDLA) ブロックのステレオ複合体形成から形成されたヒドロゲルは、温度が上昇すると予想されるゾルゲル転移を示すことが報告されています 18。 エナンチオマーコポリマーのステレオコンプレックス誘発ゲル化は、エナンチオマートリブロックコポリマー19、20、星型コポリマー21、またはトリブロックと星型コポリマー22の混合によって実現できますが、ゲル化は不可逆的であり、限られた範囲のポリマー組成に依存していました。 さらに、加熱時に望ましいゾル-ゲル-ゾル転移を示すために、さまざまな L-/DL-LA 比 24 を持つマルチブロック PEG/PLLA23 および PLA-PEG-PLA トリブロック ステレオコポリマーが開発されました。 相転移挙動に対するブロック長、コポリマーおよび添加剤の組成の影響についても議論しました。

しかし、我々の知る限り、これまでのところ、可逆的な温度感受性ゲル化を示す PDLLA-PEG-PDLLA トリブロックコポリマーに関する報告はありません。 今回我々は、コポリマーの組成とブロック長を調節することにより、周囲温度と体温の間で可逆的で鋭いゾルゲル転移を示す、新規の注射可能な熱ゲル化PDLLA-PEG-PDLLAトリブロックコポリマーヒドロゲルを開発した。 PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーは、毒性の可能性があるカップリング剤を使用せずに 1 ステップで合成されたため、簡単で安全なアプローチが実現しました。 この論文では、可逆的なゾル - ゲル転移の構造と特性の関係、ゲル化速度論、および機械的特性が詳細に研究されました。 さらに、細胞毒性、生体適合性、動的生分解の研究を含む、in vitro と in vivo の両方での熱ゲル化 PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーの体系的な研究を紹介します。 生分解性医療材料に関する多くの研究と比較して、注射可能な合成ヒドロゲル、特に熱ゲル化 PEG/PLA コポリマーの生体適合性と分解プロファイルの体系的な評価は非常に限られています 5,23,25。 本研究は、生物医学および生物医薬品用途における熱ゲル化PEG/PLAコポリマーにとって有意義である可能性がある。 私たちの以前の研究では、PCL-PEG-PCL (PCEC) 26 に基づく熱可逆性物理ヒドロゲルも研究しました。これは、薬物送達と術後の腹部癒着予防に大きな可能性を示しています 27,28。 しかし、PCEC の溶液はポリエステル ブロックの結晶化により不安定で室温でゲル化する傾向があり、これがシリンジの操作性に影響を与える可能性があります。 実用的な観点から見ると、PDLLA-PEG-PDLLAコポリマーは、室温で顕著なゾル相安定性を示し、注入可能なその場形成サーモゲルとして使用できるため、対照的に、より便利であり、より幅広い応用の可能性を秘めている可能性があります。 最後に、PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲル システムの術後癒着防止への適用を、側壁欠損 - 盲腸擦傷のラット モデルでも同様に評価しました。

トリブロックコポリマーは、開始剤としてPEG、触媒としてオクタン酸第一スズを使用したD,L-ラクチドの開環重合によって合成されました。 この研究では、ヒドロゲルの配合と機械的特性を最適化するために、異なる分子量とブロック比を持つ一連の PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーが合成されました。 この論文では、コポリマーは LB-EA-LB (PLEL) と表記され、A と B はそれぞれ PEG ブロックと PDLLA ブロックの理論上の数平均分子量 (Mn) を表します。 1 H-NMR分析（補足図S1を参照）およびGPC測定を実行して、得られたコポリマーの化学構造を特徴付けました。これを表1にまとめました。これらの結果はすべて、設計されたPDLLA-PEG-PDLLAトリブロックコポリマーの合成が成功したことを示しています。飼料組成を制御することにより、収率は90％以上になりました。

合成された親水性PEGブロックと疎水性PDLLAブロックからなるPDLLA-PEG-PDLLAトリブロックコポリマーは、水溶液中で両親媒性を示した。 ブロック長、PEG/ポリエステル比、および分子量は、両親媒性ブロックコポリマーの溶解に重要な役割を果たしました29。 調製した共重合体のうち、PEG/PDLLA比が約0.5の共重合体(S1、S2、S3、S6)は水に溶けやすかったが、PEG/PDLLA比が小さいL1700-E1500-L1700(共重合体S4)は溶解しにくかった。 L2000-E2000-L2000 (コポリマー S5) は 0.5 という適切な PEG/PDLLA 比を持っていましたが、その疎水性 PDLLA の長いブロックにより水中で強い疎水性が生じました。 これらの可溶性共重合体のうち、共重合体 (S1 ～ S3) は明らかなゾルゲル転移を示しましたが、L1000 – E2000 – L1000 (共重合体 S6) 溶液は、10 ～ 60 °C の温度範囲ではゾルゲル転移を示さなかったのです。親水性PEGのブロックが長すぎます。 PCEC (1000-1000-1000) は、以前に報告された論文 13,26 で説明されているように、ゾル - ゲル転移を示しました。 これらの現象は、このような両親媒性ポリエステル-ポリエーテルブロック共重合体系の熱ゲル化が、ポリエステルブロックの疎水性とPEGセグメントの親水性との間の微妙なバランスに起因することを示した。 特に、得られた PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーの溶解は低温で撹拌することによって行うことができましたが、PCEC ポリマー水溶液の調製には面倒な加熱および急冷サイクル手順が必要でした 14,23。

温度依存性のゾルゲル転移機構をより深く理解することは、ヒドロゲルの特性を最適化するために重要です。 通常、両親媒性ポリエステル-ポリエーテルブロック共重合体は水中で自己集合してコアシェル状のミセルを形成する可能性があり、ミセルの凝集は物理的なゾル-ゲル転移の根底にある機構に関与していると考えられていました12,24。 したがって、我々は最初に、さまざまな条件で自己集合した PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー ミセルを調査しました。 透過型電子顕微鏡 (TEM) 観察と動的光散乱 (DLS) 測定により、ミセルは低濃度 (0.1 wt%) で粒径 40 ～ 50 nm の球状ナノ粒子として分散していることが確認されました (図 1A、B)。 高濃度でのミセルの凝集は、ゲル化中の提案された階層構造を研究するために、さまざまな温度下で DLS によってさらに検出されました。 1.0 wt% ポリマー溶液中のミセルは単峰性のサイズ分布を示し、ミセルのサイズは温度が 4 °C から 30 °C に上昇するにつれてわずかに増加し、その後 37 °C 付近で急激に増大しました。より高い濃度（図1C）。 予想どおり、ミセルが 10 wt% ポリマー溶液中にある場合、ゾル - ゲル転移に対応する、多峰性のサイズ分布と明らかな凝集挙動が 4 ～ 30 °C にわたって徐々に観察されました (図 1D)。 さらに、これらの結果は、ゾルゲル転移が温度だけでなく共重合体溶液の濃度にも影響されることも示唆しました。

低濃度での PDLLA-PEG-PDLLA ミセルの特性評価と熱ゲル化挙動を示す概略図。

(A、B) 25 °C (S3、0.1 wt%) でのミセルの TEM 画像と粒子サイズ。 (C、D) 異なる温度でのミセル (S3、1 wt% および 10 wt%) の粒度分布スペクトル。各測定は 10 分間の平衡後に実行されました。 (E) 温度による物理的ゲル化のプロセスの模式図。 両親媒性ブロックコポリマーは、水溶液（25 wt%）中で自己集合してコアシェル状ミセルになり、加熱後のミセルの増大と凝集により室温と体温の間でゲル化します。

水中での両親媒性ブロック共重合体の物理的ゲル化の根底にある機構は、この分野における挑戦的な基本問題として残っているが、これまでの我々の測定はすべて、温度誘起物理的ゲル化の 2 段階プロセスを裏付けており 23,30、これを模式的に説明することができる。図１Ｅのように。 水溶液中では、コポリマー中の疎水性 PDLLA が疎水性相互作用により自己集合ミセルのコアを構成し、水和した PEG ブロックが親水性シェルを形成します。 低温では、小さなミセルが自由に流れ、水溶液はゾル状の懸濁液のように見えます。 温度が上昇すると、ミセルのサイズが増大し、続いてミセル間の凝集と充填が起こり、体温付近で物理的に架橋された非流動性のゲル構造が形成されます。

PDLLA-PEG-PDLLA共重合体水溶液の相転移を試験管反転法と動的レオロジー解析により調べた。 図 2 (A、B) は、チューブ反転法によって得られた、温度および濃度に対する PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー水溶液の相転移図を示しています。 臨界ゲル濃度 (CGC) を超えると、加熱時の相転移プロセスはゾル、ゲル、沈殿という 3 つの基本的な物理状態で構成され、ゾル-ゲルから下限臨界ゲル化温度 (LCGT) と上限臨界ゲル化温度 (UCGT) が生じます。降水量から。 相転移図によれば、濃度の変化とともにLCGTとUCGTが変化した。 ポリマー濃度が増加すると、ミセル濃度が高くなりミセル間の凝集が強化されるため、ゲル化は低温で起こり、沈殿は高温で起こります。 PEG/PDLLA 比を一定 (1/2) に保ち、総分子量を S1 の 3,000 から S3 の 4,500 に増加させると、LCGT と UCGT の両方が大幅に増加しましたが、全体的な曲線の形状はほとんど変化せず、その結果、ゲルウィンドウを高温にします。 さらに、特定の PEG ブロック (1,500) では、PDLLA ブロックの長さが増加すると、CGC と LCGT は減少しましたが、UCGT は増加しました。 言い換えれば、状態図におけるゲル範囲は、PEG ブロックが一定に保たれた場合、PLA ブロックの増加とともに大きくなります。

熱ゲル化挙動アッセイおよび得られたもののレオロジー分析。

PDLLA-PEG-PDLLAハイドロゲル。 (A) さまざまな温度でのコポリマー溶液の写真。 コポリマー L1000-E1000-L1000 (S1、25 wt%) は 4 °C から室温までの間でゲル化し、37 °C 付近で沈殿します。 コポリマー L1500 – E1500 – L1500 (S3、25 wt%) は 4 °C および室温でゾルを示し、体温付近でゲル化しました。 (B) チューブ反転法で試験したヒドロゲルのゾル - ゲル相転移図。 (C) 温度の関数としてのコポリマー水溶液 (S3、25 wt%) の貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G'') の温度依存性。(D) コポリマー溶液 (S3、25 wt%) のゲル化時間(E) 温度の関数としての、さまざまな濃度 (S3、15 wt%、20 wt%、25 wt%) でのコポリマー溶液の G' の変化。

相転移挙動は分子量、ブロック長、ポリマー濃度に応じて大きく変化することが明らかです。 したがって、これらの要因を調節することによって、ヒドロゲルのゲル化温度を生理学的に重要な温度範囲に調整することができました。 室温と体温の間の適切な LCGT は、室温での注入が実現可能であり、操作中にその場での迅速なゲル化を意味します。一方、50 °C を超える高い UCGT は、生体内でヒドロゲルを適用した後の安定したゲル相を意味します。 コポリマー L1000 – E1000 – L1000 (S1) は室温で自然にゲル化し、37 °C 付近で沈殿しました (図 2A、B)。これは実用化には望ましくありませんでした。 コポリマー L1300 – E1500 – L1300 (S2) は、L1500 – E1500 – L1500 (S3) と比較して、ゲル化ウィンドウが狭かった (図 2B)。 全体として、コポリマー L1500 – E1500 – L1500 (S3) は最適化されたゲル化温度を示し (図 2A、B)、さらなる研究のために選択された配合物における L1500 – E1500 – L1500 (S3) の選択を裏付けています。

熱ゲル化挙動に伴い、濃縮ポリマー溶液の機械的特性が大きく変化しました。 L1500-E1500-L1500（S3）溶液のゾルゲル転移を定量的に観察するために、動的レオロジー測定が実行されました（図2C-E）。 現在のポリマーのゲル相における貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G") の近い値は、ゲルの半固体の性質を示しています。したがって、ゾルゲル転移は、G' が大きく増加する点として定義されました。 G"23より。 L1500-E1500-L1500 溶液 (S3、25 wt%) の G' と G" は両方とも非常に低く (1 Pa 未満、G' < G")、4 °C ～ 30 °C の温度には本質的に依存しませんでした。これにより、このコポリマー溶液は注射時にシリンジが詰まる危険性がなく注射可能であることがさらに証明されました。 体温付近で温度が上昇すると、G' と G" の両方が急激に 3 倍以上増加しました。これは、ゾルゲル転移に対応します (図 2C)。 G' と G" の間の成長速度の差が、強度の増加につながりました。ハイドロゲルの。 図 2D に示すように、37 °C でのコポリマー溶液のゲル化時間も調べました。 物理的ヒドロゲルは 37 °C で約 50 ～ 60 秒以内に形成され、このゲル化時間は、その場ゲル形成ヒドロゲルの用途、特に組織工学操作に非常に適しています。 我々はまた、共重合体濃度の増加に伴い、それに応じて貯蔵弾性率（G'）が向上し、これにより生体内注射後の形状持続性が向上する可能性があることにも資金を提供した（図2E）。

PDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルのゾル-ゲル転移は熱可逆的であることは言及する価値があります。 ポリマー水溶液の温度を上昇させることによって形成された非流動性ゲルは、低温に冷却されると再びゾルになった。 ゾル状態とゲル状態の間の相互変換を何度も繰り返している間、変化の証拠はまだ観察されていません。 PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) ヒドロゲルの熱可逆性は、図 3A に示すように、加熱および冷却プロセス下での G' の試験によるレオロジー測定によってさらに証明されました。 加熱曲線と冷却曲線の間にわずかなヒステリシスが見られましたが、転移温度と G' の変化傾向はほぼ同様であり、物理ゲル化の熱可逆性を示しています。 興味深いことに、PDLLA-PEG-PDLLAポリマーヒドロゲルの熱可逆性は、以前に報告されたPCL-PEG-PCL（PCEC）熱感受性ヒドロゲルの物理的ゲル化とは実際には異なりました（図3B）。これは、異なるゲル化メカニズムに起因する可能性があります。

PCL-PEG-PCL (PCEC) ハイドロゲル (20 wt%) と比較した PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) ハイドロゲル (S3、25 wt%) の熱可逆ゲル化研究。

(A,B) 加熱および冷却過程における PLEL 共重合体溶液および PCEC 共重合体溶液の G' の変化。 (C) 異なる条件下での PLEL コポリマー溶液と PCEC コポリマー溶液の偏光光学顕微鏡画像: 20 °C でのポリマー溶液の画像。 37℃で直接加熱して形成されたポリマーヒドロゲルの画像。 20 °C で 1 時間後のサンプルの画像。 スケールバーは２０μｍであった。 (D) 37℃で瞬間的に形成されたPLELヒドロゲルと、20℃で1時間形成された、または37℃で瞬間的に形成されたPCECヒドロゲルのX線回折パターン。

この現象を理解するために、PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) 共重合体溶液 (25 wt%) および PCL-PEG-PCL (PCEC) 共重合体溶液 (20 wt%) の偏光光学顕微鏡試験を実施し、その際の形態を研究しました。ゲル化（図３Ｃ）。 ２０℃でスライドガラス上にＰＣＥＣ共重合体水溶液を滴下した後の写真では、結晶相はほとんど観察されなかった。 PCEC サンプルを 37 °C に加熱すると、不透明なゲルが即座に形成され、偏光光学顕微鏡画像には結晶形態の束が示されました。 20 °C で 1 時間後に撮影された PCEC サンプルの画像でも、同じ不透明なゲルと顕著な結晶相が観察されました。 これとは異なり、PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー水溶液の偏光光学顕微鏡画像は、同じ手順で同じであり、20 °C のゾル状態でも 37 °C のゲル状態でも結晶形態は見つかりませんでした。

同時に、20°Cで1時間形成された、または37°Cで瞬間的に形成された濁ったPCECヒドロゲルのX線回折では、結晶性PCLに対応する21.3°および23.9°に強い回折ピークが示されましたが、PLELヒドロゲルには何も存在しませんでした。回折ピーク（図３Ｄ）。 これらの結果はすべて、PCL ブロックの結晶化が低温ゲルとサーモゲルの両方における PCEC コポリマー水溶液のゲル化に関与していることを示唆しており、これは以前に報告された Jeong の研究と一致しています 14。 反対に、PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー水溶液の熱ゲル化は、結晶化を伴わないコポリマー ミセルの物理的相互作用から生じ、熱可逆的なゲル化を引き起こしました。 したがって、これらは、ブロック長およびポリマー濃度に加えて、ポリエステルの組成がゲル化挙動において重要な役割を果たすことも実証した。

PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーおよびヒドロゲル抽出物の細胞毒性を、L929 細胞および HUVEC 細胞を使用した細胞生存率アッセイによって評価しました。 線維芽細胞と血管内皮細胞は、創傷治癒の過程で非常に重要な役割を果たします 31,32。 したがって、これらの細胞に対する PDLLA-PEG-PDLLA 材料の生体適合性は、組織再生への応用に直接関係しています。 図４Ａによれば、Ｌ９２９細胞とＨＵＶＥＣ細胞の両方の生存率は、コポリマー濃度の増加とともにゆっくりと減少した。 しかし、2.5 mg/ml という高濃度でも、85% 高い細胞生存率が検出されました。 ヒドロゲル抽出物とともに培養した L929 細胞および HUVEC 細胞の生存率も約 90% でした (図 4B)。 これらの結果は、PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーおよびヒドロゲル抽出物が細胞毒性を最小限に抑え、安全な材料であることを示しました。

PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲル (S3、25 wt%) の in vitro および in vivo での生体適合性。

(A、B) MTT アッセイによって測定された L929 細胞および HUVEC 細胞の細胞生存率に対するコポリマーおよびヒドロゲル抽出物の効果。 データは平均±SD (n = 5) として表されました。 (C) PDLLA-PEG-PDLLA トリブロック共重合体の溶血試験 (S3)。 この写真は3時間反応後に撮影したものです。 サンプル (f) はポジティブコントロールとして使用される蒸留水であり、サンプル (a) はネガティブコントロールとして使用される生理食塩水です。 ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ−ＰＤＬＬＡコポリマーの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ（ｂ）、０．１ｍｇ／ｍｌ（ｃ）、１．０ｍｇ／ｍｌ（ｄ）、および１０．０ｍｇ／ｍｌ（ｅ）であった。 各グループの溶血率は平均±SD (n = 3) として表されました。 （D）PDLLA-PEG-PDLLA溶液（S3、PBS中25重量％、PH = 7.4）をBALB / cマウスに背部皮下注射した後の指定時間（a〜e）での周囲組織のHE染色。炎症反応。 ブランク対照として採取した正常組織を(f)に示した。 倍率：400×。 画像は n = 3 を代表したものです。

コポリマーヒドロゲルが組織再生用途に使用される場合、損傷部位をカバーする必要があるという事実を考慮して、本発明者らは、インビトロでのコポリマーの血液適合性も観察した。 医療機器の生物学的評価の国際標準である ISO 10993 のプロトコルに従って、溶血試験が使用されました。 血液毒性がないという基準は、通常、溶血率が 5% 未満であることを指します 33。 図４Ｃに示されるように、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で合成されたＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ−ＰＤＬＬＡコポリマーは、５％未満の溶血率をほとんど示さず、これは陰性対照（生理食塩水）と同様であった。 ポジティブコントロール（蒸留水）と比較して、すべてのポリマー溶液で有意な差が明らかになりました（P < 0.05）が、ポジティブコントロールは溶血の 100% として設定されました。 したがって、PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーの溶血能力は無視できるほどでした。

背部皮下注射後の PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーヒドロゲルに対する BALB/c マウスの免疫学的応答を、複数の時点でゲル周囲の結合組織および筋肉組織を観察することによって調査しました (図 4D)。 最初の週では、注射部位の周囲には好中球、リンパ球、マクロファージが密集した厚い浸潤物があり、これは急性炎症の特徴でした 34。 その後、好中球、リンパ球、マクロファージの数は 2 ～ 6 週間かけて徐々に減少し、急性炎症反応が徐々に軽度の慢性炎症反応に置き換わったことが示唆されました 25。 PDLLA-PEG-PDLLA インプラントには急性および慢性の炎症反応があり、それは 6 週間以上続きました。 10週間後、注射部位からの組織サンプルはほぼ正常組織に回復しました（この時点までにインプラントは吸収されていました）。 実験全体を通して、重大な筋肉損傷、組織壊死、充血、浮腫、出血は観察されませんでした（補足図S2を参照）。 要約すると、PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルは、生物医学用途に許容できる生体適合性を備えている可能性があります。

PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルの in vitro 分解挙動を模倣生理学的条件 (37 °C、pH 7.4) の下で評価しました。 図５Ａは、所定の分解時点における残りのヒドロゲル（Ｓ３、２５重量％）の全体像を示した。 緩衝系と平衡化すると、サンプルは徐々に 100% 近くに膨張し、最初の 4 週間以内に表面が浸食されました。 約 6 週間目で、かなりの量の水溶性生成物が緩衝液に溶解し、ゲルの形状を保持することが困難になり (図 5A (6 週間) の破線の楕円を参照)、結果としてヒドロゲルの崩壊が生じました。 。 最後に、8 週間のインキュベーション後、チューブ内のゲルは自由に流動する液体になりました。 緩衝媒体のpH変化も分解中にチェックされ、その結果が図5Bに示されています。 4日ごとに培地を交換しても、D,L-ラクチドや低分子量オリゴマーの生成により、緩衝液のpHはゆっくりと低下することが観察されました。 それにもかかわらず、pH は 5 週間依然として 6.0 ～ 7.4 の間であり、分解中のヒドロゲルの穏やかな酸性効果を示しています。これは、ヒドロゲル内の高い含水量とゲルからの酸性分解生成物の急速な拡散に起因する可能性があります。 さらに、残りのヒドロゲルを収集し、各時点で GPC によって測定しました。 図 5C に示すように、調査した分解期間中、単一ピークのプロファイルはほぼ維持されていましたが、ピーク最大値での保持時間はゆっくりと大きな値にシフトし、クロマトグラムは分解可能時間の関数として徐々に広がりました。これは、定常的な劣化を反映しています。加水分解が進むにつれてMWが増加しました。 私たちの研究により、PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルの分解は、エステル結合の定常的な加水分解とそれに続く水中でのゲルの浸食によって進行することが明らかになりました。

PBS (初期 pH 7.4) 中での 37 °C での PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲル (S3、25 wt%) の in vitro 分解。

(A) 示された分解時間におけるヒドロゲルの光学画像。画像は各時間における n = 3 を表しました。 PBS レベルはヒドロゲルの上端を大きく上回っており、したがってこれらの画像では表示フィールドを超えています。 ゲルから拡散した水溶性生成物は、画像内の破線の楕円によって強調されています (6 週間)。 (B) ハイドロゲルの分解における培地の pH の変化。 (C) in vitro で示された分解期間後の PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーの GPC プロファイル。破線の矢印はピーク分子量の減少を示しました。

インビボでのゲルの形成および維持は、室温で注射針（２５ゲージ）を用いた背側皮下注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて観察および確認された。 注射されたコポリマー溶液（Ｓ３、２５重量％）は、マウスの背中に皮下注射された後、急速に円形または不規則な形状の突起を形成した。 図６Ａは、皮下投与後１日目、２週間目、４週間目、６週間目、８週間目、および１０週間目に撮影されたいくつかの典型的な写真を示した。 目視観察では、ヒドロゲルは数週間その体積の完全性を維持し、時間の経過とともに小さくなり、6週間でサイズが明らかに減少し、約10週間で完全に消失しました。 さらに、残ったヒドロゲルの強度は時間の経過とともに減少しました。 生分解性の PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルは、in vivo での迅速な in-situ ゲル形成と長いゲル持続性を備えており、より長期間持続する薬物送達への有望な用途を示唆しています。

BALB/c マウスの背中に生理食塩水中の 25 wt% コポリマーを皮下注射した後のヒドロゲルの in vivo 分解。

(A) in vivo ゲルのメンテナンス。 皮下投与後の所定の時間に画像を撮影した。 画像は、あらかじめ決められた時間ごとの n = 3 を表しています。 残ったヒドロゲルは時間の経過とともに小さくなり、10週目までに完全に消失しました。 (B) マウスに皮下注射した後の生体内分解中に収集された PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーの GPC 追跡。 破線の円は、低分子量の分解生成物のピークを強調しました。 (C) インビトロおよびインビボ分解中の残りのヒドロゲル中のコポリマーの正規化分子量 (M(t)/M0) の変化。 ここで、M0は分解前の共重合体のMWを表す。

さらに、各時点で残ったゲルを収集し、回収した共重合体の分子量をGPCで検出して分解過程を検出した。 図６Ｂは、インビボ分解中のＰＤＬＬＡ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡヒドロゲルのＭＷの時間依存性プロファイルを示した。 MW の着実な減少は、加水分解が進行するにつれて保持時間の増加によって示されました。 in vitro 分解とは異なり、in vivo 分解では単峰性ではなく多峰性が徐々に観察されました (図 6B の点線 d を参照)。これは、皮下での低分子量の分解断片のゆっくりとした除去による可能性があります。マウスの層。 分析の便宜上、インビトロおよびインビボ両方の分解中の分子量（M(t)）の変化を図6Cに示し、MWの減少をほぼ直線的に当てはめた。 この比較は、インビボ分解がインビトロ分解よりも速いことを示しています。 同様の生分解性ポリエステル-ポリエーテルヒドロゲルで説明されているように、この違いは生体内での酵素による分解によって引き起こされる可能性があります3。

術後の腹膜癒着は、腹部または骨盤の手術の避けられない結果であり、重篤な合併症を引き起こす可能性があります 35,36。 術後の癒着を防ぐために採用される数多くの戦略の中で、物理的バリア システムが最も効果的なアプローチとして受け入れられています。 特に、生分解性の感熱性ヒドロゲルは、術後の癒着バリア材料としての役割を果たし、ますます注目を集めています 13,37。 ここでは、in situで形成されたPDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルの癒着防止効果を、図7A(a)に示すように、側壁欠損および腸摩耗のラットモデルを使用して評価した。 手術中、腹腔内の温度の上昇により、適用された欠損の形状に適合する PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲル (S3、25 wt%) の形成が 2 分以内に促進されました (図 7A(b))。 透明な市販の HA 癒着防止製剤は、欠陥に注入された後、急速に拡散し、創傷および周囲の組織を覆う薄い層を形成しました (図 7A(c))。 癒着の状態を評価するために、手術から 2 週間後にすべてのラットを屠殺し、解剖しました。 典型的な写真のいくつかを図 7A(d–f) に示し、接着事象の統計分析を表 2 に示しました。肉眼検査では、未治療の対照群 (n = 8) のすべてのラットがスコア 3 を患っていました。癒着、損傷した腹壁は盲腸にしっかりと癒着しており、癒着は切断することによってのみ分離することができました (図 7A(d))。 HA抗癒着ヒドロゲル処置群では癒着の形成が減少したが、ほとんどの動物は依然としてスコア1〜3の癒着を発症した(図7A(e))。 HA 抗癒着ヒドロゲルの残念な性能は、欠損に対する維持時間が短く、腹腔からの除去が速いためである可能性があります。 対照的に、PDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルで治療した8匹のラットのうち、大網と縫合切開部との間に中程度の癒着が得られたのは1匹だけで、残りの動物は癒着を全く受けず、欠損は14日以内にほぼ完全に再生した(図７Ａ（ｆ））。 他の群と比較して、ＰＤＬＬＡ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡヒドロゲル処置動物の接着スコア中央値は有意に低かった（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーμ検定）。 同時に、PDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルは損傷部位から完全に消失し、ヒドロゲルの分解と吸収により頭頂部および内臓表面では観察できなくなりました。

ラットモデルにおける生体内適用と癒着防止効果の評価。

画像は n = 8 を代表するものでした。(A) 術後の癒着の動物実験の写真。 (a ～ c​​) 動作中。 (d～f) 14 日後の癒着防止効果の全体的な観察。 （aおよびd）未治療の欠損をネガティブコントロールグループとして使用し、手術後14日目に強固な癒着が観察されました。 (b および e) HA ハイドロゲルを損傷部位に適用し、(d) では中程度の接着が観察されました。 (cおよびf)損傷部位はPDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルによって治療され、(f)では明らかな癒着は観察されず、腹壁および盲腸は治癒した。 (B) 手術後 14 日目の損傷部位の HE 歪みスライスの光学顕微鏡写真。 (a) 治療を受けていない動物の欠陥のある盲腸と腹壁との間の癒着。 (b および c) PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルで処理された治癒した腹壁 (b) および盲腸 (c)。 欠損部位に形成された、多数の中皮細胞を含む再中皮化組織の薄い層。 ME: 中皮細胞。 SK: 腹壁骨格筋。 SM: 内臓平滑筋。 CE: 盲腸粘膜。 倍率：50×。

図 7B に示すように、接着部位の組織学的観察も行われました。コントロール グループと HA ハイドロゲル グループから採取した組織は、大量の炎症物質が介在し、盲腸筋層が腹壁筋組織に完全に融合していることを示しました。接着部位の細胞と線維芽細胞 (図 7B(a))。 逆に、PDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルで処理した欠損は再上皮化されており、14日目には腹筋または盲腸筋の上に完全な新中皮細胞層が示されており、これは正常組織のものと同様でした（図1）。 7B(b,c))。 全体として、PDLLA-PEG-PDLLAヒドロゲルは、ラットの術後腹膜癒着予防において満足のいく有効性を示しました。

我々は、加熱すると急激なゾルゲル転移を起こす、新規な可逆的熱ゲル化 PDLLA-PEG-PDLLA トリブロック共重合体を報告しています。 ゲル化温度は、分子量、ブロック長、ポリマー濃度を調整することで、生理学的に重要な温度範囲に調整できます。 ミセルの凝集はゾルゲル転移に関与しており、ゲル化中に結晶化は形成されないと考えられていた。 ゲル化は熱的に可逆的であることが証明され、ポリマー溶液は室温で顕著なゾル相安定性を示しました。 したがって、注射は、注射器が詰まる危険性なしに容易に行うことができ、投与するのに便利であった。 インビトロとインビボの両方の研究で、新規物理ヒドロゲルの許容可能な生体適合性と生分解性が実証されました。 さらに、PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲル システムは、術後の癒着形成を軽減するのに非常に効果的であり、手術が非常に便利であることが判明しました。 このような注射可能、生体適合性、生分解性、熱可逆性のヒドロゲルは、持続的な薬物送達、組織再生用途、または他の医療用途にとって魅力的な生体材料として考えられる可能性がある。

ポリ(エチレングリコール) (PEG、Mn = 1500、1000、2000)、オクタン酸第一スズ (Sn(Oct)2、95%)、ε-カプロラクトン (ε-CL)、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2) -イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド(MTT)は、Sigma-Aldrich (USA)から購入した。 D,L-ラクチド (D,L-LA) は、中国済南市の Daigang Chemicals から購入しました。 ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) は、Gibco (米国ニューヨーク州グランド アイランド) から供給されました。この研究で使用した他の化学薬品は、中国成都の Kelong Chemical, Co., Ltd. から購入しました。 それらはすべて分析純グレードであり、受け取ったまま使用されました。

Sprague-Dawley (SD) ラット (メス、180 ± 20 g) および Balb/c マウス (メス、20 ± 2 g) は、四川大学実験動物センター (成都、中国) から購入しました。 ラットは、一定の温度 25 ± 2 °C、相対湿度 50 ～ 60% の特定病原体除去 (SPF) 環境で、12 時間の明暗サイクルで飼育されました。 食料と水への自由なアクセスが許可されました。 すべての動物は治療前に少なくとも 1 週間隔離されます。 動物実験は四川大学（中国成都）の動物管理使用委員会によって承認され、承認されたガイドライン（IACUC-S200904-P001）に従って実施されました。

トリブロック PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーは、触媒としてオクタン酸第一スズを使用し、PEG の存在下で D,L-ラクチドの開環共重合によって調製されました。 分子量 4,500 Da の典型的な PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー (L1500-E1500-L1500 としてマーク) は次のように合成されました。簡単に説明すると、PEG (20.00 g、13.33 mmol) を真空中で 100 °C で 1 時間加熱しました。微量の水分を除去します。 フラスコを室温まで冷却した後、D,L-ラクチド(40.00 g、277.78 mmol)およびSn(Oct) 2 (0.18 g、0.44 mmol)を加えた。 反応は、アルゴン保護下、140℃で12時間実施した。 最後に、得られた PDLLA-PEG-PDLLA ブロックコポリマーをエタノール (60 ml) に溶解し、過剰の予冷 n-ペンタン (600 ml) を使用して濾液から再沈殿させ、沈殿物を 45 °C で一定重量になるまで真空乾燥させました。 異なる分子量およびブロックを有する他の PDLLA-PEG-PDLLA コポリマーも同様に合成しました。 この論文では、コポリマーは LB-EA-LB (PLEL) と表記され、A と B はそれぞれ PEG ブロックと PDLLA ブロックの理論上の数平均分子量 (Mn) を表します。 比較のために、PCL-PEG-PCL (PCEC、1000-1000-1000) トリブロックコポリマーは、我々のグループによって以前に報告された、PEG によって開始されるε-CL の開環共重合によって調製されました26。 すべてのコポリマーの合成の完全なリストは、補足表S1として見つけることができます。

１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３中）を室温でＶａｒｉａｎ ４００分光計（Ｖａｒｉａｎ、米国）を用いて４００ＭＨｚで実施し、コポリマーの化学組成を特徴付けた。 サンプルを CDCl3 に溶解し、内部基準としてテトラメチルシラン (TMS) を使用して化学シフトを ppm で示しました。 ＧＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１０ ＨＰＬＣ、米国）もまた、調製されたコポリマーの巨大分子量および巨大分子量分布を決定するために使用された。 サンプルを新たに蒸留したテトラヒドロフラン (THF) に 1 mg/ml の濃度で溶解しました。 ＴＨＦを１．０ｍｌ／分の速度で溶出した。 サンプルの分子量はポリスチレン (PS) を標準として校正されました。

水中で自己組織化された PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー ミセルは、透過型電子顕微鏡 (TEM) および動的光散乱 (DLS) 測定によって特性評価されました。 ミセルの形態は透過型電子顕微鏡 (TEM、H-6009IV、日立、日本) で観察されました。 観察前に、ニトロセルロースで覆われた銅グリッド上にミセル懸濁液 (0.1 wt%、20 °C) を一滴置くことによってサンプルを準備しました。 次に、それらをリンタングステン酸でネガティブ染色し、空気中で乾燥させた。 動的光散乱（Nano-ZS 90、Malvern、Worcestershire、UK）を使用して、1 wt% および 10 wt% のコポリマー濃度でのミセルのサイズ分布を決定しました。 測定は 4 °C から 45 °C まで温度を上昇させて実行され、測定前に各温度が平衡になるまで 10 分間維持されました。

水中でのコポリマーのゾル（流動） - ゲル（流動なし）相転移温度は、内径 10 mm の 4 mL バイアル試験管を使用し、温度間隔 1 °で試験管反転法を使用して測定しました。 ０℃から沈殿が生じる温度まで。 相転移はバイアルを反転することによって視覚的に観察され、報告された論文13、23に記載されているように、1分以内に顕著な流れが観察されなかった場合にゲルと定義されました。 転移温度は、各点の 3 回の測定値の平均です。

所定の濃度のＰＤＬＬＡ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡコポリマー溶液のレオロジー測定は、平行プレートを使用するＨＡＡＫＥレオストレス６０００レオメーター（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を使用することによって実施した。 冷たいサンプルを、直径 20 mm、隙間 1 mm の平行プレートの間に置き、溶媒の蒸発を最小限に抑えるために低粘度のシリコーン オイルの薄層を慎重に重ねました。 温度掃引実験中の加熱および冷却速度は 1 °C/分でした。 貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G") を温度の関数として測定しました。データは、制御された応力 (4.0 dyn/cm2) および 1.0 Hz の周波数下で収集されました。37 でのコポリマー溶液のゲル化時間℃も調査され、G'とG''が時間の関数として記録されました。 ゲル化時間はG'がG''より大きくなる時間と定義した。比較のため、PCL-PEG-PCL（PCEC）共重合体溶液（20wt%）の加熱および冷却過程におけるG'の変化も調べた。

ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ（ＰＬＥＬ）コポリマー溶液（２５重量％）およびＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ（ＰＣＥＣ）コポリマー溶液（２０重量％）の偏光光学顕微鏡試験を、偏光光学顕微鏡（オリンパス；Ｂｈ）を使用して実施した。 -753pw) を使用して、ゲル化中の形態を研究します。 ポリマー水溶液を2枚のスライドガラスの間に置き、20℃で0分および1時間で顕微鏡画像を撮影した。 次に、スライドを 37 °C で加熱することによって瞬間的に形成されたゲルの偏光光学顕微鏡画像も撮影されました。

Cu KR 放射線を使用した PHILIPS X 線回折 (XRD、X' Pert Pro、MPDDY 1291) により、PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) コポリマー ヒドロゲルおよび PCL-PEG-PCL (PCEC) ヒドロゲルに対して結晶学的アッセイを実行しました。 サンプルは、10°から60°まで1°/分の走査速度で走査されました。

マウス L929 細胞およびヒト臍帯静脈内皮 (HUVEC) 細胞 (American Type Culture Collection、メリーランド州ロックビル) を選択して、MTT アッセイによって合成ポリマーおよび水素化物の細胞毒性を評価しました。 細胞は、50 U/ml ペニシリンおよび 50 U/ml ストレプトマイシンを補充した 10% ウシ胎児血清 (FBS、Gibco、米国) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Gibco) 中で、37 °C、5% CO2 で培養しました。 まず、調製した PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルを、10% FBS を含む DMEM を使用して 24 時間抽出しました。 次に、ストック溶液の連続希釈を実行して、一連の濃度の浸出液を得ました。 細胞懸濁液を 3 × 104 細胞/ウェルの密度で 96 ウェルプレートに分配し、24 時間インキュベートしました。 次に培地を、異なる濃度のＰＤＬＬＡ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡコポリマーまたはヒドロゲル浸出物を含む新鮮な培地と交換し、さらに４８時間までインキュベートした。 続いて、20μlのMTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド、Sigma-Aldrich、5mg/ml）を各ウェルに添加し、細胞をさらにインキュベートした。 37℃でさらに4時間。 沈殿したホルマザンを150μlのDMSOに溶解し、ELISAマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)を使用して570nmの吸光度を測定した。 細胞毒性は、培地中にブロック共重合体またはヒドロゲル浸出液が存在しない場合を１００％としたときの相対生存率（％）として定義した。 すべてのデータは平均±SD (n = 5) として表されました。

溶血試験は、報告されている方法として、in vitro で生理食塩水中の PDLLA-PEG-PDLLA (S3) コポリマーの溶液に対して実行されました 3,33。 この実験では、異なる濃度のサンプル 2.5 ml を、生理食塩水中の繊維外ウサギ赤血球懸濁液 (2%) 2.5 ml に加え、37 ℃ でインキュベートしました。 生理食塩水および蒸留水をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。 37℃で3時間インキュベートした後、赤血球懸濁液を2000 rpmで10分間遠心分離し、上清の色を比較しました。 絶対的な無色の上清溶液は、溶血がないことを意味します。 逆に、上澄み液が赤い場合は溶血を意味します。 次いで、赤血球懸濁液の上清を収集し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｌａｍｂｄａ ３５、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で５４０ｎｍで検出して、溶血率を測定した。 溶血率は次の方程式に従って計算されました。

すべての結果は 3 つの独立した実験のデータから推定され、すべてのデータは平均 ± SD (n = 3) として表されました。

ハイドロゲルの in vitro 分解挙動は、模擬生理学的条件下で以前の報告と同様の方法で測定されました 25。 簡単に説明すると、ポリマー水溶液 (25 wt%、1 ml) を試験管に注入し、振盪浴中で 37 ℃、50 ストローク/分でインキュベートしました。 １０分後、形成されたゲルに９ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を添加した。 培地のpHを維持するために、緩衝液を4日ごとに新しいものと交換した。 所定の時間に、いくつかのサンプルを振盪浴から取り出し、緩衝液を除去し、残りのゲルを一定の重量になるまで凍結乾燥した。 乾燥サンプルの分析のために、1H NMRおよびGPCの実験を行った。 培地を新しい培地と交換する前に、指定された時間間隔で培地の pH 変化を pH メーターで測定しました。

背部皮下投与時のインビボゲル形成および分解試験をBALB/cマウスで実施した。 ＰＤＬＬＡ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡトリブロックコポリマーの０．５ｍｌ水溶液（ＰＢＳ溶液中２５重量％、ｐＨ７．４）を、室温で２５ゲージの針を備えた注射器によりマウスの背部皮下注射した。 所定の時間に、３匹のマウスが頸椎脱臼により屠殺された。 注射部位を慎重に開き、残ったゲルの写真を撮りました。 動物の残りのゲルは、GPC による MW の分析のために取り出しました。 一方、皮下インプラントと心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓を含む主要臓器の周囲の筋肉が外科的に除去され、その後、さらなる組織病理学的検査のためにヘマトキシリン・エオシン（HE）染色が行われました。

PDLLA-PEG-PDLLA ハイドロゲルの抗癒着効果は、側壁欠損 - 盲腸摩耗の Sprague-Dawley (SD) ラット モデルを使用してテストされました 31,37。 この研究では、24 匹の SD ラットをモデル動物とし、ランダムに 3 つのグループに分けました (n = 8)。 研究中、すべてのモデル動物は人道的に扱われました。

手術では、実験期間全体を通じて無菌技術が適用されました。 ラットを抱水クロラール（１０％、３ｍＬ／ｋｇ）の腹腔内注射によって完全に麻酔し、仰臥位に置き、腹部領域の毛を剃り、腹側正中切開によって腹部を露出させた。 腹部癒着は、Yoon Yeo の方法に従って誘発されました。 他31． まず、腹膜およびその下にある部分的な筋肉層が腹壁から切除されるまで、右側腹壁にメスを使用して、点状出血を伴う2×2 cmの壁側腹膜欠損を作成しました。 次に、盲腸漿膜の２ｃｍ ２ を、漿膜からの血液の滲出が観察されるが穿孔されないまで、滅菌乾燥外科用ガーゼで擦過した。 次いで、２つの損傷表面を、接触させるために３－０絹縫合糸で並置した。 治療群については、１ｍｌのＰＤＬＬＡ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ溶液（ＰＢＳ溶液中２５重量％、ｐＨ７．４）を腹壁欠損および損傷した盲腸表面にそれぞれ均一に塗布した。 ヒドロゲルを完全にゼラチン化させました（約 2 分間）。 次に、すべての動物の切開部を 3/0 サージカル シルクで 2 層に閉じました。 陽性対照群の場合、欠損は 1 ml HA ハイドロゲル (市販の癒着防止ヒアルロン酸ハイドロゲル、Xinkeling®) で治療されました。 未治療の欠損を有する残りの 8 匹のラットを陰性対照として使用しました。 手術の 2 週間後、ラットを頸椎脱臼により屠殺し、癒着防止効果を 2 人の観察者によって二重盲検法で評価しました。 各動物は、この分野で広く使用されている次の標準癒着スコアリング システムに従って評価されました。スコア 0 = 癒着なし。 スコア 1 = 軽度の癒着、容易に分離できる腸管癒着。 スコア 2 = 中等度の腸癒着、鈍的切開により分離可能。 スコア 3 = 重度の腸癒着、鋭利な切開を必要とする癒着​​38。 さらに、損傷した盲腸、損傷した腹壁、および癒着関連組織から標本を採取しました。 次に、得られた標本を 10% ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、切片を作成し、組織学的検査のために HE 染色で染色しました。

統計分析は、SPSS 15.0 ソフトウェア (米国イリノイ州シカゴ) を使用して実行されました。 結果は平均値 ± SD として表されます。 癒着スコアは必ずしも正規分布に従わないため、統計的推論はマンホイットニーμ検定を使用して行われました。 統計的有意性は P ≤ 0.05 として決定されました。

この記事を引用する方法: Shi, K. et al. in vitro および in vivo での可逆 PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー サーモゲルの合成、特性評価、および応用。 科学。 議員第6号、19077年。 土井: 10.1038/srep19077 (2016)。

Moon、HJ、Ko du、Y.、Park、MH、Joo、MK、Jeong、B。その場ゲル化生物医学材料としての温度応答性化合物。 チェ。 社会 Rev. 41、4860–4883 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Ko、DY、Shinde、UP、Yeon、B.、Jeong、B。生物医学用途のための現場形成ゲルの最近の進歩。 プログレ。 ポリム。 科学。 38、672–701 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Zhang、Z.ら。 術後癒着防止バリアとしての生分解性かつ熱可逆性の PCLA-PEG-PCLA ハイドロゲル。 バイオマテリアル 32、4725–4736 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Ruel-Gariepy, E. & Leroux, JC その場でヒドロゲルを形成する – 温度に敏感なシステムのレビュー。 ユーロ。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． バイオ医薬品。 58、409–426 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

ゴング、C.ら。 薬物送達システムとしての感熱性ポリマーヒドロゲル。 カー。 医学。 化学。 20、79–94 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Brown, W.、Schillen, K.、Almgren, M.、Hvidt, S. & Bahadur, P. ポリ(エチレンオキシド)/ポリ(プロピレンオキシド)/ポリ(エチレンオキシド) トリブロックコポリマーにおけるミセルとゲルの形成水溶液: 動的および静的な光散乱および振動せん断測定。 PJ物理学。 化学。 95、1850–1858 (1991)。

記事 CAS Google Scholar

Johnston, TP & Palmer, WK ラットにおけるポロクサマー 407 誘発高トリグリセリド血症のメカニズム。 生化学。 薬理学。 46、1037–1042 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Johnston, T.、Punjabi, M. & Froelich, C. マウスの腹腔内注射後のポロクサマー 407 ゲルマトリックスからのインターロイキン 2 の持続送達。 Ｃ．Ｐｈａｒｍ． 解像度 9、425–434 (1992)。

記事 CAS Google Scholar

Jeong, B.、Bae, YH、Lee, DS & Kim, SW 注射可能な薬物送達システムとしての生分解性ブロック共重合体。 Nature 388、860–862 (1997)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Aamer, K. PLLA-PEO-PLLA トリブロック共重合体ヒドロゲルのレオロジー研究。 バイオマテリアル 25、1087–1093 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Jeong, B.、Bae, YH & Kim, SW PEG-PLGA-PEG トリブロック共重合体水溶液の熱可逆的ゲル化。 高分子 32、7064–7069 (1999)。

記事 ADS CAS Google Scholar

リー、DSら。 水溶液中での生分解性PLGA-ブロック-PEO-ブロック-PLGAトリブロックコポリマーの新規な熱可逆性ゲル化。 マクロモル。 急速なコミュニケーション。 22、587–592 (2001)。

3.0.CO;2-8" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1521-3927%2820010501%2922%3A8%3C587%3A%3AAID-MARC587%3E3.0.CO%3B2-8" aria-label="Article reference 12" data-doi="10.1002/1521-3927(20010501)22:83.0.CO;2-8">記事 CAS Google Scholar

ゴング、C.ら。 熱感受性 PCL-PEG-PCL ハイドロゲルをベースとした、生分解性の in situ ゲル形成制御薬物送達システム。 パート 2: ゾル-ゲル-ゾル転移と薬物送達挙動。 アクタ。 バイオメーター。 5、3358–3370 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Bae、SJ 他ポリ（エチレングリコール）およびポリカプロラクトンのトリブロックおよびマルチブロック共重合体水溶液のゲル化挙動。 高分子 39、4873–4879 (2006)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Jiang, Z.、Deng, X. & Hao, J. ポリ(ɛ-カプロラクトン-co-D,L-ラクチド)-ポリ(エチレングリコール)-ポリ(ɛ-カプロラクトン-co-D,L-の熱ゲル化ヒドロゲルラクチド）およびポリ（ε-カプロラクトン-co-L-ラクチド）-ポリ（エチレングリコール）-ポリ（ε-カプロラクトン-co-L-ラクチド）水溶液。 Ｊ．Ｐｏｌｙｍ． 科学。 ポール。 化学。 45、4091–4099 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Park、SY、Han、BR、Na、KM、Han、DK、Kim、SC 星型 PLLA-PEO ブロック共重合体の水溶液のミセル化とゲル化。 高分子 36、4115–4124 (2003)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Li, F.、Li, S.、El Ghzaoui, A.、Nouailhas, H. & Zhuo, R. モノヒドロキシル化 PEG-PLA と塩化アジポイルをカップリングすることによって得られる PEG-PLA-PEG トリブロック コポリマーの合成とゲル化特性。 Langmuir 23、2778–2783 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

藤原 哲 他 PLLA-PEG-PLLA ブロックコポリマーと PDLA-PEG-PDLA ブロックコポリマー間のステレオ複合体形成による新規な熱応答性ヒドロゲルの形成。 マクロモル。 生物科学。 1、204–208 (2001)。

3.0.CO;2-H" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1616-5195%2820010701%291%3A5%3C204%3A%3AAID-MABI204%3E3.0.CO%3B2-H" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/1616-5195(20010701)1:53.0.CO;2-H">記事 CAS Google Scholar

Li, S. & Vert, M. ポリ(エチレングリコール)の存在下でのl(d)-ラクチドの開環重合によって調製されたブロックコポリマーの合成、特性評価およびステレオコンプレックス誘発ゲル化。 高分子 36、8008–8014 (2003)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Zhang、Y.ら。 生体吸収性 PLA-PEG-PLA ハイドロゲルから調製された新しいチモペンチン放出システム。 内部。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 386、15–22 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Hiemstra, C.、Zhong, Z.、Li, L.、Dijkstra, PJ & Feijen, J. PEG-(PLLA)8 および PEG-(PDLA)8 スターブロックコポリマーの立体錯体化による生分解性ヒドロゲルの in-situ 形成。 生体高分子 7、2790–2795 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Hiemstra, C.、Zhong, Z.、Dijkstra, PJ & Feijen, J. PEG-(PLA)2 および PEG-(PLA)8 ブロック共重合体のステレオコンプレックス媒介ゲル化。 マクロモル。 症状 224、119–132 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Lee, J.、Bae, YH、Sohn, YS & Jeong, B. ポリ(L-乳酸)とポリ(エチレングリコール)の交互マルチブロック共重合体の熱ゲル化水溶液。 Biomacromolecules 7、1729–1734 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Lee, H. & Lee, D. 水溶液中の PLA-ブロック-PEO-ブロック-PLA トリブロック ステレオ共重合体の熱応答性相転移。 マクロモル。 解像度 10、359–364 (2002)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Yu, L.、Zhang, Z.、Zhang, H. & Ding, J. ゾルとブロック共重合体の沈殿物を水中で混合して形成される熱可逆性ヒドロゲルの生分解性と生体適合性。 生体高分子 11、2169–2178 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

ゴング、CY 他熱感受性 PCL-PEG-PCL ハイドロゲルに基づく生分解性 in situ ゲル形成制御薬物送達システム: パート 1 – 合成、特性評価、および急性毒性評価。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 科学。 98、4684–4694 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

ゴング、C.ら。 感熱性ヒドロゲル複合材料中の薬剤を充填したミセルによる結腸直腸腹膜癌症の効率的な抑制。 ナノスケール 4、3095–3104 (2012)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Gao, X. et al. 腹部癒着の形成を防ぐための新しい感熱性ハイドロゲル。 内部。 J. ナノメディシン。 8、2453–2463 (2013)。

記事 Google Scholar

Lei, K.、Shen, W.、Cao, L.、Yu, L. & Ding, J. 高い放射線不透過性を備えた注入可能なサーモゲル。 化学。 共通。 51、6080–6083 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Yu, L.、Chang, G.、Zhang, H. & Ding, J. ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)-b-ポリ(エチレングリコール)の温度誘起自発的ゾルゲル転移-b-ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)トリブロックコポリマーおよび水中のそれらのエンドキャップされた誘導体。 Ｊ．Ｐｏｌｙｍ． 科学。 ポール。 化学。 45、1122–1133 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

リー、L.ら。 生分解性で、術後癒着防止のための in situ 架橋結合キトサン - ヒアルロン酸ベースのヒドロゲル。 バイオマテリアル 35、3903–3917 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

魏、CZら。 術後の癒着を防ぐための熱感受性キトサンベースのハイドロゲルバリア。 バイオマテリアル 30、5534–5540 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Ci, T.、Chen, L.、Yu, L. & Ding, J. 適度に溶ける薬物をポリマーサーモゲルにカプセル化することで腫瘍の退縮が達成されます。 科学。 議員4, 5473 (2014)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ヒレル、AT et al. げっ歯類およびヒトの軟組織修復のための光活性化複合生体材料。 科学。 翻訳。 医学。 3、93ra67–93ra67 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Zong, X. et al. エレクトロスピニングされた生体吸収性ナノ繊維ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）ベースの膜による術後誘発腹部癒着の予防。 アン。 外科。 240、910–915 (2004)。

記事 Google Scholar

Ten Broek, RP、Kok-Krant, N.、Bakkum, EA、Bleichrodt, RP & van Goor, H. 術後の癒着形成を軽減するためのさまざまな外科技術: 体系的レビューとメタ分析。 ハム。 リプロド。 19、12 ～ 25 を更新 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ヨー、Ｙら。 ブデソニドを送達する in situ 架橋可能なヒアルロン酸ヒドロゲルによる腹膜癒着の予防。 J.コントロール。 リリース。 120、178–185 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Fu, S. et al. 術後腹部癒着防止バリアとしての生分解性で熱感受性のモノメトキシポリ(エチレングリコール)-ポリ(乳酸)ヒドロゲル。 Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． ナノテクノロジー。 10、427–435 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

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この研究は、中国国家ハイテクプロジェクト (863-プロジェクト、2015AA020316)、国家自然科学財団 (NSFC31525009 および 31222023)、および中国国際科学技術協力プログラム (2013DFG52300) によって財政的に支援されました。

国家主要生物療法・がんセンター研究所、四川大学西中国病院、および生物療法共同イノベーションセンター、成都、610041、中国

Kun Shi、Ya-Li Wang、Ying Qu、Jin-Feng Liao、Bing-Yang Chu、Hua-Ping Zhang、Feng Luo、Zhi-Yong Qian

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Z.-YQ と KS は研究の設計と調整を行いました。 KS はすべての実験を実行し、データを分析し、原稿を作成しました。 FL はデータについて議論しました。 Y.-LW と B.-YC が材料の合成に参加しました。 YQ、J.-FL、H.-PZ は動物実験と統計分析を実施しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材がクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Shi、K.、Wang、YL.、Qu、Y. 他。 in vitro および in vivo での可逆 PDLLA-PEG-PDLLA コポリマー サーモゲルの合成、特性評価、および応用。 Sci Rep 6、19077 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep19077

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受信日: 2015 年 9 月 9 日

受理日: 2015 年 12 月 3 日

公開日: 2016 年 1 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19077

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