ヒトリンゴ酸酵素 2 の抑制はエネルギー代謝を変化させ、細胞呼吸を阻害します

Communications Biology volume 6、記事番号: 548 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ヒトミトコンドリア NAD(P)+ 依存性リンゴ酸酵素 (ME2) は、がんやてんかんに関与する可能性のある細胞代謝における役割でよく知られています。 我々は、ME2 酵素活性を標的とする cyro-EM 構造に基づく強力な ME2 阻害剤を紹介します。 ME2 阻害剤複合体の 2 つの構造は、5,5'-メチレンジサリチル酸 (MDSA) とエンボン酸 (EA) が ME2 のフマル酸結合部位にアロステリックに結合することを示しています。 突然変異誘発研究は、Asn35 と Gln64-Tyr562 ネットワークが両方の阻害剤の結合に必要であることを示しています。 ME2 の過剰発現はピルビン酸と NADH の産生を増加させる一方で、細胞の NAD+/NADH 比を減少させます。 ただし、ME2 ノックダウンは逆の効果をもたらします。 MDSA と EA はピルビン酸合成を阻害するため、NAD+/NADH 比が増加します。これは、これら 2 つの阻害剤が細胞の ME2 活性を阻害することで代謝変化を妨げることを意味します。 ME2 を沈黙させたり、MDSA または EA で ME2 活性を阻害すると、細胞呼吸と ATP 合成が減少します。 私たちの発見は、ME2がミトコンドリアのピルビン酸とエネルギー代謝、および細胞呼吸に重要であり、ME2阻害剤がこれらのプロセスに関与する癌やその他の疾患の治療に役立つ可能性があることを示唆しています。

リンゴ酸酵素 ME は、L-リンゴ酸からピルビン酸への変換を触媒し、同時に NAD(P)+ を NAD(P)H1、2、3、4 に還元する新規クラスの酸化的デカルボキシラーゼです。 哺乳類のリンゴ酸酵素は、細胞内局在性と補因子特異​​性に基づいて、ME1、ME2、および ME3 の 3 つのアイソフォームに分類され、それぞれが異なる生理学的機能を果たします。 ME1 は、還元生合成のための細胞質 NADPH の生成と、ピルビン酸から L-リンゴ酸への逆変換によるトリカルボン酸 (TCA) 回路中間体の補充に関与する細胞質 NADP+ 依存性 ME です 5,6。 ME3 は、わずかに発現されるミトコンドリア NADP+ 依存性 ME であり、ミトコンドリアへの NADPH の循環に関与している可能性があります 5。 ME2 は、ミトコンドリアに存在する NAD+ または NADP+ 依存性 ME であり、ミトコンドリア NADH および NADPH4、7、8、9 の生成に関与します。 ME2 は、その二重補因子特異​​性と複雑なアロステリック制御システムにより、他の 2 つの哺乳動物アイソフォームとは区別されます。 さらに、ME2 アイソフォームのみが基質 L-リンゴ酸と協働し、フマル酸はアロステリックに酵素を活性化することができますが、ATP はその酵素活性を阻害します 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。

ME2 は最初に肝癌ミトコンドリアで同定され 8、その後、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳がんでも同定され、がんの進行と生存に強く関連していることが確認されています 9,20,21,22。 その結果、それはがん治療の有望な標的であることが確認されました23。 これは、ヒト、ラット、およびマウスのインスリノーマ細胞の膵島にも存在し、アミノ酸刺激によるインスリン分泌に寄与し、グルコースが制限されている場合のクレブス回路流束の増加に十分なピルビン酸を提供する可能性があります 24,25。 ME2 は骨芽細胞の増殖と分化にも必要です 26。 ME2 活性は脳のシナプス ミトコンドリアで非常に豊富であり、ピルビン酸リサイクル経路およびシナプス終末におけるミトコンドリア内の還元型グルタチオンの維持において役割を果たしていることが示されています 27。 ME2 遺伝子はてんかん症候群に関連していると考えられています。 ある研究では、症例対照法と家族ベースの関連付け法の両方を使用して、特発性全般化てんかん（IGE）と関連していることが判明しました。

ME2 は、てんかん症候群に関連する遺伝子として同定されています。 これは、症例対照法と家族ベースの関連付け法の両方を使用したある研究で、特発性全般化てんかん（IGE）に関連する遺伝子と同定されました28。 一塩基多型 ME2 (SNP) のハプロタイプは、IGE のリスク増加と関連付けられており、思春期発症の遺伝性全般性てんかんの素因となります 29。

腫瘍細胞では、トリカルボン酸回路を介したグルタミン酸分解が、ME24、9、30を介したピルビン酸へのリンゴ酸の酸化と協力する可能性があります。 グルタミン酸とグルタミンはがん細胞のエネルギー源として使用され、ME2 はグルタミン酸分解において重要な役割を果たしている可能性があります 30,31。 ME2 は、ミトコンドリア内でグルタミンに由来する L-リンゴ酸をピルビン酸と NAD(P)H30,31,32,33 に変換します。 NADH とピルビン酸を生成することにより、ME2 は急速に増殖する組織や腫瘍細胞におけるエネルギー生成に重要な役割を果たしている可能性があります 8,31,34。 NADPH を生成することにより、ME2 はグルタチオン還元のための還元等価物を生成します 35,36。

ME2 は p53 によって負に制御されることが示されており、その発現は p5337 によって引き起こされる細胞老化から癌細胞を保護します。 p53 の 2 つの機能的応答要素は ME2 遺伝子の最初のイントロンに位置しており、p53 が ME237 の転写抑制因子として機能する可能性があることを示唆しています。 実際、p53 とリンゴ酸酵素の間には相互調節関係が存在し、ME2 が関与する代謝経路を通じて細胞の不可逆的な運命を決定します 38。 我々は、皮膚黒色腫における ME2 の重要性を実証しました 20。 黒色腫細胞における ME2 欠損は ATP レベルの低下と ROS レベルの増加をもたらし、これにより AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) 活性が誘発され、p53 のリン酸化と活性化が促進され、最終的には細胞死が引き起こされます 20。 リンゴ酸基質およびアロステリック活性化因子フマル酸塩の構造類似体のヒト ME2 に対する影響が研究されています 39,40。 さらに、私たちの研究室は、ME2 特異的である小分子阻害剤エンボン酸 (EA) を発見しました。EA は肺がん細胞の増殖を阻害し、細胞老化を誘導します 41。

リンゴ酸酵素はホモテトラマー、または二量体の二量体であり、二量体の界面が四量体の界面よりも強く結合しています42。 リガンドと複合体を形成したヒト ME2 の結晶構造は、酵素の各モノマーに 2 つの追加のリガンド結合部位が含まれていることを明らかにしています 11。 1 つの部位は二量体界面に位置し、アロステリック活性化因子フマル酸塩の結合を担っています 11。 四量体界面に位置するもう 1 つの部位は、NAD+ や ATP などの別のヌクレオチドに結合できます。 この 2 番目のヌクレオチド結合部位は「エキソ部位」と呼ばれます。 エキソ部位のヌクレオチドリガンドは、ME219 の四次構造の制御や触媒作用など、個別の生物学的機能を持っています。 人間の ME2 は開いた形と閉じた形の両方で存在できます。 補因子 NAD+ との二元複合体におけるヒト ME2 の構造はオープン I 型を表しますが、ME2-ヌクレオチド (NAD+、NADH または ATP)-二価カチオン (Mg2+ または Mn2+)-基質 (ピルビン酸) などの五元複合体の構造は、または L-リンゴ酸)-フマル酸は、酵素の閉鎖型 II の代表です 10、11、43。 ヒト ME2 遺伝子にはコード領域に多数の一塩基変異体 (SNV) が含まれており、これが酵素の機能に影響を与える可能性があります。 我々は以前に、アロステリックフマル酸結合部位およびエキソ部位のSNVがME2の不活化または過剰活性化を引き起こすことを確立しており、解明されたME2-SNV構造はSNV酵素の異常な速度論的特性を説明するための分子基盤を提供する44。

この記事では、ME2 とそのアロステリック阻害剤の複雑な構造について説明し、構造遷移に対する阻害剤の悪影響を実証します。 エネルギー代謝における ME2 の役割についても説明します。 私たちは、3 つの非癌細胞における ME2 媒介ピルビン酸およびエネルギー代謝の阻害におけるアロステリック ME2 阻害剤である EA および MDSA の有効性を調査し、ピルビン酸と NADH 生成を増加させ、ATP 生成を促進することにより、エネルギー代謝における ME2 の役割を実証しました。ミトコンドリアが高レベルの酸化ストレスにさらされたときの抗酸化作用。 この記事では、酵素のアロステリック制御を完璧に説明し、アロステリック阻害剤が酵素の構造と機能、さらには細胞のエネルギー代謝に及ぼす影響を示します。 さらに。 生化学的、生物物理学的、および細胞代謝のアプローチを使用して、ミトコンドリアにおける ME2 の役割と細胞質における PFK の役割を説明します。 どちらもそれぞれの細胞小器官でエネルギーを感知する役割を果たします。

二量体または四量体界面、フマル酸結合部位、およびエキソ部位の部位特異的突然変異誘発に基づいて、我々は以前に、4,4'-メチレン-ビス(3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸)もエンボン酸 (EA) として知られ、ME241 のアロステリック阻害剤として作用する可能性があります。 さらに、ME2 酵素活性に対するさまざまなジサリチル酸およびナフトエ酸誘導体の阻害効果が調査されました (図 S1)。 これらの誘導体の化学構造を、IC50 値とともに表 S1 に示します。 これらの化合物のうち、ジサリチル酸、5,5'-メチレンジサリチル酸（MDSA）は、0.51μMのIC50でME2に対して顕著な阻害効果を示しました（図S1a）が、サリチル酸はME2に対して無視できるほどの阻害効果しかありませんでした（IC50 = 800.7 μM;図S1b)。 図S1bに示すように、MDSAと同様の炭素骨格を有する3-ベンゾイル安息香酸は、ME2活性に対する阻害効果が無視でき、IC50値は652μMでした。

ビス 3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸である EA は、1.1 μM の IC50 で ME2 に対して顕著な阻害効果を示しました。 (図S1a)。 5' 位にヒドロキシル基を持つ 3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、3,5-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸 (IC50 12.4 μM、図 S1b) の阻害効果は、3,5 よりも優れています。 7'位にヒドロキシル基またはブロモ基を有する-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸、3,7-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸および7-ブロモ-3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸（IC50値37.6μMおよび307.8μM） 、それぞれ;図S1b)。 1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸や3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸など、隣接するヒドロキシル基を持つナフトエ酸誘導体は、活性に対する阻害効果がEAよりもかなり低い（IC50値はそれぞれ74.7μMと105.4μM）。 .S1b)。 ジカルボン酸を含むナフタレンである2,6-ジカルボキシナフタレンは、ME2活性に対する阻害効果が無視でき、IC50値は352.9μMでした（図S1b）。

MEの活性部位では、基質と金属の結合に必要な残基が、ME1およびME23、10、42、43にわたって実質的に保存されている。 ME1 ではなく ME2 はアロステリック酵素であり、フマル酸塩またはヌクレオチドは異なるアロステリック部位に結合して ME2 活性を調節します 3,11,12,16,17,19。 実際、ME2 とは異なり、ME1 には二量体界面にアロステリック部位がないため、フマル酸塩によって活性化することができません 3,15。 配列アラインメントと反応速度論的研究は、この可能性を実証しています12、16、17、45。 ME2 のアロステリック サイト残基の大部分は、ME1 では保存されていません。 したがって、ME1 はフマル酸塩によって活性化することができず、ME1 がアロステリック阻害剤に対して感受性がない可能性があることは当然です。

ME2 は MDSA および EA 阻害に対して非常に感受性が高いのに対し、ME1 は著しく感受性が低いことから、両方の阻害剤がアロステリック部位に結合することが示されています。 この記事では、ME2-MDSAおよびME2-EAのクライオEM構造を実証し、ME2特異的阻害剤MDSAおよびEAの結合部位が二量体界面のアロステリックフマル酸結合部位に位置していることを明らかにしました（図1）。 この構造は、ME1 の Asp37 が MDSA と EA の結合を立体的に妨げる可能性があるのに対し、ME2 ではグリシンが対応する残基であることを示しています。

a ~ 2.7 Å の分解能での ME2-NAD+ 二元複合体のクライオ EM 構造。 exo-site NAD+ は青色で強調表示されます。 マップは平均より 6.7 σ 上の等高線になります。 b 〜2.7 Åの分解能でのME2-NAD+-EA三元複合体のクライオEM構造。 阻害剤 EA はオレンジ色で強調表示されます。 アクティブサイト NAD+ は赤色で色付けされ、エキソサイト NAD+ は青色で色付けされます。 マップの等高線は 8.3 σ です。 c〜2.8Åの分解能でのME2-NAD+-MDSA三元複合体のクライオEM構造。 阻害剤 MDSA は緑色で示されています。 アクティブサイト NAD+ は赤色で色付けされ、エキソサイト NAD+ は青色で色付けされます。 マップの等高線は 8 σ です。 d エキソサイト NAD+ を含む ME2 二元複合体の漫画表現 (青い球)。 アロステリック サイト (赤い破線の円で示されます)、活性サイト (紫の破線の円で示されます)、およびエキソ サイト (ピンクの破線の円で示されます) が示されています。 垂直および水平の破線は、それぞれ二量体および四量体の界面を示します。 e アロステリックサイト EA (オレンジ色の球)、アクティブサイト NAD+ (赤色の球)、およびエキソサイト NAD+ (青色の球) を含む ME2 三元複合体。 f アロステリックサイト MDSA (緑色の球)、アクティブサイト NAD+ (赤色の球)、およびエキソサイト NAD+ (青色の球) を含む ME2 三元複合体。

NADおよび阻害剤（EAまたはMDSA）との三元複合体におけるヒトME2のクライオEM構造は、それぞれ2.72Åおよび2.82Åの解像度で決定されました（図S2および表S2）。 さらに、阻害剤の非存在下でヒトME2のクライオEM構造を2.72Åの分解能で決定しました（図S2および表S2）。 阻害剤を含まない ME2、EA-ME2、および MDSA-ME2 単粒子クライオ EM 分析は、代表的なクライオ EM 画像、参照フリーの 2D クラス平均、最終再構成の解像度マップ、ゴールド スタンダード FSC プロットとして表示されました。 3D再構成、および粒子画像のオイラー角分布（それぞれ図S2a〜e）。 阻害剤を含まない ME2 構造、ME2-EA、および ME2-MDSA のデータ処理ワークフローを図 1 および 2 に示します。 S3～S5。

四量体阻害剤フリーのME2の全体的な低温EM構造（図1aおよび1d）は、NAD + 42を含む二元複合体の構造に匹敵します。 電子顕微鏡画像の二次元クラス平均（図S2b）に示されているように、4つのモノマーは構造の4つの隅に位置しています。 阻害剤を含まないヒト ME2 のクライオ EM 構造では、サンプルは補因子 NAD+ の非存在下で精製されており、ME2 サブユニットのエキソ部位には 1 つの NAD+ 分子のみが観察されます (図 1a および 1d)。 阻害剤を含まない構造の活性部位は、ME242 の開いた形態と同様に、溶媒にさらされます。

両方の ME2 阻害剤複合体 (ME2-EA および ME2-MDSA) は、補因子 NAD+ および Mg2+、天然基質ピルビン酸 (PYR)、および阻害剤 (EA または MDSA) の存在下で生成されましたが、構造は、阻害剤（EAまたはMDSA）は二量体界面のアロステリック調節部位に結合します（それぞれ図1b、c）が、NAD +分子は四量体界面の各活性部位およびエキソサイトに現れます（図1e、f）。 ヒト ME2 のこれら 3 つの低温 EM 構造では、NAD+ のニコチンアミド モノヌクレオチド (NMN) 部分の電子密度が大幅に低くなり (図 1)、高度に無秩序である可能性があることを示唆しています。 NAD+ の分離が不十分な NMN 成分は、ME211 の結晶構造にも見られます。

これまでの構造研究により、ME2 の開いた立体構造と閉じた立体構造が明らかになり、それぞれ酵素の不活性状態と活性状態に対応します。 活性部位は、不活性な開いた形では溶媒に完全にさらされています。 二価カチオン (Mn2+ または Mg2+) と基質 (リンゴ酸またはピルビン酸) が結合した後、活性部位の閉鎖は主に、アロステリック部位に向かう活性部位ドメインの剛体移動によって媒介されます。 結果として、二価カチオンと基質は活性な閉じた形で溶媒から保護されます 3,44。

結合した阻害剤 (ME2-EA および ME2-MDSA) を含む構造では、EA と MDSA の両方が二量体界面のアロステリック部位に結合します。 フマル酸塩とは異なり、両方の阻害剤のかさ高により追加のスペースが必要となるため、ドメイン B が活性部位に向かって押し出されます。 この動きにより、Glu255、Asp256、およびAsp279の空間的位置が変化します。 Arg165 は、特に側鎖の位置で Asp256 を置き換えます。 高度に保存されたアミノ酸 Glu255、Asp256、および Asp279 が、MEs3、10、11、43 の活性部位における二価イオンの触媒作用およびキレート化に必要であることが実証されています。 したがって、EA と MDSA によって引き起こされる空間配置により、活性部位の二価イオンが失われ、触媒作用が阻害されます。

フマル酸塩はヒト ME2 の触媒活性を引き起こすことができ、アロステリック活性化因子は各活性部位から約 30 Å 離れた二量体界面 (図 2d) で見つかりました (図 1)。 この活性化因子は、アロステリック領域の Arg67 および Arg91 の側鎖と相互作用し（図 2d）、突然変異誘発研究により、フマル酸結合における Arg67 および Arg91 残基の重要性が確認されています 11,43。

構造は、アロステリック サイトのリガンド相互作用 (上のパネル) とアロステリック サイトを囲むクーロン表面 (下のパネル) を示しています。 灰色のメッシュはリガンドの密度を表し、棒は相互作用する残基を表します。 水素結合相互作用はシアン線、カチオン-π相互作用は緑色線、イオン対はマゼンタ線で示されています。 a、e 阻害剤 EA は、ME2-EA 複合体のオレンジ色の棒で示されています。 マップは平均より 6.5 σ 上の等高線になります。 b、f MDSA は、ME2-MDSA 複合体内の緑色の棒で示されています。 マップの等高線は 7.5 σ です。 c、g 阻害剤を含まない ME2 のアロステリック部位。 d、h 活性化剤フマル酸塩は、ME2 の閉じた形で濃いシアン色の棒で示されています (PDB ID: 1PJ3)。 マップの等高線は 1.8 σ です。 クーロン面は、UCSF Chimera55 のデフォルト設定を使用して計算されました。

ME2阻害剤複合体（ME2-EAおよびME2-MDSA）の低温EM構造は、二量体界面のアロステリック制御領域に阻害剤EAまたはMDSAがあることを明らかにします（それぞれ図1b、c）。 EAは、イオン対形成、陽イオン-π相互作用、水素結合、および周囲のアミノ酸との疎水性相互作用を介してME2と相互作用します（図2a）。 残基 Arg67 および Arg91 は EA とカチオン-π相互作用を持ち、Arg91 はさらに EA とイオンペアを形成します。 Asn35、Asn92、およびGln64は水素結合を介してEAと相互作用し、Gln64、Asn92、およびTyr562側鎖の間に水素ネットワークが存在します（図2a）。

MDSA は隣接するサブユニット残基 Arg67 および Arg128 とイオンペアを形成しますが、Arg91 はカチオン-π相互作用を介して MDSA と相互作用します。 Gln64はMDSAと水素結合を形成し、Gln64、Asn92、およびTyr562側鎖の間にも水素ネットワークが存在します（図2b）。 阻害剤を含まないME2構造（図2c）と比較して、ME2-EA複合体のArg91はEA側にわずかにシフトし、カチオン-π相互作用を形成しています（図2a）。 ME2-MDSA複合体の構造では、Arg91の側鎖がMDSAに向かって方向を変えるだけでなく、別のサブユニットのArg128の側鎖も移動してMDSAと相互作用します（図2b）。 主にイオンペア相互作用を介してArg67およびArg91の側鎖と相互作用するフマル酸塩とは異なり（図2d）、阻害剤EAおよびMDSAは主にイオンペアおよびカチオン-パイ相互作用を介してArg67およびArg91の側鎖と相互作用します（図2a、b)。 アロステリックサイトポケットは拡張可能であるため、EAやMDSAなどのフマル酸塩より大きな分子を収容できます（図2e〜h）。

4 つの活性部位はヒト ME2 四量体構造の隅にあり、約 60 Å 離れています (図 1)。 阻害剤を含まない ME2 オープンフォームのクライオ EM 構造は、エキソサイト NAD+ のみを含む二元複合体です。 活性部位にはリガンドがなく、完全に溶媒にさらされています。 (図3c)。 ME2 の閉鎖型は、天然産物であるピルビン酸塩、補因子 NAD+、Mn2+、およびフマル酸塩を含む五元錯体です 3,43。 両方のサンプルのクライオEM調製中にピルビン酸を添加したにもかかわらず（それぞれ図1b、c）、基質ピルビン酸はME2-EAおよびME2-MDSA三元複合体構造では検出されず、活性部位にはNAD+のみが含まれていました。分子(図3a、b)。

この構造は、活性部位 NAD+ (a、b、c、および d) と活性部位を囲むクーロン表面 (e、f、g、および h) のリガンド相互作用を示しています。 灰色のメッシュはリガンドの密度を表し、棒は相互作用する残基を表します。 水素結合相互作用はシアン線、カチオン-π相互作用は緑色線、イオン対はマゼンタ線で示されています。 上のパネルでは、NAD+ 分子の ADP 部分のみが示されています。 a、e 活性部位 NAD+ と相互作用する残基は、ME2-EA 複合体中の水色の棒として示されています。 マップは平均より 5 σ 高い位置に等高線が描かれています。 b、f 活性部位NAD+と相互作用残基は、ME2-MDSA複合体中のピンク色の棒として示されています。 マップは平均より 7.5 σ 上の等高線になります。 c、g NAD+は活性部位では観察されず、阻害剤を含まないME2のポケットを囲む残基は灰色の棒として示されています。 d、h 活性部位 NAD+ および相互作用残基は、ME2 閉鎖型の黄色の棒として示されています (PDB ID: 1PJ3)。 マップは平均より 1.5 σ 上の等高線になります。 クーロン面は、UCSF Chimera55 のデフォルト設定を使用して計算されました。

基質のピルビン酸塩、補因子NAD+、および二価陽イオンMg2+はすべて、ME2の活性部位の閉じた形で周囲の残基に結合しており（図3d）、それらは深い裂け目に遮蔽されています（図3h）。 ME2-EAとME2-MDSAの構造、およびME2の開環型と閉環型の活性部位を比較すると、ME2-EA（図3a）とME2-MDSA（図3b）の活性部位ポケットは、これは、EAとMDSAの結合が酵素の立体構造を触媒的に不活性な開放型にロックしていることを示しています（図3c）。 活性部位の NAD+ ポケットはわずかに開いており、これにより NMN 部分がより柔軟になる可能性があります (図 3e-h)。

各サブユニットのヒト ME2 エキソ部位は、活性部位から約 35 Å 離れた四量体界面に位置しています (図 1)。 ME2-EAおよびME2-MDSA三元複合体、およびME2の開環型の低温EM構造は、NAD+分子のADP部分のみがME2のエキソサイトで秩序立っていることを明らかにしています（図S6）。以前の結晶学的観察と一致しています（PDB ID：1PJ3、図S6d）。 NAD+ のアデニン塩基は Arg194 のアミドおよび Arg556 のカルボニルと水素結合を形成し、一方 Arg197 の側鎖は NAD+ のリボースと水素結合を形成します。 NAD+のリン酸基とArg542およびArg556の側鎖との間に水素結合が形成されます（図S6a、S6b、およびS6c）。 ME2-EAおよびME2-MDSAの構造におけるエキソサイトNAD +のリガンド相互作用とME2の開環型および閉環型のリガンド相互作用を比較すると、ADP部分がそれらの中で同様に配向していることが明らかになります（図S6）。

ME2-EAおよびME2-MDSAの構造に基づいて、16個のME2変異体を設計し、MDSAまたはEAの阻害に対する感受性を評価して、MDSAまたはEAの結合および阻害にどのアミノ酸残基が必要であるかを決定しました（図S7）。 Arg67 と Arg91 はフマル酸塩の直接リガンドです。 R67A 変異体と R91A 変異体は両方とも、MDSA または EA に対する感受性が低く、IC50 値が増加しました (表 1)。 Arg67 は MDSA と直接相互作用するリガンドであるため、R67A 変異体は MDSA による阻害が顕著に少ない活性を示し、IC50 値は 185 μM で、WT の 300 倍を超えました (表 1)。 Arg67 と Glu59 は塩橋を形成し、Glu59 は Lys57 とイオン対を形成します。 しかし、K57 および E59 変異体は依然として MDSA または EA 阻害の影響を受けやすく、IC50 値は WT の値と同等でした (表 1)。

Gln64 は MDSA または EA 結合の一次リガンドとして機能し、一方、Tyr562 は Gln64 と水素結合を形成します。 MDSA および EA について、Q64N の IC50 値は 62.4 μM および 38.2 μM、Y562A の IC50 値は 40.8 μM および 46.1 μM であり、WT の値よりも明らかに大きく (表 1)、Gln64-Tyr562 がこのペアは、アロステリック部位での MDSA または EA の結合に必要です。

Asn35 は EA に直接結合するため、N35D の IC50 値は WT の IC50 値より 10 倍高かったのに対し、N35A および N35Q の IC50 値は WT の IC50 値より 70 倍および 160 倍高かった (表 1)。これは、Asn35 の側鎖の構造特異性が EA 結合にとって重要であることを示しています。 その結果、Asn35 は MDSA と直接相互作用しないという事実にもかかわらず、N35 変異体は Asn35 の側鎖効果により MDSA 阻害の影響を受けにくくなりました。 Asn92 は EA と直接相互作用しますが、Arg128 は MDSA と直接相互作用します。 N92A、N92Q、および R128A 変異体の IC50 値が顕著に増加していないという事実によって示されるように、両方の残基は MDSA または EA 結合に必要ではなく、これらの変異体が依然として MDSA または EA 阻害を受けやすいことを示しています (表 1)。

ME2のこれらの阻害剤結合変異体は広範囲の速度論的特性を示し（表S3）、文献で以前に報告されているように、大部分はアロステリック活性化因子フマル酸塩に対して非感受性です（図S8）が、それらの全体的な二次構造は非常に類似しています。これは、これらの残基の変異が実質的な構造変化をもたらさず、MDSAまたはEA阻害に対するME2変異体の感受性がME2のアロステリック部位の局所幾何学的形状によって決定されたことを示しています（図S9）。

MDSA と EA は、3 つの非癌性細胞株、HEK293T (ヒト胎児腎臓 293 細胞)、HFL-1 (ヒト肺線維芽細胞)、および MRC-5 (ヒト胎児肺線維芽細胞) における細胞 ME2 に対する阻害効果を測定するために導入されました。 ）、および2つの癌性細胞株：H1299（ヒト非小細胞肺癌）およびMCF-7（ヒト乳腺癌）。 5つの細胞株すべてがME2発現を示しました（図S10a〜10d）。 また、ME2過剰発現プラスミド（pcDNA3-vectorおよびpcDNA3-ME2;図S10e）およびME2ノックダウン用のshRNA（shConおよびshME2;図S10a）をそれぞれ陽性および陰性対照として使用して、安定したHEK293T細胞を確立しました。

ME2 はリンゴ酸の酸化を触媒し、その後 NAD+ または NADP+ を還元してピルビン酸と NADH または NADPH を形成します。 その結果、ME2過剰発現HEK293T細胞およびME2ノックダウンHEK293T細胞において、ピルビン酸、NADH、NADPHのレベル、ならびにNAD+/NADH比が最初に決定された（図4）。 ME2を過剰発現する細胞では、ピルビン酸およびNADHレベルが増加し、NAD + / NADH比が減少しました（それぞれ図4a、b、c）が、ME2サイレンシング細胞では、ピルビン酸およびNADHレベルが減少し、NAD + / NADH比が増加しました（それぞれ図4a、b、c）。 MDSA または EA で処理すると、HEK293T、HFL-1、および MRC-5 細胞も ME2 阻害を受けやすくなりました。 EAまたはMDSA処理は、HEK293T、HFL-1、およびMRC-5細胞のME2活性を効果的に阻害し、その結果、ピルビン酸（それぞれ図4a、d、およびS11a）およびNADHレベル（図4b、e、および図4）が減少しました。 ME2サイレンスの場合と同様（図4a〜c）、NAD + / NADH比の増加（それぞれ図4c、f、およびS11c）。

ME2過剰発現（ME2-Over）、ME2ノックダウン（ME2-KD）、EA処理、 MDSA処理細胞。 a HEK293T 細胞におけるピルビン酸レベルの変化倍率。 N = 3 ～ 4。 対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、***p < 0.001。 b HEK293T 細胞における NADH レベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、***p < 0.001。 c HEK293T 細胞における NAD+/NADH の比。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 d HFL-1細胞におけるピルビン酸レベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01、***p < 0.001。 e HFL-1 細胞における NADH レベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01、***p < 0.001。 f HFL-1 細胞における NAD+/NADH の比率の変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、**p < 0.01。 g HEK293T 細胞における ATP レベルの変化倍数。 N = 3 ～ 4。 対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 h HEK293T細胞におけるNADPHレベルの変化倍数。 N = 3 ～ 4。 対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 ns、統計的有意性なし。 i HEK293T細胞におけるROSレベルの変化倍数。 N = 3 ～ 4。 対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 ns、統計的有意性なし。 j HFL-1 細胞における ATP レベルの変化倍数。 N = 3 ～ 4。 対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、**p < 0.01。 k HEK293T細胞におけるNADPHレベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 l HEK293T細胞におけるROSレベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05、**p < 0.01。 棒グラフは、48 時間後のこれらの代謝産物のレベルの変化倍率を示しています。 エラーバーは平均値 ± SD です。

細胞内の NAD+/NADH 比と ATP レベルは、エネルギー代謝の重要な指標です。 ME2過剰発現細胞はNAD + / NADH比が低く（図4c）、ATPレベルが高く（図4g）ましたが、ME2サイレント細胞は逆の結果を示し（図4c、g）、ME2がエネルギーと正の相関があることを示しています代謝。 EAまたはMDSA処理は、HEK293T細胞におけるNAD+/NADH比を増加させ、ATPレベルを減少させた（それぞれ図4c、g）。 同様の結果が、EA または MDSA で処理した HFL-1 および MRC-5 細胞でも観察されました。 HEK293T、HFL-1、およびMRC-5細胞におけるEAまたはMDSA処理により、ATP（それぞれ図4g、j、およびS11d）およびNADHレベル（それぞれ図4b、e、およびS11b）が減少しました。これは、MDSA と EA が ME2 活性を阻害することで細胞のエネルギー代謝を負に制御できることを示しています。

MDSAまたはEAで処理したHEK293T細胞の活性酸素種（ROS）のレベルは一定のままであり（図4i）、これは変化しないNADPHレベルに対応しました（図4h）。 MRC-5細胞では、EA処理によりNADPH産生が減少し（図S11e）、その結果ROSレベルが増加しました（図S11f）。 MDSAまたはEAで処理した後、HFL-1細胞はNADPHの産生も減少しましたが(図4k)、同時にROSの産生は増加しました(図4l)。 HFL-1細胞におけるROSの増加とNADPHの減少によって引き起こされる酸化ストレスが、HFL-1細胞で見られる細胞生存率に対するMDSAまたはEA処理の最大の影響の原因である可能性があります（図S12c）。 HFL-1 細胞は、3 つの非癌性細胞の中で MDSA または EA 媒介の ME2 阻害に対して最も感受性が高かった (図 S12a – S12c)。 これは、MDSAとEAがそれに顕著な抑制効果を及ぼし、ピルビン酸とNADHレベル（それぞれ図4dと4e）だけでなく、NADPHレベル（図4k）も低下させたという事実によるものでした。

我々は、H1299 および MCF-7 癌性細胞株における ME2 関連代謝変化に対する EA または MDSA の有効性を引き続き調べました (それぞれ図 5 および S13)。 ME2は両方の細胞株で見つかりました（図S10d）。 ピルビン酸、ATP、NADPH産生の減少とROS産生の増加によって証明されるように、H1299細胞がEAまたはMDSAに対して感受性があることは興味深いことでした（それぞれ図5a〜d）。 H1299細胞におけるROSの増加とNADPHの減少により、明らかな細胞死が生じました（図S12d）。 対照的に、EAもMDSAも、MCF-7細胞のME2指向性代謝（図S13a〜S13d）またはMCF-7細胞の細胞生存率（図S12e）には実質的な影響を及ぼさず、ME2に対する薬物の効果を示しています。発現細胞は可変である。

EA または MDSA (0、75、および 150 μM) の存在下での H1299 細胞の細胞ピルビン酸、ATP、NADPH、および ROS の比例変化。 a ピルビン酸レベルの変化倍率。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05。 b ATP レベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 c NADPH レベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 d ROSレベルの変化倍数。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05。 e EA 処理した H1299 細胞の酸素消費率。 N = 3. f 基礎呼吸数。 N = 7、8、11、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001。 g 最大呼吸数。 N = 7、8、11、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 **p < 0.01、***p < 0.001。 h ATP の生成。 N = 7、6、11、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001。 i 予備呼吸能力。 N = 7、8、11、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001。 j MDSA 処理した H1299 細胞の酸素消費率 (N = 3 ～ 5)。 k 基礎呼吸数。 N = 7、16、13、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 ***p < 0.001。 l 最大呼吸数。 N = 7、16、13、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001。 m ATP生産。 N = 7、16、13、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 ***p < 0.001。 n 予備の呼吸能力。 N = 8、16、13、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 ns、統計的有意性なし。 エラーバーは平均値 ± SD です。 オリゴ: オリゴマイシン; FCCP: シアン化カルボニル-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン。 腐敗/アリ: ロテノン/アンチマイシン A.

質量分析法を使用して、MDSA または EA 処理後のピルビン酸、リンゴ酸、ホスホエノールピルビン酸 (PEP)、およびグルコースレベルの変化を測定しました (図 S14)。 予想通り、MDSA または EA による ME2 の阻害により、ピルビン酸塩が減少しました (図 4 および S14)。 一方、細胞のリンゴ酸のレベルは比較的一定のままであり、ME2活性の阻害はリンゴ酸の蓄積をもたらさないことを示しています（図S14）。 さらに、ME2活性の阻害はPEPおよびグルコースの細胞レベルに影響を与えませんでした（図S14）。 これらの発見の結果、ME2 阻害は解糖を損なうことなくピルビン酸生成を減少させたと結論付けることができます。

呼吸能力と酸化的リン酸化によって生成されるATPの量を決定するために、酸素消費速度（OCR）実験を実施しました（図6）。 Agilent Seahorse XF Analyzer を使用して、ME2 サイレンシング細胞および MDSA または EA 処理細胞の細胞呼吸を測定しました。 ME2サイレンシングされたHEK293T細胞ではOCRが大幅に減少し（図6a）、基礎呼吸および最大呼吸（図6b、c）、酸化的リン酸化によって生成されるATPの量（図6d）、予備呼吸も同様でした。能力（図6e）、ME2サイレンスが細胞呼吸とATP産生を大幅に減少させることを示しています。

a ME2 コントロール (shCon) および ME2 ノックダウン (shME2) HEK293T 細胞の酸素消費率。 N = 3 ～ 6。 b 基礎呼吸数。 N = 16 および 12、左から右へ。 対応のない学生の t 検定。 ***p < 0.001。 c 最大呼吸数。 N = 16 および 12、左から右へ。 対応のない学生の t 検定。 ***p < 0.001。 d ATPの生成。 N = 16 および 13、左から右へ。 対応のない学生の t 検定。 ***p < 0.001。 e 予備呼吸能力。 N = 16 および 11、左から右へ。 対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 f EA 処理した HEK293T 細胞の酸素消費率。 N = 3 ～ 4。 g 基礎呼吸数。 N = 9、7、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001。 h 最大呼吸数。 N = 9、7、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 **p < 0.01、***p < 0.001。 i ATPの生成。 N = 9、7、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 ***p < 0.001。 ns、統計的有意性なし。 j 予備呼吸能力。 N = 9、7、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001。 k MDSA処理したHEK293T細胞の酸素消費率。 N = 3 ～ 5。 l 基礎呼吸数。 N = 10、9、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 **p < 0.01、***p < 0.001。 m 最大呼吸数。 N = 9、9、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 ***p < 0.001。 ■ ATP の生成。 N = 9、9、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 **p < 0.01、***p < 0.001。 o 予備の呼吸能力。 N = 9、9、10、左から右へ。 ダネット検定による一元配置分散分析。 ***p < 0.001。 エラーバーは平均値 ± SD です。 オリゴ オリゴマイシン、FCCP カルボニル シアン化物-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン、Rot/Ant ロテノン/アンチマイシン A。

EA処理細胞ではOCRが用量依存的に減少し（図6f）、ベースラインと最大呼吸（図6g、h）、ATP合成（図6i）、予備呼吸能力（図6f）も減少しました。 .6j)は、EAがME2を阻害することにより、細胞呼吸とATP合成を大幅に減少させることを示唆している。 MDSA も EA と同じ種類の効果がありましたが (図 6k ～ 6o)、さらに効果的でした。 たとえば、MDSAでATP合成を低下させるには25μMが必要ですが（図6n）、EAでは25μM以上が必要でした（図6i）。

さらに、H1299およびMCF-7癌性細胞株に対するEAまたはMDSAの有効性を評価するためにOCR実験が行われました（それぞれ図5e〜nおよびS13e〜n）。 基礎呼吸および最大呼吸（それぞれ図5f、g）、ATP産生（図5h）、予備呼吸の減少によって示されるように、EAがH1299細胞のOCR変化を誘導したことは明らかでした（図5e）。容量（図5i）。 MDSAは、基礎呼吸および最大呼吸およびATP産生の減少（それぞれ図5k〜m）によって証明されるように、EAと同様のOCR変化をH1299細胞に誘導しました（図5j）が、予備呼吸能力は誘導しませんでした（図5n） ）。 MCF-7細胞は、H1299細胞とは異なり、OCRに応答したEAまたはMDSAに対して感受性がありませんでした（それぞれ図S13e、j）。 基礎呼吸と最大呼吸、ATP産生、および予備呼吸能力は、EAまたはMDSAでの治療によって変化しませんでした（それぞれ図S13f–iおよびS13k–n）。 この発見は、MCF-7細胞がEAまたはMDSAによるME2指向性代謝に応答しなかったという事実に対応していました（図S13a-d）。

我々は、H1299 および MCF-7 癌細胞の遊走および浸潤に対する EA または MDSA の影響を調査しました (図 7 および S15)。 創傷治癒アッセイにより、EAおよびMDSAがH1299細胞の遊走を阻害できることが明らかになった（それぞれ図7aおよびS15a）。 EAまたはMDSAで処理したH1299細胞の相対的な創傷治癒速度は、未処理の細胞よりも遅かった（それぞれ図7b、c）。 対照的に、EAおよびMDSAはMCF-7細胞遊走を阻害することができない(それぞれ図7dおよびS15b)。 EAまたはMDSAで処理したMCF-7細胞と未処理の細胞の間で同様の創傷治癒速度が観察されました（それぞれ図7e、f）。

a EAによるH1299細胞の細胞遊走（創傷治癒アッセイ）。 b EAの非存在下または存在下でのH1299細胞の相対的な創傷治癒率の定量分析。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05。 c MDSAの非存在下または存在下でのH1299細胞の相対的な創傷治癒率の定量分析。 N = 4。対応のない学生の t 検定。 **p < 0.01。 d EAを用いたMCF-7細胞の創傷治癒アッセイ。 e EAの非存在下または存在下でのMCF-7細胞の相対的創傷治癒率の定量分析。 N = 4。対応のない学生の t 検定。 ns、統計的有意性なし。 f MDSAの非存在下または存在下でのMCF-7細胞の相対的創傷治癒率の定量分析。 N = 4。対応のない学生の t 検定。 ns、統計的有意性なし。 g EAによるH1299細胞の細胞浸潤。 h EAの非存在下または存在下での浸潤性H1299細胞の倍率変化。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05。 i MDSAの非存在下または存在下での浸潤性H1299細胞の倍率変化。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 *p < 0.05。 j EAによるMCF-7細胞の細胞浸潤。 k EAの非存在下または存在下での浸潤性MCF-7細胞の倍率変化。 N = 3。対応のない学生の t 検定。 ns、統計的有意性なし。 l MDSAの非存在下または存在下での浸潤性MCF-7細胞の倍率変化。 N = 4。対応のない学生の t 検定。 ns、統計的有意性なし。 エラーバーは平均値 ± SD です。

浸潤アッセイにより、EAおよびMDSAがH1299細胞の細胞浸潤を阻害できることが実証されました（それぞれ図7gおよびS15c）。 EAまたはMDSAで処理したH1299細胞における浸潤細胞の倍率変化は、未処理細胞の倍率変化よりも小さかった(それぞれ図7h、7i)。 しかし、EAもMDSAもMCF-7細胞浸潤を阻害しません（それぞれ図7jおよびS15d）。 MCF-7細胞における浸潤細胞の数は、EAまたはMDSAでの処理後も大きく変化していない(それぞれ図7k、l)。 結論として、EA または MDSA は ME2 関連代謝、特にエネルギー代謝を阻害し、EA または MDSA による細胞遊走および浸潤の阻害が癌細胞におけるエネルギー産生の抑制に起因する可能性があることを示唆しています。

ME2 は、活性中心、アロステリック サイト、およびエキソ サイトに関連するさまざまなリガンドを備えた開いた形と閉じた形の両方で結晶化されています 10、11、42、43。 私たちの研究室は以前に ME2 の結晶構造を決定し、ME2_R67Q 変異体の構造が酵素の不活化「死型」であるのに対し、ME2_R484W の構造は過剰活性化する「閉鎖型」であることを明らかにしました 44。 さらに、ME2 は二量体の中の二量体であり、各単量体は 4 つの異なるドメイン (ドメイン A、B、C、および D) を含んでいます。 ドメイン A (残基 23 ～ 130) は四量体化および触媒作用に関与しています。 アロステリック活性化因子のフマル酸塩は、ドメイン A を含む ME2 の二量体界面に結合しています。フマル酸結合部位とドメイン A の変異により、酵素が不活性化されることがよくあります 44。

この論文では、ME2 の 3 つの低温 EM 構造を報告します。NAD+ のみを含む開いた形式の ME2 二元複合体（図 8a）と、EA または MDSA と NAD+ のいずれかを含む 2 つの ME2 三元複合体（ME2-EA-NAD+ または ME2）です。 -MDSA-NAD+複合体;それぞれ図8b、c)。 これらのクライオ EM 構造に基づいて、EA と MDSA は ME2 のフマル酸結合部位近くの二量体界面に結合するため (図 1)、EA と MDSA は活性部位阻害剤ではなくアロステリック阻害剤であると結論付けることができます (図 1)。 EA または MDSA は、ME2 が開いた状態と閉じた状態の間で切り替わるのを妨げ、その結果、その活性が阻害されます。 EA と MDSA は、このアロステリック部位でのフマル酸塩の結合モードと重複する独特の結合モードを持っています (図 2)。 アロステリック活性化因子であるフマル酸は、K0.5,リンゴ酸およびKm,NADを低下させることによりME2活性を大幅に増加させることができ、その結果、その基質に対するME2の親和性が高まります（図8dおよび表S3）。 ただし、ME2の開環型から閉環型への移行を誘導できるフマル酸塩結合とは異なり、EAまたはMDSA結合は、ME2が開環型から閉環型へ切り替わるのを妨げ（図8b、c）、それによってME2酵素活性を阻害します。 したがって、クライオ EM サンプル調製中にピルビン酸、Mg2+、NAD+、および EA (または MDSA) を添加したにもかかわらず、ピルビン酸、NAD+、Mg2+、および EA (または MDSA) を含む ME2 五元錯体は得られませんでした。 これは、EA または MDSA の結合により ME2 立体構造がロックされ、活性部位がピルビン酸と Mg2+ の結合に適さなくなるためと考えられます。 EA または MDSA による ME2 阻害は可逆的であり、フマル酸塩は二量体界面のアロステリック部位をめぐって競合することにより、EA または MDSA によって阻害された ME2 活性を回復できます (図 8b、d)44。 ME2 活性は L-リンゴ酸をピルビン酸に変換し、トリカルボン酸回路 (TCA) に入り、呼吸鎖を介して ATP を生成します。 したがって、[ATP]が増加すると、ME2活性が阻害されます（図8e）。

a ME2-NAD+ 二元複合体は、不活性な開いた形態を示します。 b ME2-NAD+-EA および c ME2-NAD+-MDSA 三元複合体も、不活性な開環型を示します。 EA または MDSA は二量体界面のアロステリック部位に結合し、ME2 基質の結合を阻害することで ME2 活性を阻害し、それによって ME2 を不活性な開いた形で安定化します。 d ME2-NAD+-PYR-Mn2+-FUM 五元錯体 (PDB コード: 1PJ3) は活性閉塞型を示し、e ME2-ATP-MAL-Mn2+-FUM 五元錯体 (PDB コード: 1PJ4) は不活性閉塞型を示します。 。 ME2 活性を活性化するために、フマル酸塩は二量体界面のアロステリック部位に結合することができ、これにより ME2 基質の結合が促進され、ME2 が完全に活性な閉じた形態で安定化されます。 しかし、細胞の ATP レベルが増加すると、ATP は活性部位およびエキソ部位への結合をめぐって NAD+ と競合し、ME2 活性を阻害し、ME2 を不活性な閉鎖状態に維持します。 FUMフマル酸塩、PYRピルビン酸塩。

ME2 の制御機構は、両方の酵素が異なる場所に局在しているという事実にもかかわらず、ホスホフルクトキナーゼ (FPK) の制御機構と非常に似ています。 ME2はミトコンドリアに局在しているのに対し、PFKはサイトゾルに局在しています（図9a）。 さまざまな生理学的状態の中で、ATP は ME2 および PFK の最も効果的なアロステリック阻害剤です。 解糖はサイトゾル ATP を生成します。 ATP レベルが高い場合、ATP は PFK を阻害し、それによって解糖が遅くなります。 PFK は、細胞が PFK に結合してそれを活性化して解糖を開始するアロステリック活性化因子であるフルクトース-2,6-二リン酸を生成しない限り、不活性です。 [ATP] が枯渇すると、フルクトース-2,6-二リン酸が PFK に結合して、PFK の基質の Km を下げることによって酵素を再活性化し、続いて解糖系が再起動されます。 同様に、ミトコンドリアATPレベルが上昇すると、ATPはME2を阻害し、それによってピルビン酸生成を減少させます（図8e）。 ME2も、細胞がアロステリック活性化因子であるフマル酸塩を生成するまで不活性であり、フマル酸塩はME2に結合し、それを活性化してミトコンドリアピルビン酸を生成します（図8d）。 ME2はグルタミン分解に関与している可能性があり、ME2反応によりミトコンドリアのピルビン酸が生成され、これがアセチルCoAに変換され、TCAサイクルおよび電子伝達鎖媒介酸化的リン酸化を介して追加のATPを生成するために使用されます（図9a）。 フマル酸塩は TCA サイクルの構成要素です。 [ATP]が枯渇すると、フマル酸はME2に結合して再活性化し（図8d、e）、NAD +を活性部位に再導入し、最終的にATP合成のためのピルビン酸を生成します。 したがって、ME2 と PFK は両方ともエネルギー感知酵素であり、その活性は細胞のエネルギー状態によって調節されます。 ME1 は ATP によって制御されません。これは、ME1 がエネルギー感知酵素ではないことを示しています。

a ME2 触媒反応、トリカルボン酸サイクル (TCA)、および電子伝達鎖によって媒介される酸化的リン酸化の間のリンク。 b ME2を上方制御または下方制御し、ME2アロステリック阻害剤EAおよびMDSAで処理することによる、ME2誘導性の細胞の代謝変化。

ピルビン酸は、サイトゾルからのグルコース由来のピルビン酸、およびミトコンドリアの L-リンゴ酸からピルビン酸への ME2 触媒による変換の 2 つの供給源から得ることができます。 L-リンゴ酸は、グルタミノリシス、アミノ基転移、またはリンゴ酸-アスパラギン酸シャトルなどのプロセスを通じてミトコンドリア内で生成されます（図9a）。 ME2の過剰発現は、ピルビン酸、NADH、およびATPのレベルの増加、ならびにNAD+/NADH比の減少を引き起こし、ME2がエネルギー代謝に必須であることを示しています（図9b）。 ミトコンドリア内のME2活性が増加すると、ROS産生に対抗するためにそこでのNADPHレベルが増加します。これはミトコンドリア内のME2の独特の機能を表しますが、サイトゾル内のPFKには抗酸化能力がありません（図9）。 一方、ME2 サイレンスは、対照群と比較した場合、ピルビン酸および NADH レベルの減少、ならびに NAD+/NADH 比の増加をもたらします。 NADPHレベルの低下により、ROSの生成が増加します（図9b）。 機構的には、ME2 サイレンスは細胞内の ATP 産生、基礎呼吸、最大呼吸、予備呼吸能力の減少をもたらし、この結果で実証されているように、ME2 触媒反応が細胞呼吸とそこでの酸化的リン酸化に重要であることを示しています。研究（図4～6）。

今回、我々は、ME2活性を阻害して細胞のピルビン酸、NADH、ATPの産生を減少させることができる2つのアロステリックME2阻害剤、EAおよびMDSAの発見を報告した。 EAまたはMDSAによる治療は、細胞呼吸と細胞内の酸化的リン酸化の減少をもたらします（図9b）。 EA または MDSA 処理には、NADPH 産生を減少させる追加効果もあり、細胞内の ROS レベルが上昇し、細胞死を引き起こす可能性があります。 言い換えれば、ME2 の抗酸化能力は EA と MDSA によって抑制され、NADPH の減少と ROS の増加につながります。 したがって、ME2 はミトコンドリア内で 2 つの機能を持っています。1 つはピルビン酸と NADH を生成して酸化的リン酸化により ATP を生成すること、もう 1 つは NADPH を生成して ROS に対抗することです。

ME1 は ME2 とは対照的に、アロステリック部位を欠き、二重補因子特異​​性を持ちません。 代わりに、補因子として NADP+ のみを利用します。 したがって、ME2 は in vitro で ME1 よりも EA または MDSA による阻害を受けやすいことが理解できます (図 S1a)。 EAまたはMDSAはアロステリック部位でME2に結合することが発見されているため、ME1におけるEAまたはMDSAの標的部位は活性部位に位置している可能性がある。 これは、EA または MDSA による ME2 のアロステリック阻害の特異性の点で有利です。 また、リンゴ酸由来の ATP 産生の減少が EA または MDSA による ME2 阻害によるものであることも示唆されています。 さらに、EAおよびMDSA処理はピルビン酸生成を減少させたが、これはピルビン酸生成の主要経路である解糖の阻害ではなく、主にME2活性の阻害によって達成された。 治療の結果としてPEPおよびグルコースのレベルが変化しなかったという事実によって証明されるように(図S14)、EAまたはMDSAによるME2の阻害は解糖を損なわない。

ME2 は長い間癌遺伝子であると疑われてきましたが、ME2 活性を阻害して細胞死を引き起こす効果のある小分子阻害剤は見つかっていません。 我々は以前、EA が肺腺癌細胞である H1299 細胞株の細胞老化を誘導できることを実証しました 41。 EA と MDSA はマイクロモル以下の濃度で ME2 活性を阻害するのに効果的ですが、細胞は ME2 によるピルビン酸とエネルギー代謝を防ぐためにマイクロモル濃度を必要とします。 その結果、EA と MDSA の細胞への取り込みを最適化することが、今後の ME2 関連疾患研究の最優先事項となります。

ヒト ME2 タンパク質は、インドール-3-酢酸 (IAA) で誘導された trp プロモーターの制御下で PRH281 ベクターを使用して大腸菌 BL21 染色で発現されました。 ME2 は、ATP アガロース アフィニティー クロマトグラフィー (Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して精製しました。 ヒト ME1 タンパク質は、イソプロピル -D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) で誘導された T7 プロモーターの制御下で pET21b ベクターを使用して大腸菌 BL21(DE3) で発現されました。 ME1 は、Ni-NTA アガロース アフィニティー クロマトグラフィー (Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して精製しました。 30 KDa カットオフの Amicon® Ultra-15 デバイスを使用して、精製リンゴ酸酵素を透析し、30 mM トリス-HCl (pH 7.4) および 2 mM メルカプトエタノール (Merck Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国) を含む保存緩衝液に対して濃縮しました。 タンパク質の純度はSDS-PAGEを使用して決定し、タンパク質の濃度はブラッドフォード法に基づいて市販のタンパク質アッセイバッファー（Bio-Rad lab, Inc.、Hercules、CA、USA）を使用して決定し、吸光度を測定しました。マルチモードマイクロプレートリーダー Biotek® (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して 595 nm で検出されました。

ME2 阻害は、50 mM Tris-HCl (7.4)、40 mM L-リンゴ酸、2 mM NAD+、および 10 mM MgCl2 を含む反応緩衝液中で EA または MDSA を 0 から 40 μM に滴定することによって測定しました。 ME1阻害は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、15 mM L-リンゴ酸、0.2 mM NADP+、および10 mM MgCl2を含む反応緩衝液中で測定した。 ME2 に対するジリチル酸誘導体およびナフトエ酸誘導体の阻害は、ME2 基質を 40 mM L-リンゴ酸、2 mM NAD+、および 10 mM MgCl2 に維持しながら、阻害剤濃度の範囲 (0 ～ 500 μM) を滴定することによって決定されました。 IC50 値を取得するには、次の方程式を使用して阻害曲線を計算します。

ここで、A は阻害剤の濃度を示します。 残留酵素活性 (%) は、最大 (100%) と最小 (0%) の曲線を使用して正規化されます。 曲線の中間点での傾きを丘の勾配と呼びます。 IC50 値は、酵素活性の 50% を阻害する阻害剤の濃度を示します。 すべての計算には Prism 8.0 を使用しました (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ)。

プラスミド pRH281-ME2 は、pfuUltra 高忠実度 DNA ポリメラーゼ (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) による 16 ～ 18 回の熱サイクルの変異原性プライマー (表 S4) を使用して増幅されました。 DpnI 制限酵素 (TaKaRa、滋賀県、日本) で消化して野生型鋳型プラスミドを除去した後、DNA 産物を大腸菌 XL-10 に形質転換しました。 最後に、自動配列決定を使用して ME2 単一変異体を特定しました。

クライオ EM サンプルは、4 °C、湿度 100% に設定された Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) を使用して調製されました。 精製サンプル (阻害剤を含まない ME2、ME2-EA、または ME2-MDSA) の溶液をアリコート (3.5 μl) でグロー放電 Quantifoil R1.2/1.3 ホーリー カーボン グリッド (Quatifoil GmbH、ドイツ) に適用しました。 10 秒待った後、グリッドの汚れを濾紙で拭き取り、すぐに液体窒素で冷却した液体エタンに浸しました。 ME2-EA複合体(1mg/ml)およびME2-MDSA複合体(0.5mg/ml)については、ブロッティング力0でグリッドを3.0秒間ブロットした。 阻害剤を含まない ME2 (1 mg/ml) の場合、グリッドはブロッティング力 5 で 3.5 秒間ブロッティングされました。その後、クライオ EM グリッドをガラス化し、イメージングまで液体窒素中で保管しました。

まず、Falcon III 検出器を備えた 200 kV Talos Arctica 透過型電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、クライオ EM グリッドを検査しました。 画像は、公称倍率92,000倍のリニアモードで取得されました。これは、ピクセルサイズ1.1Å/ピクセルおよびデフォーカス設定-3.0μmに相当します。 Titan Krios 透過型電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用してデータが収集されるまで、適切なクライオ EM グリッドを液体窒素中で保管および回収しました。 高解像度データセットは、EPU-2.7.0 ソフトウェアを使用して、X-FEG 電子源を備えた 300 kV Titan Krios (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で自動的に収集されました。 ME2-EA および ME2-MDSA 複合体については、Gatan の GIF Bio-Quantum Energy Filters を装備した計数モード (ガン レンズ 4、スポット サイズ 6、C2 アパーチャ 50 μm) の K2 Summit 検出器を使用してデータを収集しました。 生のムービー スタックは、公称倍率 165,000 倍でキャプチャされました。これは、0.82 Å/ピクセルのピクセル サイズに相当します。 デフォーカス範囲は -1.5 ～ -2.25 μm に設定され、エネルギー フィルターのスリット幅は 20 eV に設定されました。 ゲイン正規化されていない tiff スタックの 60 フレームが、総露光時間 4.5 秒、毎秒 ~11 e-/Å2 の線量率で記録され、累積線量は ~50 e-/Å2 (~0.83 e-フレームあたり /Å2)。 ME2 と同様に、データは K3 Summit 検出器 (GIF Bio-Quantum Energy Filters、Gatan を装備) を超解像度モード (ガンレンズ 4、スポット サイズ 5、C2 アパーチャ 50 μm) で使用して収集されました。 生のムービースタックは公称倍率 81,000 倍でキャプチャされ、これはピクセル サイズ 1.061 (超解像度 0.5305 Å/ピクセル) に相当します。 デフォーカス範囲は -1.5 ～ -2.5 μm に設定され、エネルギー フィルターのスリット幅は 20 eV に設定されました。 ゲイン正規化されていない tiff スタックの 40 フレームが、総露光時間 2.8 秒、毎秒 ~14 e-/Å2 の線量率で記録され、累積線量は ~40 e-/Å2 (~1 e-フレームあたり /Å2)。 クライオ EM データを取得するために使用されるパラメーターは、補足の表 S2 にまとめられています。

計数モードで取得されたすべての ME2-EA または ME2-MDSA 画像スタックは、ビニングなしで 5 × 5 パッチを備えた MotionCor246 を使用して、動き補正と線量重み付けのために Relion にインポートされました (ピクセル サイズは 0.82 Å/ピクセルになります)。 MotionCor246 を使用して、5 × 5 パッチと 2 倍ビニングを使用して、超解像度モード阻害剤を含まない ME2 画像スタックの動き補正と線量重み付けを行いました (ピクセル サイズは 0.83 Å/ピクセルになります)。 コントラスト伝達関数（CTF）は、動き補正と線量重み付け後の CTFFIND4.1 を使用して画像から計算されました 47。 すべての粒子は、cisTEM48 を使用して半自動的に抽出され、選択された粒子座標は、384 ピクセル (ME2-EA および ME2-MDSA 複合体の場合) および 256 ピクセル (阻害剤なしの場合) のボックス サイズを使用して粒子抽出のために Relion 3.049 にインポートされました。 ME2)。 Relion 3.049 では複数回の 2D 分類を使用して不満足な 2D クラス平均を除去し、その後粒子の選択と抽出を行いました。 2D 分類の最終ラウンドで分類された粒子は、ab initio マップの生成のために crioSPARC50 に転送されました。 その後、ab initio マップは Relion49 にインポートされ、3D 分類 (3 つのクラスに分離) の開始基準として使用されました。 D2 対称性を備えた 3D 自動リファインメントを使用して、優れた 3D クラスをリファインしました。 CTFリファインメントとベイジアン研磨の後、研磨された光沢のある粒子はcryoSPARC50にインポートされ、対称性を課すことなくさらに2D分類と3D不均一リファインメントが行われました(C1)。 D2 対称による均一かつ不均一なリファインメントの後、微細な 3D クラスに属する粒子がより高い解像度にリファインされました。 cryoSPARC では、マップが鮮明になり、解像度が推定されました 50。 全体的な解像度はフーリエシェル相関 (FSC) = 0.143 基準を使用して決定され、一方、ローカル解像度も crioSPARC50 を使用して決定されました。 UCSF Chimera を使用して 3D 密度マップを視覚化しました 51。 図 S2 は、クライオ EM 再構成の詳細をまとめたものです。 単一粒子画像を処理する手順を図 2 および図 3 にまとめます。 S3～S5。 表 S2 は、クライオ EM 再構成の統計データをまとめたものです。

阻害剤を含まない ME2 (2.72 Å)、ME2-EA (2.72 Å)、およびヒト ME2 の原子構造 (PDB ID: 1QR6) ME2-MDSA (2.84 Å) のクライオ EM マップの原子モデルを構築するにはクライオ EM マップに厳密に適合しました。 構造の違いは、「Torsion」、「Plannar Peptide」、「Trans Peptide」、および「Ramachandran」拘束を備えた「Model/Fit/Refine」ユーティリティの「Real Space Refinement Zone」機能を使用して、COOT プログラム 52 で手動で調整されました。 。 次に、PHENIX の「実空間リファインメント」機能を使用して、入力原子モデル、クライオ EM マップ、およびゴールドスタンダード FSC を使用して推定された分解能バルブを含む原子モデル 53 をさらに最適化しました。 PHENIX に最適化された原子モデルを COOT で視覚的に検査した後、問題のある領域とラマチャンドラン外れ値が「実空間リファインメント ゾーン」を使用して手動で修正されました。 COOT と PHENIX の原子モデルの「実空間精密化」が、さらなる改善が得られなくなるまで何度も実行されました。 N 末端と C 末端の密度が欠落している残基はモデル化しませんでした。 NAD+ の電子密度のニコチンアミド モノヌクレオチド部分 (NMN) 部分はあまり分解されていないため、この領域を主に幾何学的拘束に基づいてモデル化しました。 興味深いことに、シャープ マップでは MDSA 密度の一部が相対的に消えています。 MDSA モデリングの場合、鮮明化されたマップでは MDSA 密度の一部が失われますが、鮮明化されていないマップでは観察できます (図 S16)。 結合部位に面した MDSA の半分の分子の電子密度は、結合部位の半分の電子密度ほど明確ではありません。 まず、明確に定義された密度に基づいて MDSA の半分を結合部位に配置し、化学的拘束と不整形マップからの追跡可能な密度に基づいて残りの半分を結合部位に配置しました。 明確に定義されていない密度は、MDSA 内の異なる B 因子を示唆する鮮明なマップで消失し、結合部位に面する半分の密度はより柔軟であることを言及する価値があります。 原子モデルの検証にはPHENIXの「総合検証（cryo-EM）」機能を利用しました。 表 S2 は検証統計をまとめたものです。

ヒト胎児腎臓 293 細胞 (HEK293T) は Thermo Fisher Scientific (米国マサチューセッツ州ウォルサム) から購入しました。 2 つのヒト胎児肺線維芽細胞 (HFL-1 および MRC-5) とヒト乳腺癌細胞 (MCF-7) は、生物資源収集研究センター (BCRC、新竹、台湾) から購入しました。 H1299 ヒト非小細胞肺がん細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC、米国バージニア州マナサス) から入手しました。 HEK293T、HFL-1、MRC-5、および MCF-7 細胞は、10% ウシ胎児血清 (FBS; Sigma、セントルイス) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (HyCloneTM、Cytiva、米国マサチューセッツ州マールボロ) で培養しました。 、ミズーリ州、米国）および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。 H1299細胞は、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI（HyCloneTM、Cytiva、米国マサチューセッツ州マールボロ）中で培養されました。 すべての細胞株は、5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 37 °C でインキュベートされました。

6 cm ディッシュ上の約 70% コンフルエントの HEK293T 細胞 (1 × 106 細胞) を、トランスフェクション試薬 TransIT-X2® (Mirus Bio LLC, WI) によって、pcDNA3.1-empty (バックボーン ベクター) および pcDNA3.1-ME2 でトランスフェクトしました。 、米国）opti-MEMTM 培地（Gibco、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 37 °C で 24 時間培養しました。 pcDNA3.1-empty (プラスミド #52535) は Addgene (米国マサチューセッツ州ケンブリッジ) から購入し、ME2 遺伝子をベクターに挿入することによって pcDNA3.1-ME2 を構築しました。 免疫ブロット法を使用して、細胞内の ME2 発現レベルを決定しました。

レンチウイルス トランスフェクション粒子を使用して、ショート ヘアピン RNA (shRNA) を含むレンチウイルス ベクター pLKO_005 を送達しました。 コントロールベクター pLKO-shCon (TRC2.Void、ASN0000000001) および pLKO-shME2 (TRCN0000294007) は、National RNAi Core Facility (Academia Sinica、台北、台湾) から入手し、shRNA のヘアピン配列は次のとおりでした: shCon、5' -CCGGAGTTCAGTTACGATATCATGTCTCGAGACATTCGCGAGTAACTGAACTTTTTTT-3'; shME2: 5'- CCGGAGTTCTTACAGAGCTACTAAACTCGAGTTTAGTAGCTCTGTAAGAACTTTTTTG-3'。 6 ウェルプレート上で、約 30% コンフルエントの HEK293T (3 × 105 細胞/ウェル) 細胞を、5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 37 °C のレンチウイルス粒子溶液で 48 時間処理しました。 プロマイシン (3 μg/ml) を使用して、トランスフェクトされていない細胞を除去しました。 イムノブロッティングを使用して、細胞内の ME2 発現レベルを測定しました。

細胞ピルビン酸および NADPH の濃度は、それぞれピルビン酸比色/蛍光アッセイ キットおよび PicoProbe™ NADPH 定量蛍光アッセイ キット (K609-100 および K349-100; BioVision、ミルピタス、カリフォルニア州、米国) によって測定されました。 6 cm プレートでは、HEK293T (1.5 × 106 セル)、MRC-5 (3 × 105 セル)、HFL-1 (3 × 105 セル)、H1299 (3 × 105 セル)、および MCF-7 (6 × 105 セル) 20 mM L-リンゴ酸を含む培地中で 37 °C、5% CO2 で 24 時間培養しました。 細胞をEAまたはMDSAで48時間処理しました。 採取後、細胞を 100 μL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中で超音波処理しました。 遠心分離後、10 kDa スピン カラム (Acrodisc® シリンジ フィルター、Pall Life Sciences) を使用して上清を除タンパク質し、Biotek® マルチモード マイクロプレート リーダーを備えた 96 ウェル プレート内の作業混合物を使用して分析し、Ex/Em での蛍光を検出しました。 =535/587 nm (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア、米国)。

NAD+ および NADH レベルは、NAD/NADH-GloTM アッセイ (G9071; Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) を使用して測定しました。 6 cm プレート上で、HEK293T (1.5 × 106 細胞)、HFL-1 (3 × 105 細胞)、および MRC-5 (3 × 105 細胞) を 25 μM EA または MDSA を用いて 37 °C で 5 % CO2。 HEK293T (100 μL PBS 中に 2 × 106 細胞)、HFL-1 および MRC-5 (100 μL PBS 中に 2 × 105 細胞) を超音波処理し、10 kDa スピンカラム (Acrodisc® シリンジフィルター、Pall) を使用して上清を除タンパク質しました。生命科学）。 上清 (100 µL PBS に 2 × 104 細胞) を 96 ウェル プレート内で等量の検出試薬と混合し、Biotek® マルチモード マイクロプレート リーダー (Agilent、Agilent、米国カリフォルニア州サンタクララ）。

6 cm プレート上で、HEK293T (1.5 × 106 細胞)、HFL-1 (3 × 105 細胞)、および MRC-5 (3 × 105 細胞) を 25 μM EA または MDSA で 37 °C、5% CO2 で 48 分間処理しました。 h. H1299 (3 × 105 細胞) および MCF-7 (6 × 105 細胞) を 150 μM EA または MDSA で 37 °C、5% CO2 で 48 時間処理しました。 細胞の ATP 含有量は、CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay (G9242; Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) を使用して測定しました。 2 × 104 細胞を 100 μL PBS に再懸濁し、等量のアッセイバッファーと反応させました。 発光は、Biotek® マルチモード マイクロプレート リーダー (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して検出しました。 細胞内 ROS レベルは、ROS Detection Assay Kit (ab287839; Abcam、Cambridge、UK) を使用して測定しました。 1.5 × 105 個の細胞を、希釈 ROS バッファーを使用して暗所で 37 °C で 45 分間インキュベートしました。 PBS バッファーで洗浄した後、細胞を 150 µL ROS バッファーに再懸濁し、Ex/Em=495/529 nm での蛍光を Biotek® マルチモード マイクロプレート リーダー (Agilent、カリフォルニア州サンタクララ、アメリカ合衆国）。

HEK293T 細胞 (3.75 × 104 セル)、H1299 (1.75 × 104 セル)、および MCF-7 (2.8 × 104 セル) を Agilent Seahorse XF24 細胞培養マイクロプレートに播種し、37 °C、5% CO2 で 24 時間インキュベートしました。 次に、HEK293T 細胞を 0、25、および 50 μM EA および MDSA に 4 時間曝露し、H1299 細胞および MCF-7 細胞を 0、75、および 150 μM EA および MDSA に 3 時間曝露しました。 非 CO2 インキュベーター内で 37 °C で 30 分間インキュベートした後、増殖培地を、1 mM ピルビン酸、4 mM グルタミン、および 1 mg/mL D を含む基本培地 (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) に交換しました。 -グルコース。 24 分の時間間隔で、細胞を 5 μM オリゴマイシン A、2 μM FCCP、および 1 μM ロンストン/アンチノマイシン A で順次処理しました。酸素消費速度 (OCR) は、Seahorse XFe24 アナライザーと Seahorse XF を併用して測定しました。 Cell Mito ストレス テスト (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)。 実験データは、Wave2.6 制御プログラム (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して分析されました。

ME2 酵素活性の反応混合物は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 中の 10 mM MgCl2、40 mM L-リンゴ酸、および 2 mM NAD+ で構成されました。 K0.5,リンゴ酸およびKm,NAD値は、他の化合物の飽和レベルを維持しながら、それぞれL-リンゴ酸およびNAD+濃度の範囲を滴定することによって決定されました。 UV/VIS 分光光度計 (Lambda 25、Perkin Elmer、MA、USA) を使用して、340 nm で顕著な吸光度を持つ NADH の増加を連続的に追跡することで酵素活性をモニタリングしました。 ミカエリス・メンテン式を使用して Km,NAD の値を決定し、6.22 mM-1 cm-1 の吸光係数を使用して kcat 値を決定しました。 次の方程式を使用して、L-リンゴ酸の協同性を計算しました。

ここで、v は初速度、Vmax は反応の最大速度、K0.5 は最大速度の半分での基質濃度、h は協力性の程度を表すヒル係数を示します。 すべての計算には Prism 8.0 を使用しました (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ)。 フマル酸塩の活性化は、15 mM L-リンゴ酸塩、1 mM NAD+、および 10 mM MgCl2 を維持しながら、一連のフマル酸塩濃度 (0 ～ 6 mM) を滴定することによって測定しました。

細胞をRIPA溶解緩衝液（Promega、Waltham、MA、USA）で溶解した。 上清のタンパク質濃度は、それらを均質化し、遠心分離した後、ブラッドフォード法を使用して測定した。 上清（50μg）をSDS-PAGEで分離し、PVDFブロッティング膜に転写した。 PVDF をブロッキングバッファーでブロックし、カスタマイズした抗ヒト ME2 抗体 (0.5 μg/ml) (MDbio Inc.、台北、台湾) および抗アクチン抗体 (1 μg/ml) とともに 4 °C で 24 時間インキュベートしました。 Arigo Biolaboratories、新竹、台湾）、続いて西洋わさびペルオキシダーゼで標識した二次抗体を用いて 25 °C で 1 時間処理しました。 最後に、標識抗体は増強された化学発光バッファーと反応し、ImageQuantTM LAS 4000 ミニイメージャー (GE Healthcare Life Sciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ) を使用して発光を検出しました。

集団内の生存細胞の相対数は、CellTiter-Fluor™ 細胞生存率アッセイ (G6080、Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) を使用して決定されました。 96 ウェルプレートに 1 × 104 個の細胞を播種し、100 μL 培地で 24 時間インキュベートしました。 さらに 24 時間、細胞をさまざまな濃度の EA および MDSA で処理しました。 各ウェルで培地 50 μL をアッセイ試薬 50 μL に交換した後、細胞を 37 °C、5% CO2 で 30 分間インキュベートしました。 細胞の生存率は、Ex/Em=490/505 nm に設定された Biotek® マルチモード マイクロプレート リーダー (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して測定しました。

ME2 タンパク質の二次構造は、Jasco J-815 円二色性 (CD) 分光偏光計 (Jasco Deutschland GmbH、プフングシュタット、ドイツ) を使用して決定されました。 30 mM トリス酢酸塩 (pH 7.4) 中のタンパク質サンプル (0.3 mg/mL) は、光路長 0.1 cm の石英キュベットを使用して検出され、CD スペクトル データは 190 ～ 260 nm の間で 0.2 nm 刻みで収集されました。 各 CD スペクトルは、10 回の個別スキャンの平均を使用して決定され、サンプル濃度に対して正規化されました。

約 70% コンフルエントの HEK293T 細胞 (3 × 106 細胞) を、5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 37 °C で 50 μM EA および MDSA を用いて 48 時間処理しました。 4 mL の 80% (vol/vol) メタノールを使用して、細胞から細胞代謝産物を抽出しました。 10 kDa スピン カラム (Acrodisc® シリンジ フィルター、Pall Life Sciences) で除タンパク質した後、抽出溶液の濃度を DNA またはタンパク質の濃度に対して正規化しました。 窒素エバポレーターを使用して代謝産物抽出溶液を蒸発させてメタノールを除去し、アセトニトリル(ACN)中に20%(体積/体積)の濃度で再懸濁した。 液体クロマトグラフィー実験は、Cogent Diamond-HydrideTM カラム (150 × 2.1 mm、4 μm、MicroSolv Technology Corp.、米国ニュージャージー州イートンタウン) を備えた VanquishTM LC システム (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で実施しました。 。 移動相は、(A) 0.01% ギ酸および (B) 水/ACN 90:10 (vol/vol) で構成されていました。 この研究では次の勾配が使用されました: 0 ～ 3 分、20 ～ 20% A。 3 ～ 9.5 分、20 ～ 30% A。 9.5 ～ 10 分、30 ～ 70% A。 10 ～ 11 分、70 ～ 100% A。 11 ～ 14 分、100 ～ 100% A。 14 ～ 14.1 分、100 ～ 20% A; 14.1 ～ 35 分、20 ～ 20% A。流量は 0.2 mL/分でした。 質量分析は、エレクトロスプレー イオン化 (ESI) 源を備えた Thermo Fisher Scientific TSQ AltisTM トリプル四重極質量分析計 (米国マサチューセッツ州ウォルサム) で、選択反応モニタリング (SRM) モードを使用したポジティブ スキャン モードで実行されました。 最適パラメータは以下の通りであった：シースガス流量は任意の３５単位、補助ガスの流量は任意の５単位、キャピラリー温度は３２５℃、スプレー電圧は３．５ｋＶであった。

H1299 (1.5 × 105 細胞) および MCF-7 (3.0 × 105 細胞) を Costar® 24 ウェル プレート (Corning、NY、USA) に播種し、37 °C、5% CO2 で 24 時間培養して、コンフルエントな細胞単層。 細胞がコンフルエントに達した後、培地を除去し、PBS緩衝液を使用して細胞を洗浄した。 次に、単層を 200 μL ピペットチップで引っ掻いて、細胞を 150 μM EA または MDSA で 37 °C、5% CO2 で 48 時間処理しました。 Lionheart FX 自動顕微鏡 (BioTek®、Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して、細胞の明視野画像を取得して分析しました。

Matrigel® (Corning、NY、USA) を 24 ウェル Transwell® プレート (Corning、NY、USA) の上部チャンバーで 24 時間コーティングしました (MCF7 には 200 μg/mL マトリゲル、H1299 には 1000 μg/mL マトリゲル) 。 マトリゲルをFBSを含まない培地で希釈しました。 この後、H1299 (1.0 × 105 細胞) および MCF7 (1.5 × 105 細胞) を FBS フリー培地を含む上部チャンバーに播種し、150 μM EA または MDSA で 24 時間処理しました。 その間に、10% FBSを含む化学誘引物質培地を下部チャンバーに添加した。 倒立顕微鏡 (オリンパス株式会社、東京、日本) を使用して細胞画像を取得し、次に Image J54 を使用して分析しました。

提示されたデータは、平均値±標準偏差 (平均値±SD) を示します。 このような場合、生物学的に独立したサンプルの数は 3 つ以上になります。 統計分析は、対応のない両側スチューデント t 検定またはダネット検定による一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して、*p < 0.05、**p < 0.01、および ***p <の有意水準で実行されました。 0.001。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ここで決定されたクライオ EM 構造は、アクセッション コード EMD-33145 (ME2 のオープン形式)、EMD-33146 (ME2-EA 複合体)、および EMD-33147 (ME2-MDSA 複合体) で電子顕微鏡データ バンク (EMDB) に寄託されています。 ）。 関連する分子モデルは、アクセッション コード 7XDE (ME2 のオープン フォーム)、7XDF (ME2-EA 複合体)、および 7XDG (ME2-MDSA 複合体) で PDB に登録されています。 この研究中に生成または分析された他のすべてのデータは、この公開された論文、補足データ、および補足情報ファイルに含まれています。 この研究中に生成および分析されたデータセットは、要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は中華民国科学技術省 (MOST 104-2311-B-005-009 -MY3、MOST 110-2311-B-005-007 および 108-2320-B-040-020-MY3) によって財政的に支援されました。 ); 台湾教育部（MOE）の高等教育芽生えプロジェクトの枠組みの中で、注目分野研究センタープログラムの先端植物・食用作物バイオテクノロジーセンターによって部分的に支援されています。 国立中興大学機器センターによる MS 分析へのご支援に感謝の意を表します。 クライオ EM 実験は、中央研究院クライオ EM 施設 (ASCEM) で実施されました。 ASCEM は、中央研究院の中核施設および革新的機器プロジェクト (助成金番号 AS-CFII-111-210) および台湾タンパク質プロジェクト (助成金番号 AS-KPQ-109-TPP2) によって共同支援されています。 この作業では、中央研究院によってサポートされている ASGC (中央研究院グリッド コンピューティング センター) 分散クラウド リソースを使用しました。

Ju-Yi Hsieh、Kun-Chi Chen、Chun-Hsiung Wang の著者も同様に貢献しました。

国立中興大学生命科学部、台中、台湾中華民国 402

Ju-Yi Hsieh、Kun-Chi Chen、Jie-An Ye、Yu-Tung Chou、Yi-Chun Lin、Cheng-Jhe Lyu、Rui-Ying Chang、Yi-Liang Liu、Hui-Chih Hung

博士号組織工学および再生医学プログラム、国立中興大学、台中、402、台湾中華民国

クンチー・チェン & ホイチー・ホン

中央研究院生物化学研究所、台北市、115、台湾中華民国

ワン・チュンシュン & メンチャオ・ホー

中山医科大学医学部医学研究所、台中市、402、台湾中華民国

グアン・ヨー・リウ & ジエ・アン・イェ

国立中興大学研究開発局、機器センター、台中、40227、台湾中華民国

イェンシェン・リー

国立中興大学化学科、台中市、402、台湾中華民国

イェンシェン・リー & マウロン・リー

国立台湾大学生化学研究所、台北、台湾中華民国 106

メンチャオ・ホー

国立中興大学ゲノミクス・バイオインフォマティクス研究所、台中、402、台湾中華民国

フイ・チー・フン

先進植物および食糧作物バイオテクノロジー センター、国立中興大学、台中、402、台湾中華民国

フイ・チー・フン

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JYH、CJL、RYC、YLL が動力学実験を実施しました。 CHWは構造工事を実施した。 JYH、KCC、JAY、YTC、および YCL は細胞ベースの研究を実施しました。 YHL と MRL は MASS 分光分析を実施しました。 JYH、CHW、KCC はデータを分析し、結果の解釈を支援しました。 HCH、MCH、GYL はプロジェクトを共同監督し、その設計と実装、分析と論文執筆に貢献しました。

Meng-Chiao Ho または Hui-Chih Hung との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Azhar Rasul、Matthew J. Belousoff、Song Xiang に感謝します。 主な取り扱い編集者: Joao Valente。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

JY. シェイ、KC. チェン、CH. ワン他。 ヒトのリンゴ酸酵素 2 を抑制すると、エネルギー代謝が変化し、細胞呼吸が阻害されます。 Commun Biol 6、548 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

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受信日: 2022 年 8 月 4 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

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