細菌収縮注射システムによるプログラム可能なタンパク質送達

Nature volume 616、pages 357–364 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

内部共生細菌は、これらの生物が宿主生物学と連携できるようにする複雑な送達システムを進化させてきました。一例である細胞外収縮注入システム (eCIS) は、細胞膜を介してスパイクを駆動することによってタンパク質ペイロードを真核細胞に注入する注射器のような高分子複合体です。最近、eCIS がマウス細胞を標的とすることが判明し 1、2、3 、これらのシステムを治療用タンパク質の送達に利用できる可能性が高まっています。しかし、eCIS がヒト細胞内で機能できるかどうかは依然として不明であり、これらのシステムが標的細胞を認識するメカニズムはほとんど理解されていません。今回我々は、昆虫病原性細菌Photorhabdus asymbiotica由来のeCISであるPhotorhabdus病原性カセット（PVC）による標的選択が、PVC尾繊維の遠位結合要素による標的受容体の特異的認識によって媒介されることを示す。さらに、尾繊維のインシリコ構造誘導エンジニアリングを使用して、PVC を再プログラムして、これらのシステムが本来標的としない生物 (ヒト細胞やマウスなど) を 100% に近い効率で標的にできることを示しました。最後に、PVC が Cas9、塩基エディター、毒素などの多様なタンパク質ペイロードをロードでき、それらを機能的にヒト細胞に送達できることを示します。私たちの結果は、PVC がプログラム可能なタンパク質送達デバイスであり、遺伝子治療、癌治療、生物制御に応用できる可能性があることを示しています。

内部共生細菌の場合、共生体の適応度を優先して宿主の生物学を調節する因子を分泌することが有利であることがよくあります4。しかし、そのような因子の多くは細胞膜を容易に通過できません。これは、ペイロードタンパク質を細胞に能動的に送達する複雑なシステムの開発につながりました5。一例は、バクテリオファージの尾に似た注射器状のナノマシンの一種である収縮注入システム (CIS) です 6,7。

CIS は、収縮性の鞘内に収容された硬い管構造を含む高分子複合体であり、ベースプレートに固定され、スパイクタンパク質によって鋭利になります 8、9、10、11、12、13、14。ペイロードは、スパイクの後ろにある内管の内腔にロードされ、チューブと融合タンパク質を形成するか、またはスパイク自体と会合し、標的細胞を認識すると、鞘の収縮を介して膜を通過すると考えられています 2,3,15。 16、17。 CIS が生命の 3 つの領域すべての生物を標的にすることが示されているため、この戦略は生物圏全体で驚くほど成功していることが証明されています 12、18、19。 CIS は細菌の膜に固定されて、VI 型分泌システム 8,20 (T6SS) として知られる接触依存性送達システムを形成することも、シアノバクテリアのチラコイド膜 (tCIS) に付着して細胞ストレス時に活性化されることもできます。応答13; 最後に、それらは遊離複合体 (eCIS) として生成され、細胞外に放出されて細菌生産者から独立してペイロードを送達することができます 21、22、23、24。 eCIS は細菌および古細菌全体に広く分布しており、少なくとも 6 つのサブファミリーにクラスター化されていることが示されており、そのうちの 2 つだけが特徴的な例を含んでいます 21、22、23。 eCIS ペイロードは、宿主の細胞骨格の調節 18,24、DNA 切断 1、変態の誘導 15,25、宿主毒性 22,24,26 など、さまざまな自然の機能を示すことが示されており、これらのシステムが複数の生物学的ニッチに適応していることが示されています。最近、eCIS がマウス細胞を標的とすることが判明し 1、2、3 、これらのシステムをタンパク質送達ツールとして利用できる可能性が高まっています。しかし、eCISの活性はヒト細胞ではまだ実証されておらず、eCISが標的細胞を認識するメカニズム（これらのシステムを標的送達デバイスとして開発する場合に必要となる）はまだ解明されていない。

eCIS アクティビティの研究では、eCIS の 1 つのサブタイプである PVC に焦点を当てました。 PVC は、昆虫病原性線虫内の内部共生生物として存在する Photorhabdus 属のメンバーによって産生される eCIS です 24。 PVCは、機能的な注入システムの構築に必要な16個のコア遺伝子（pvc1〜16）を含む約20kbのオペロンで構成されています（図1a）。 pvc1-16 のすぐ下流にはペイロード Pdp1 と Pnf があり、すべての eCIS と同様に、PVC シースの収縮とそれに続くスパイクとチューブの複合体の分解を介して標的細胞に侵入すると考えられています（図 1b）。

a、16 個の構造遺伝子と付属遺伝子 (それぞれ青と紫) に続いて 2 つのペイロード遺伝子 (Pdp1 と Pnf、赤) および 4 つの推定制御遺伝子 (オレンジ) を含む P. asymbiotica PVCpnf 遺伝子座の概略図。 PVC のイラストは概算であり、縮尺どおりに描かれていません。 b. PVC 媒介タンパク質送達の提案されたメカニズム。 PVC はおそらく尾部繊維 (Pvc13) を介して標的細胞を認識し、細胞膜を介してスパイクを駆動するシース機構の収縮を引き起こします。その後、ペイロードタンパク質は、スパイクとチューブの複合体の分解を介して細胞に侵入すると考えられています。 c、PVC は大腸菌から精製できます。 PVCpnf 遺伝子座を大腸菌に形質転換し、無傷の PVC 粒子を単離しました。次に、得られた PVC 調製物を変性 SDS-PAGE ゲル上で泳動し、ネガティブ染色 TEM で画像化しました。スケールバー、100 nm。 d、PVC が標的細胞に結合している様子を視覚化できます。エピトープタグ付きシースタンパク質 (Pvc2) を含む PVC 粒子を Sf9 細胞とインキュベートし、免疫蛍光により結合を視覚化しました。スケールバー、100μm。 e、非ネイティブのペイロードを PVC パーティクルにロードできます。 Pdp1パッケージングドメイン（PD）（拡張データ図3b、c）を新規タンパク質に融合し、変性ウェスタンブロットによってローディングを決定しました。 Pvc12 (ベースプレート) はローディングコントロールとして機能しました。 WT、野生型。 f. 野生型 PVC 粒子は培養昆虫細胞を殺します。 PVC 媒介細胞毒性には、推定上の標的認識遺伝子 (pvc13; 尾繊維) とペイロードローダー (pvc15; ATPase) の両方の作用が必要でした。スケールバー、200μm。 g、PVC は、非ネイティブペイロード (e のようにロードされる) をターゲットセルに配信できます。スケールバー、200μm。 f、g のデータは、n = 3 の生物学的複製の平均値 ± SD です。ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析。 ****P < 0.0001。

ソースデータ

我々はまず、以前に記載された方法と同様の方法を使用して、P. asymbiotica ATCC 43949 (PVCpnf) (拡張データ図 1a) から PVC を生成するように大腸菌を操作しました9。下流の操作を容易にするために、PVC システムを別個の構造プラスミドとアクセサリー (pPVC) プラスミド、およびペイロードプラスミドと調節プラスミド (pPayload) に分割しました。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して検査したところ、得られたタンパク質複合体は、無傷のベースプレートと約116 nmの長さを示すシース構造を含む標準的なeCISに似ていました（図1cおよび拡張データ図1b）。私たちは、検出可能なPVC粒子を生成するにはpPayloadが必要であることを観察しました（拡張データ図1c〜h）。これは、ペイロード領域の小さな遺伝子（図1aではオレンジ色でラベルされており、遺伝子制御に関与していると他の場所で仮説9されています）が、大腸菌内での PVC の形成。最後に、これらの精製複合体を培養Sf9昆虫細胞（PVCpnf24が内因的に標的とする昆虫との関係により選択された）Sf9昆虫細胞に短時間暴露すると、それらが細胞表面に強力に結合することもわかりました（図1dおよび拡張データ図）。２）。これらの結果は、適切な集合とターゲティングの両方を示す PVC 複合体の製造に大腸菌を使用できることを示しています。

PVC をプログラム可能なタンパク質送達デバイスに開発するために、次に、新規の非ネイティブペイロードを PVC にロードすることを試みました (図 1e および拡張データ図 3a)。 PVC がペイロードをリクルートするメカニズムは完全には理解されていませんが、内在性 PVC ペイロードタンパク質の N 末端の高度に無秩序な領域 (拡張データ図 3b) がローディングプロセスに関与していることが最近示されました 3。この無秩序な領域を欠く変更されたペイロードは PVC にロードされないことを確認しました (拡張データ図 3c、d)。これは、この領域がペイロードを PVC 複合体にロードするために必要な「パッケージングドメイン」を表すことを示しています。したがって、このパッケージングドメインを、PVCに自然にロードされないさまざまなタンパク質（GFP、Cre、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ）に融合し、得られた操作されたペイロードがPVCにロードされるかどうかをテストしました（図1e）。私たちは、pvc15 (ペイロードのローディングにも必要であることが示されている ATPase 3) の存在下で、3 つの新規ペイロードすべてが PVC と同時精製されることを発見し、この方法 (パッケージングドメインの N 末端融合) が一般化可能な戦略であることを確認しました。新しいタンパク質を PVC 粒子にロードするため。

最後に、我々は、内因性ペイロードと人工ペイロードの両方を伴う PVC 媒介タンパク質送達が、培養昆虫細胞で直接観察できるかどうかをテストしました。 Sf9細胞を天然の毒素ペイロードを含む未修飾PVCとインキュベートした後、強い細胞毒性が観察されました（図1f）。特に、この表現型には、PVCのターゲティング要素であると我々が仮説したもの（pvc13、尾繊維をコードする）や、以前にペイロードローダー3であると示唆されていた遺伝子（pvc15）など、いくつかの重要なPVC遺伝子の存在が必要であることがわかりました。さらに、個別に精製したペイロードまたはアンロードされたPVC複合体の投与では、この表現型を再現するには不十分であり（拡張データ図4a、b）、観察された活性にはPVC複合体と毒素ペイロードの両方の作用が必要であることが示されました。さらに、Creレポーターシステム（loxP-GFP）を保有するSf9細胞に投与すると、（図1eに記載の方法を使用して）Creを人工的にロードしたPVCはGFPシグナルを生成し（図1gおよび拡張データ図4c）、これは次のことを示しています。新しいタンパク質ペイロードは、PVC を介して機能的に配信できます。まとめると、これらの結果は、組換えPVCが培養昆虫細胞に対して生物学的に活性であり、非天然タンパク質を標的細胞にロードおよび送達して新規の生物学的活性をもたらすように再プログラムできることを示している。

PVC が標的細胞に結合するメカニズムは不明です。しかし、収縮性尾部ファージ（PVC に似ている）による標的認識はよく理解されています。ファージ T4 は、ベースプレート複合体から伸びる 6 本の長い尾部繊維を持ち、宿主細胞表面のリポ多糖分子または外膜タンパク質と可逆的相互作用を形成します 27、28、29。このプロセスにより、ファージが標的細胞の上に正しい方向に配置され、ベースプレートが細胞表面に十分近くに移動して不可逆的に結合し、細胞へのファージゲノムの注入が開始されます 29,30。多くの研究は、ファージおよび他の細菌を標的とする CIS の尾部繊維の修飾が、予測可能な方法で標的特異性を変化させるのに十分であることを実証しており 31,32,33,34 、これらのタンパク質がこれらのシステムにおける標的特異性の重要な決定因子であることを示しています。 PVC および他の eCIS がどのようにセルをターゲットにして注入プロセスを開始するかは現時点では不明ですが、同様の手法を使用して PVC ターゲットの特異性を変更できる可能性があると提案しました。特に、PVC 遺伝子座には、ファージ T4 の短い尾部繊維からの受容体結合先端に類似した予測ドメインを有する尾部繊維遺伝子 (pvc13) が含まれています (拡張データ図 5a)。注目すべきことに、PVC 尾部繊維は、真核生物ウイルス (特にアデノウイルス) の受容体結合タンパク質にマッピングされる領域も含むことが多いという点で、ファージ尾部繊維から分岐しており、PVC 尾部繊維がファージの尾部繊維の認識に関与しているという仮説を裏付けています。真核生物。 PVC 尾部繊維も、ファージと同様の方法でベースプレートに接続し、鞘に沿って上向きに折りたたまれることが示されています 9。全体として、これらの観察は、尾部繊維がおそらく標的認識に関与しており、PVC の標的特異性を操作するために利用できる可能性があることを示唆しています。

私たちは、PVC 尾部繊維タンパク質 (Pvc13) への修飾によって指向性が変化し、ヒト細胞の標的化が可能になるかどうかをテストしました。 AlphaFold35、36、37を使用して、Pvc13の推定遠位先端、つまり標的細胞と最初に接触すると予測された領域の3D構造を予測しました（図2aおよび拡張データ図5b〜d）。三量体としてクエリすると、Pvc13 の C 末端は球状の先端を備えた予測される螺旋管構造を形成し、これが尾部繊維全体の結合ドメインであると考えられます。我々は、他の CIS の尾部繊維の場合と同様に、この遠位結合ドメインの結合特性を変更すると、PVC 指向性に予測可能な変化が生じる可能性があると仮説を立てました。これをテストするために、ヒト細胞に特異的な新規結合ドメイン (ヒトアデノウイルス 5 (Ad5)38 または上皮成長因子受容体 (EGFR) に特異的に設計されたアンキリンリピートタンパク質 (DARPin) E0139 の三量体ノブドメイン) を推定上の細胞に挿入しました。 Pvc13 の C 末端結合領域を調べて（それぞれ Pvc13-Ad5-knob または Pvc13-E01-DARPin を生成するため）、得られた PVC がヒト細胞を標的にできるかどうかをテストしました。この実験では、EGFR を過剰発現し、Ad5 感染に感受性があることが知られている A549 ヒト肺腺癌細胞をモデル細胞株として使用しました。 Pvc13-Ad5-knob または Pvc13-E01-DARPin を備えた PVC は、天然毒素 Pdp1 および Pnf を負荷した場合に A549 細胞を効率的に死滅させるか（図 2a および拡張データ図 6a-d）、効率的な Cre 駆動型 GFP 発現を生成することがわかりました。図1eに記載されているように、Pdp1-NTD-Cre（Creに繋がれたPdp1のN末端ドメイン（NTD））をロードした場合のA549 loxP-GFP細胞では（図2a）。注目すべきことに、この活性は、PVCに変異体Ad5ノブドメイン（Δ491/492 - 標的細胞へのAd5の結合を減少させることが以前に示されている40;拡張データ図6e、f）または非標的化DARPin（抗リゾチーム）のいずれかを備えた場合に消失した。 DARPin A4 (Protein Data Bank: 5OP1))、ヒト細胞における PVC 活性は、ヒト細胞に適切に結合できる尾部繊維の存在に依存していることを示しています。最後に、Pvc13-Ad5-knob または Pvc13-E01-DARPin を保持する PVC がヒト細胞の表面にクラスター化していることを発見しました（図 2a、下）。これは、観察された活性が、操作された PVC 間の新規結合相互作用の結果であることを示唆しています。そして標的細胞。これらの結果は、Pvc13 が PVC の指向性決定要素であり、このタンパク質を修飾してこのシステムの標的特異性に予測可能な変化をもたらすことができることを示しています。

a、Pvc13 (尾部繊維) の AlphaFold 誘導エンジニアリングにより、ヒト細胞内で効率的な送達活性を示す PVC が得られます。上、Pvc13 の推定標的認識ドメイン (アミノ酸 403 ～ 476) が削除され (Pvc13 (切断型) が生成)、ヒトアデノウイルス 5 の標的結合ドメイン (Pvc13 ～ Ad5 ノブが生成) または DARPin 特異的ドメインのいずれかで置き換えられました。ヒト EGFR (Pvc13-E01-DARPin を生成) の場合。非ターゲティング結合ドメインを含む Pvc13 バリアント (Pvc13-Ad5-knob(Δ491/492) および Pvc13-A4-DARPin) もネガティブコントロールとして含まれました。下の図は、PVC 粒子に野生型 (WT) 毒素ペイロードまたは新規ペイロード (Cre) を負荷し、PVC によるタンパク質送達をそれぞれ細胞毒性または GFP 発現として測定しました。下の行では、新規の PVC デザインがヒト細胞に結合していることが観察できます (この場合は免疫蛍光イメージングを容易にするための U2OS)。標的細胞の結合には、Pvc13-Ad5-knob または Pvc13-E01-DARPin の存在が必要でした。野生型 Pvc13、切断型 Pvc13、または非ターゲティング融合タンパク質を保持する PVC は、細胞表面にクラスター化しませんでした。スケールバー、300 μm。 b. ヒトを標的とした PVC デザインは、SpCas9 タンパク質を HEK 293FT 細胞に送達することができ、ヒト細胞における PVC を介した遺伝子編集を可能にします。インデル形成には、Pvc13 における非変異 Ad5 ノブドメインの存在が必要であり、この活性には PVC の作用が必要であることが示されました。条件は、PVC(Pvc13 デザイン) – ペイロードの形式でリストされます。 c. ヒトをターゲットとした PVC デザインは、ZFD を HEK 293FT 細胞に送達することができ、ヒト細胞での塩基編集を可能にします。ターゲット通りの G から A への塩基置換は、各 ZFD ハーフ (ZFD-L および ZFD-R) が適切にターゲットされた PVC によって送達された場合にのみ観察されました。非ターゲティング PVC の活性は無視できました。 d. 人間をターゲットにした PVC デザインは白血病細胞 (Jurkat) を殺す可能性があります。細胞毒性は、PVC が Jurkat 細胞によって発現されることが知られている T 細胞受容体 (CD4) を再標的化した場合にのみ生じましたが、Jurkat 細胞には見出されない骨髄性受容体 (CD11b) を再標的化した場合には生じませんでした。データは、n = 3 の生物学的複製の平均値 ± SD です。ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析。

ソースデータ

タンパク質送達ツールとしての PVC をさらに特徴付けるために、ヒト細胞におけるいくつかの有用な送達アプリケーションを確立することにより、図 2a の結果を拡張しました。我々はまず、化膿連鎖球菌Cas9（SpCas9）をロードして送達し、ヒト細胞で遺伝子編集を行うようにPVCを再プログラムできるかどうかをテストしました（図2b）。 Pvc13–Ad5ノブで再ターゲットされたPVCにCas9がロードされると（図1eと同様の戦略を使用）、結果として得られた粒子は、ガイドRNAを有するHEK 293FT細胞でオンターゲットの挿入および欠失（インデル）を生成することがわかりました。この実験は、Cas9 がこの PVC によってネイティブにロードされるペイロードよりもはるかに大きいため注目に値します (Pdp1-NTD–Cas9 では 170 kDa、Pdp1 および Pnf では 37 kDa)。これは、PVC がさまざまなサイズの多様なペイロードを配信できることを示しています (以下の同様の結論を裏付けています)。他の研究3,22)。 PVC を使用したガイド RNA フリーの遺伝子編集を実現するために、我々は次に、最近報告されたシステムであるジンクフィンガーデアミナーゼ (ZFD) を送達することを試みました。このシステムは、分割デアミナーゼにつながれたジンクフィンガードメインで構成されています 41。 Pvc13-Ad5 ノブで再標的化された PVC に、ヒト TRAC 遺伝子座 (それぞれ ZFD-L または ZFD-R) を標的とする ZFD の左腕または右腕のいずれかをロードし、HEK 293FT 細胞に同時投与した場合、 -ターゲットのGからAへの塩基置換（図2cおよび拡張データ図6g）。これは、PVCがZFDを送達してヒト細胞の塩基編集に影響を与えることができることを示しています。最後に、PVC の内因性の生物学的機能 (毒素の送達による標的を絞った殺傷) に触発されて、PVC がヒトのがん細胞を特異的に殺すために使用できるかどうかをテストしました。内因性毒素（Pdp1およびPnf）を負荷したPVCが、T細胞受容体に特異的なDARPinで再標的化された場合、Jurkat細胞において効率的な細胞毒性を生成することを発見しました（CD4;図2d）。しかしながら、注目すべきことに、ジャーカット細胞によって産生されない骨髄性受容体（CD11b）を標的とするPVCは、細胞死をほとんど引き起こさず、ヒト癌細胞におけるPVC媒介細胞毒性が受容体特異的であることを示唆している。

バクテリオファージの注目すべき特徴の 1 つは、標的特異性が狭いことです 42。ファージの特異性は、ファージ尾部繊維と宿主細菌によって提示される受容体との間の高度に進化した結合相互作用によって付与されると考えられている27,43。このため、ファージによる細菌感染症の治療は困難になる可能性がありますが、特異性は現代の標的療法の重要な特徴であり、癌や遺伝性疾患の治療には不可欠です。 PVCの特異性が尾部繊維によって与えられ、PVCの指向性がこのタンパク質の合理的な修飾によって形成され得るという我々の発見により、PVC（ファージと同様）も高度の標的特異性を示す可能性が高まった。

PVCの標的特異性を研究するために、我々はまず、操作されたPVCによって容易に標的にされ得る定義された非天然受容体を示す人工HEK 293FT由来細胞タイプのパネルを構築した（図3a、b）。簡単にするために、市販のエピトープタグに特異的な抗体のパネル（scFvおよびナノボディ）を受容体として選択しました。次に、関連するエピトープタグのパネルを尾部繊維の遠位結合ドメインに挿入し（図2aのように）、得られた修飾PVCをこれらの「細胞タイプ」に投与して、PVCがどのように効果的に標的選択を受けるかを理解しました。エピトープタグで再標的化されたPVCは、それらのエピトープタグの適切な結合パートナーを表示する細胞にペイロードを効率的に送達することしかできないことがわかりました（図3b）。この結果は、PVC の特異性が尾部繊維とその標的受容体の間の相互作用によって主に与えられ、この相互作用を操作して新規の細胞型を特異的に認識できることを示しています。

a、b、人工受容体に基づく PVC の特異性アッセイ。 a, 実験の概略図。エピトープタグのパネルが尾部繊維の遠位結合ドメイン (Pvc13 のアミノ酸 403 ～ 476) に挿入され、関連する受容体 (抗エピトープタグ抗体) のパネルが HEK 293FT 細胞の表面に表示されました。図１〜図４のように。 1gおよび2aでは、loxP-GFPを有する細胞へのCreの送達後のPVC活性をGFP発現として測定した。 b. 正しいエピトープと抗体のペアリングのみが効率的な PVC 媒介 Cre 送達をもたらしました。これは、PVC 活性には尾部繊維と標的細胞の間の特異的な相互作用が必要であることを示しています。スケールバー、500μm。 c、内在性受容体に基づく PVC の特異性アッセイ。右、Pdp1およびPnfをロードしたPVCは、ヒトEGFR（図2aのようにPvc13-E01-DARPinを使用）に再標的化され、EGFR+（A431およびA549）およびEGFR-（Jurkatおよび3T3）細胞株に投与されました。細胞毒性は、EGFR+ 細胞株でのみ、また Pvc13 が抗 EGFR DARPin を含む場合にのみ観察されました。結合ドメイン (アミノ酸 403 ～ 476) を欠く短縮型 Pvc13 を含む PVC では細胞毒性は観察されませんでした (左)。 d. 標的受容体の提示は、細胞を PVC に対して感作させるのに十分です。 PVC 送達に対して免疫のある細胞株 (3T3) (c) は、ヒト EGFR を含むプラスミドでトランスフェクトされ、EGFR を標的とする PVC に曝露されました。今度は、細胞は生存能力の低下を示しました。データは平均 (b,c) または平均 ± 標準偏差 (d) で、n = 2 (b,c) または n = 3 (d) の生物学的複製です。ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析。 NS、重要ではありません。

ソースデータ

次に、一部のヒト細胞型に内因的に見られる天然受容体であるEGFRに対するPVCの特異性を評価しました（図3c）。この実験では、EGFR を標的とするようにプログラムされた PVC が、EGFR を発現することが知られている細胞を特異的に標的とするかどうかをテストしました。我々は、抗EGFR DARPin (E01)で再標的化され、毒素(Pdp1およびPnf)を負荷されたPVCは、EGFR+細胞株(A549およびA431)のみを効率的に死滅させることができ、EGFR-細胞株(Jurkatおよび3T3)を死滅させることができないことを発見した。さらに、前の実験（3T3）からのEGFRをEGFR-細胞株にトランスフェクションすると、これらの細胞がこのPVCに対して感作されることがわかりました（図3d）。これは、適切な標的受容体の存在がPVC媒介性細胞株を可能にするのに十分であることを示しています。配達。これらの結果は、図3a、bの人工受容体を使用した特異性アッセイに加えて、PVCが高度の標的特異性を示し、適切な標的受容体を表示する細胞にのみペイロードを効率的に送達できるという証拠を提供します。

PVC が最終的に人間に使用できるかどうかを理解するために、次に、生きたマウスにタンパク質を送達することを試みました。マウス細胞を標的とするPVC変異体を作製するために、我々は再びPvc13のAlphaFold誘導エンジニアリングを使用した（図4a）。我々は、2 つの新しい結合ドメインをスクリーニングしました: (1) Ad5 の宿主範囲をマウス組織に拡大するために以前に使用されていた修飾 Ad5 ノブドメイン (Ad5-knob(RGD/PK7)) 44、および (2) マウス受容体を標的とするナノボディ 45 (MHCクラスII)。 Pvc13にこれらの新しい結合ドメインを装備した後、得られたPVCは、マウス細胞株および初代細胞において非常に増強された活性を生成しました（図4b）。注目すべきことに、Ad5-knob(RGD/PK7)で再標的化されたPVCは広範な指向性を示したものの(Ad5 RGD/PK7ウイルスに当てはまります44)、MHCクラスIIを標的としたPVCはMHC+免疫細胞に対して強い優先性を示し、さらなる証拠が得られたことが観察されました。 PVC 活性は、適切な標的受容体の存在に依存します。

a、AlphaFold が予測した新規マウス標的 Pvc13 (尾繊維) 設計の構造。 Pvc13 の野生型結合ドメインを、Ad5 結合ドメインの拡張指向性バリアント (Ad5-knob(RGD/PK7)) またはマウス MHC クラス II タンパク質 (MHCII) をターゲットとするナノボディ (Nb) に置き換えました。 b. 新しいマウスを標的とした PVC デザインは、マウス細胞株および初代細胞全体で活性の向上を示します。スパイク先端タンパク質 (Pvc10) が欠損した PVC を、両方の新規 Pvc13 設計のネガティブコントロールとして使用しました。 c、左、PVCによるマウス脳へのタンパク質送達を示す概略図。右、Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7)を備えたPVCは、Ai9(loxP-tdTomato)マウスの海馬でtdTomatoシグナルを生成します。スパイク先端タンパク質 (Pvc10) が削除されると蛍光が消失し、観察された活性が PVC によって媒介されたことが確認されました。注射部位は白い矢印で示されています。スケールバー、500μm。 d、PVC は生体内でニューロンを標的とします。 cのように頭蓋内注射を実行し、処理された脳からの単一細胞抽出物をフローサイトメトリーで分析しました。フローサイトメトリーのゲーティングスキームを拡張データの図 8a に示します。 MFI、平均蛍光強度。 e、PVC の頭蓋内注射は、CNS への免疫細胞の遊走を誘発しません。フローサイトメトリーのゲーティングスキームを拡張データの図 8d に示します。 f、PVC はマウスの脳内で一時的です。無傷の粒子は、0 日または 1 日後には処理マウスの脳から容易に精製できますが、7 日後には精製できません。これは、PVC が脳組織に長期間残留しないことを示しています。スケールバー、500 nm。データは平均 (b) または平均 ± SD (d,e)、n = 2 (b) または n = 3 (d,e) の生物学的複製です。ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析 (d、e)。

ソースデータ

マウス細胞を標的とすることができる新しい PVC デザインを特定した後、我々は次に in vivo でのタンパク質送達を達成することを試みました。 Pvc13-Ad5-knob（RGD/PK7）を含むPVCにCreをロードし、得られた粒子をloxP-tdTomatoレポーターマウスに頭蓋内注射しました。また、スパイク先端を欠く同様のPVC（Pvc10）を別のマウスに注射しました。Pvc10は、in vitroでのPVC媒介送達に必要であることが判明したタンパク質です（図4b）。 Δpvc10 PVC は依然として無傷の粒子を形成し、ペイロードを負荷し（拡張データ図 7a ～ c）、Δpvc13 PVC よりもマクロファージでの非特異的活性が少ないことが判明したため、このデザインを in vivo 実験のネガティブコントロールとして選択しました（拡張データ図 7a-c）。 7d、e）。 Pvc13-Ad5-knob（RGD / PK7）粒子を頭蓋内注射した後、海馬でCreを介したtdTomato発現が観察され（図4c）、PVCが生体内で活性であることを示しています。さらに、処理した脳から単細胞懸濁液を抽出し、フローサイトメトリーでニューロンとミクログリアのtdTomatoシグナルを定量しました（図4dおよび拡張データ図8a、b）。私たちはニューロン（ミクログリアではない）で tdTomato シグナルが大幅に濃縮されていることを発見し、Pvc13-Ad5-knob（RGD/PK7）を保有する PVC が in vivo でニューロンを標的にできることを示しました（この結果を一次ニューロンに対して in vitro で確認しました。拡張データ図）。 8c)。また、PVC治療では、免疫細胞の有意な活性化（図4eおよび拡張データ図8d）、炎症性サイトカインの産生（拡張データ図8e）、体重の減少（拡張データ図8f）が生じないこともわかりました。または細胞毒性（拡張データ図8g）。これは、PVC処理がこの実験時間経過中に免疫原性も毒性もなかったことを示しています。最後に、無傷のPVCはt = 0または1日では処理された脳から容易に精製できるが、t = 7日以降は精製できないこともわかりました（図4f）。これは、PVCが脳内で一時的であり、長期間持続しないことを示しています時間のこと。これは、このシステムが一時的または短期間の治療に最適であることを示唆しています。まとめると、これらの結果は、PVC が生体内でタンパク質を送達できることを示しており、このシステムがヒト用の送達ツールとして最終的に使用するのに適した位置にあることを示唆しています。

要約すると、eCIS（PVCpnf）は、非ネイティブペイロード（図1e、g）をロードすることと、新しい生物をターゲットにすること（図2a、4bおよび拡張データ）の両方を変更できるプログラム可能なタンパク質送達デバイスであることを実証しました。図5、6、9、10）。 PVCターゲティング要素（pvc13;尾繊維）に関する我々の研究では、PVCが高度に標的特異的であり、PVC活性が尾繊維と標的細胞上の受容体との結合の成功に依存していることがさらに示された（図2a、d、および） 3b ～ d および拡張データ図 5d および 6e、f)。最後に、癌細胞の特異的殺傷やゲノム編集のメディエーターなど、さまざまな状況における送達ツールとしての PVC の応用を実証し（図 2a ～ d）、このシステムが昆虫細胞で意図したとおりに動作することを示しました。（図1f、g）、ヒト細胞（図2および3）、初代細胞（図4bおよび拡張データ図8c）、および生きたマウス（図4c、dおよび拡張データ図8b）。この研究は共に、生物制御からヒト遺伝子治療に至るまでのさまざまな用途での使用に適した、プログラム可能なタンパク質送達ツールの多用途クラスの開発を構成します。

PVCpnf の構造領域およびアクセサリー領域 (pvc1-16)、ならびにペイロードおよび制御領域 (Pdp1、Pnf および制御遺伝子 PAU_RS16570-RS24015) を新規合成 (GenScript) し、それぞれ pAWP78 および pBR322 バックボーンにクローニングしました。ペイロードおよび調節プラスミド (pPayload) を含むすべての操作には、Phusion Flash 2x Master Mix (ThermoFisher) を使用した標準的な PCR 増幅、Gibson Assembly Master Mix (NEB E2611L) または AarI および T4 DNA リガーゼを使用した Golden Gate Assembly (ThermoFisher ER1582; NEB) を使用したアセンブリが含まれていました。 M0202)、化学的にコンピテントな Stbl3 細胞への形質転換。 PVC 構造プラスミドおよびアクセサリープラスミド (pPVC) は、メーカーのプロトコールにいくつかの変更を加えた KOD Xtreme Hot Start DNA ポリメラーゼ (Sigma-Aldrich 71975) を使用して増幅されました: 100 ng のテンプレート DNA、16 サイクル、および 30 分の伸長時間。次に、Gibson Assembly Master Mix を使用して、50 °C で 2 ～ 4 時間のインキュベーション期間でこれらのプラスミドを組み立て、EPI300 エレクトロコンピテントセル (Lucigen EC300110) にエレクトロポレーションしました。この研究中に生成されたプラスミドの概要を補足表 7 に示します。注釈付きのプラスミド配列は補足データ 1 にあります。

各 PVC 条件について、pPVC および pPayload の各 1 つのバリアントを EPI300 セルにエレクトロポレーションし、以前に使用した方法の修正バージョンを使用して PVC 粒子を精製しました9。コロニーを2 mlのTerrific Broth (US Biological T2810)に植菌し、37℃で16時間振盪した後、500 mlのTB培地に(1:1,000で)植菌し、30℃でさらに24時間振盪した。次いで、培養物を4,000gで30分間遠心し、28mlの溶解緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.5 (ThermoFisher 15567027)、140mM NaCl (AmericanBio AB01915)、3mM KCl (Sigma-Aldrich P9541)、5mM)に再懸濁した。 MgCl2 (Sigma-Aldrich M4880)、200 μg ml-1 リゾチーム (ThermoFisher 89833)、50 μg ml-1 DNase I (Sigma-Aldrich DN25)、0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich 93443)、および 1 × プロテアーゼInhibitor Cocktail (MedChem Express HY-K0010)) を加え、その後 37 °C で 90 分間振盪して溶解を促進しました。次に、溶解物を 4,000 g、4 °C、30 分間でペレット化し、バルク細胞溶解物を除去しました。次に、上清を抽出し、超遠心分離機で 120,000 g、4 °C で 2 時間遠心して、PVC タンパク質複合体をペレット化しました。ペレットを1 mlのPBS (Life Technologies 10010049)に再懸濁し、4℃、16,000gで15分間遠心して、残留固体溶解物を除去した。次いで、上清を２８ｍｌの冷ＰＢＳに加え、超遠心分離機回転（１２０，０００ｇで２時間）および清澄化回転（１６，０００ｇで１５分間）をさらに２回繰り返した。最終ペレットを 50 μl PBS に再懸濁し、NanoDrop 装置 (ThermoFisher) での A280 測定によって PVC 収量を定量しました。マウス実験では、洗剤ベースの方法を使用して最終 PVC サンプルからリポ多糖を除去しました 46。簡単に説明すると、サンプルを 1 ml の冷 PBS で希釈し、20 μl の Triton X-114 (Sigma-Aldrich X-114) を加えました。次に、サンプルをチューブターナー内で 4 °C で 30 分間インキュベートし、37 °C に 10 分間移して界面活性剤を溶液から取り出し、20,000g で 20 分間 37 °C で回転させてタンパク質を分離しました。そして界面活性剤相。上相 (タンパク質を含む) を抽出し、この手順をさらに 2 回繰り返し (つまり、Triton X-114 を合計 3 回添加)、最終タンパク質相を 300 mg Bio-Beads SM-2 ( Bio-Rad 1523920) チューブターナー内で 4 °C で一晩処理しました。次に、タンパク質サンプルをビーズから抽出し、0.2 μm 滅菌フィルター (Pall 4612) に通し、最終超遠心分離機で 50 μl PBS まで濃縮しました。次に、Pierce Chromogenic Endotoxin Quant Kit (ThermoFisher A39552) を使用してエンドトキシンレベルを定量しました。すべての PVC サンプルは、使用前に最大 1 週間、PBS 中で 4 °C で保存されました。

内因性 PVC ペイロード (Pdp1 および Pnf) が PVC 複合体とは独立して細胞毒性を生じたかどうかを判断するために、これらの各タンパク質を分離して精製しました。各ペイロードはアフィニティーおよび溶解度タグ (6×His-Strep-SUMO) でタグ付けされ、大腸菌 BL21 (DE3) コンピテントセル (Sigma-Aldrich CMC0016) に形質転換されました。コロニーを5mlのTB培地に接種し、37℃で16時間振盪した後、追加の1lのTBに(1:200で)接種した。次に、これらの培養物を A600 が 0.6 ～ 0.8 に達するまで 37 °C で振盪し、その後 0.5 mM IPTG (Goldbio I2481C) で誘導し、37 °C でさらに 4 時間振盪しました。次に、培養物を 4,000g で 30 分間遠心し、50 ml の冷溶解バッファー (50 mM Tris-HCl pH 7.5 (ThermoFisher 15567027)、280 mM NaCl (AmericanBio AB01915)、3 mM KCl (Sigma-Aldrich P9541)、5) に再懸濁しました。 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich M4880)、バッファー 50 ml あたりベンゾナーゼ (Sigma-Aldrich E1014) 1 μl、およびバッファー 50 ml あたり cOmplete 1 錠 (Sigma-Aldrich 11836170001)。再懸濁した細胞を30分間撹拌して均一な混合物を確保し、その後Microfluidics M110Pマイクロフルイダイザーに2回通した。次に、溶解物を9,000gで30分間、4℃で遠心し、上清をStrep-Tactin Superflow Plus樹脂（Qiagen 30004）の50％スラリー（溶解緩衝液中）2.5mlに加え、4℃で30分間撹拌した。分。次に樹脂を 4 ℃、2,000 g で 3 分間ペレット化し、40 ml 溶解バッファーで 2 回洗浄し、最後にカラム (ThermoFisher 29922) にアプライし、排出させました。カラムにキャップをして、次に 12.5 ml の冷溶出バッファー (25 mM Tris-HCl pH 7.5 (ThermoFisher 15567027)、140 mM NaCl (AmericanBio AB01915)、3 mM KCl (Sigma-Aldrich P9541)、5 mM MgCl2 (Sigma) を加えました。 -Aldrich M4880)、および SUMO プロテアーゼ (J. Strecker からの贈り物)) をカラムあたり 100 μl 加え、カラムを 4 °C で一晩インキュベートして、樹脂からタンパク質を遊離させました。次に、精製タンパク質を 10 kDa Amicon Ultra フィルター (Sigma-Aldrich UFC901024) を使用して濃縮し、NanoDrop 装置 (ThermoFisher) での A280 測定によって定量化し、SDS-PAGE とそれに続くクーマシー染色によって適切な発現と精製を確認しました。すべてのタンパク質ゲルの生のトリミングされていないバージョンは、補足図 1 にあります。

タンパク質がPVCにロードされているかどうかを判断するために、遊離タンパク質よりも高分子量複合体を優先的に精製するPVC精製手順の傾向を利用しました（拡張データ図3a）。ペイロードタンパク質 (pPayload にクローン化) に C 末端 HiBiT タグを付け、タグ付きペイロードを含む PVC 粒子を精製しました。 PVC のベースプレート (pvc12 によってコード化) にも HiBiT タグを付けて、ウェスタンブロットのローディングコントロールとして機能させました。得られた PVC (ロードされたペイロードを含む) 20 マイクログラムを、NuPAGE LDS サンプルバッファー (ThermoFisher NP0008) および NuPAGE サンプル還元剤 (ThermoFisher NP0009) と両方とも最終濃度 1 倍になるまで混合し、その後 95 °C で煮沸しました。 10分間次に、変性 PVC ペイロードサンプルを NuPAGE Bis-Tris 1 ～ 12% タンパク質ゲル (ThermoFisher NP0321) 上で 1× MOPS バッファー (ThermoFisher NP000102) 中で 200 V で 30 分間実行し、iBlot 2 装置 (サーモフィッシャー）。低分子量ペイロードを視覚化するために（拡張データ図3c、dで行ったように）、代わりに、1× MESバッファー（ThermoFisher B0002）中のNuPAGE Bis-Tris 12％タンパク質ゲル（ThermoFisher NP0342）上で変性タンパク質サンプルを実行しました。最後に、Nano-Glo HiBiT ブロッティングシステム (Promega N2410) を使用してペイロードバンドを視覚化し、Bio-Rad ChemiDoc 装置で画像をキャプチャしました。 PVC パッケージングドメインを介してロードされた非天然タンパク質の代表的なアミノ酸配列は、補足表 5 にあります。

この研究で使用された細胞株のリストは、補足表 8 にあります。細胞株は主に商業的供給源から入手したため、使用前にマイコプラズマについて認証またはテストされていません。特に明記しない限り、哺乳動物細胞は、T75 フラスコ (ThermoFisher 156499) 内で、DMEM-GlutaMAX (ThermoFisher 10569044) または RPMI-GlutaMAX (ThermoFisher 61870127) のいずれか中で 5% CO2、37 °C で維持され、昆虫細胞は 125 ℃で穏やかに振とうされました。 ml シェーカーフラスコ (Sigma-Aldrich CLS431143)、ESF921 (VWR 100000-000) 中で 28 °C で使用します。すべての培地には、10 μg ml-1 ゲンタマイシン (Sigma-Aldrich G1397) および 1 × ペニシリン - ストレプトマイシン (ThermoFisher 15140122) が補充されました。哺乳類培地には 10% FBS (VWR 97068-085) も補充されました。初代脾細胞の増殖のために、培地にはマウス IL-2 (Peprotech 212-12) および 50 μM 2-メルカプトエタノール (ThermoFisher 21985023) も補充しました。

インビトロでの PVC 媒介タンパク質送達を検出するために、標的細胞を 96 ウェル透明底 96 ウェルプレート (VWR 89091-012) に播種し、約 80% コンフルエンスまで増殖させました。次いで、PVC をウェルあたり 50 μl の細胞培養培地中に最終濃度 150 ng μl-1 になるように添加しました。 Cre レポータープラスミドまたはガイド RNA プラスミドの同時トランスフェクションを伴うアッセイでは、ヒト細胞の場合は GeneJuice Transfection Reagent (Sigma-Aldrich 70967)、Sf9 の場合は Insect GeneJuice Transfection Reagent (Sigma-Aldrich 71259) を使用して、PVC を添加した直後に DNA をトランスフェクトしました。細胞。標的受容体（たとえば、図 3 の EGFR または表面提示抗エピトープタグ抗体）のトランスフェクションを伴うアッセイの場合、これは PVC の添加の 24 時間前に行われました。毒素送達実験では、CellTiter-Glo 2.0 細胞生存率アッセイ (Promega G9241) および/または生存率染色 (8 ng μl-1 FDA (Sigma-Aldrich F7378) + 20 ng μl-1 PI (Sigma- Aldrich P4170)) と Zeiss Observer D1 顕微鏡によるイメージング。これらの分析は、哺乳類細胞については t = 24 時間、Sf9 細胞については t = 2 日 (CellTiter-Glo)/4 日 (FDA/PI 染色およびイメージング) で実行されました。 CellTiter-Glo アッセイでは、負の細胞毒性を避けるために、対照ウェル (PBS) よりも高い発光を示すウェルには 0% の細胞毒性値が割り当てられました。 Cre による GFP 発現を伴うアッセイでは、細胞を 4 日間インキュベートし、その後 Leica DMi8 共焦点顕微鏡で画像化し、フローサイトメトリーで分析しました (「インビトロ PVC 実験のフローサイトメトリー分析」を参照)。遺伝子編集実験では、細胞を 4 日間インキュベートし、ゲノム DNA を 50 µl QuickExtract DNA Extraction Solution (Lucigen QE09050) で抽出し、インデルまたは塩基置換を NGS で定量しました (「ディープシーケンシング」を参照)。 PVC 実験からのすべての数値データは Prism (9.3.1) でプロットされ、図は Adobe Illustrator (25.2.3) でグラフィカルに組み立てられました。

新しい PVC テールファイバー設計の構造を予測するために、Google Colab ベースの AlphaFold235、36、37 の実装である ColabFold を活用しました。すべての尾部ファイバー設計について、デフォルトのモデル/MSA 設定と num_recycles を 12 に設定した AlphaFold2_mmseqs2 (v1.2) でシーケンスが三量体としてクエリされました。実行は、NVIDIA Tesla A100 GPU を実行する Google Cloud 仮想マシンによってサポートされました。得られた構造を視覚化し、PyMOL (2.5.2) で再着色しました。

精製された PVC 粒子の日常的なネガティブ染色 TEM 分析は、コッホ研究所ナノテクノロジー材料コア施設または MIT 材料研究所のいずれかで実行されました。簡単に説明すると、各 PVC サンプル (100 ～ 500 ng μl-1 に希釈) 5 ～ 10 μl をグロー放電 200 メッシュのカーボンコーティング銅 TEM グリッド (VWR 100489-722) に 60 秒間塗布した後、余分な液体を除去しました。キムワイプと一緒に。次に、グリッドを 10 µl の 2% 酢酸ウラニル染色液で 2 回処理するか (1 回目はすぐに軽くたたき、2 回目は 30 秒後に拭き取る)、または 2% ギ酸ウラニル染色液で 5 回処理します (5 秒、5 秒、10 秒間穏やかに撹拌しながらインキュベート) 、３０秒および３０秒）そして室温で乾燥させた。次に、(1) Gatan 2k × 2k UltraScan CCD カメラを搭載した 200 kV の JEOL 2100 FEG 顕微鏡、または (2) Gatan Orius SC1000B を搭載した 120 kV の FEI Tecnai (G2 Spirit TWIN) 顕微鏡のいずれかでグリッドをイメージングしました。カメラ。

PVC 粒子が標的細胞に結合するかどうかを確認するために、修正ネガティブ染色 TEM 法を使用しました。 A549 細胞を、高用量の PVC サンプル (最終濃度 1.8 μg μl-1) に曝露する前に、24 ウェルプレート内のグロー放電 200 メッシュカーボンコーティング金 TEM グリッド (VWR 76499-704) に高密度で接着させました。 ) 3 時間。次いで細胞を４％パラホルムアルデヒド（電子顕微鏡サイエンス１５７４）で１０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ギ酸ウラニルで５回染色し（上記と同じ方法による）、室温で乾燥させた。次いで、細胞を、Gatan Orius SC1000Bカメラを備えたFEI Tecnai (G2 Spirit TWIN)顕微鏡を用いて120 kVで画像化した。

PVC 処理したヒト細胞の高解像度イメージングは、走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して実施されました。 A549 細胞を 24 ウェルプレートの 12 mm カバーガラス (VWR 354087) 上で 80 ～ 90% コンフルエントになるまで増殖させた後、中量の PVC サンプル (500 ng µl-1) に 3 時間曝露しました。次に細胞を2.5%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒド/100mMカコジル酸ナトリウムを用いて4℃で1時間固定し、100mMカコジル酸ナトリウムで2回洗浄し(それぞれ4℃で5分間)、1%四酸化オスミウムで処理した。 /カコジル酸ナトリウムで 4 °C で 30 分間洗浄し、蒸留水で 3 ～ 4 回（各 10 分間）洗浄し、エタノールで脱水し、50% TMS/50% エタノールで 15 分間処理し、80% TMS/20% で処理エタノールで 15 分間洗浄し、100% TMS で各 5 分間 2 回処理し、風乾させた後、スパッタリングコーティングと Zeiss Crossbeam 540 SEM/集束イオンビームでのイメージングを行いました。

PVC 粒子が標的細胞に結合したかどうかを確認するために、外部 PVC タンパク質 (Pvc2) を N 末端 Flag タグでタグ付けし、得られた PVC 粒子 (300 ng µl−1) を標的細胞に 37 °C で 3 時間曝露しました。。次に細胞を4%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences 1574)で10分間固定し、ブロッキング緩衝液(10%ヤギ血清(Sigma-Aldrich G9023)および0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich 93443))で1時間ブロックした。 PBS で希釈）、M2 抗 Flag 抗体（Sigma-Aldrich F1804; ブロッキングバッファーで 1:500 に希釈）で 1 時間染色、Alexa Fluor 488 結合二次抗体（ThermoFisher A11001; 1 に希釈）で 1 時間染色ブロッキングバッファー中 1,000）、1 μg ml-1 DAPI（ThermoFisher D1306; PBS で希釈）で 10 分間染色し、Leica DMi8 共焦点顕微鏡を使用して画像化しました。 Pvc2 上の Flag タグの位置を示すアミノ酸配列は、補足表 6 にあります。

また、細胞骨格に対する PVC の影響を調べるために免疫蛍光法も使用しました (拡張データ図 6a)。まず標的細胞を96ウェルプレートに播種し、約80%コンフルエントまで増殖させた後、PVC（最終濃度150 ng μl−1）に24時間曝露しました。次に細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定し、ブロッキングバッファーで 1 時間ブロックし、ローダミンファロイジン (ThermoFisher R415; ブロッキングバッファーで最終濃度 1 倍に希釈) で 1 時間染色し、1 μg で 10 分間染色しました。 ml-1 DAPI (ThermoFisher D1306; PBS で希釈)、Leica DMi8 共焦点顕微鏡を使用して画像化しました。

PVC を介した Cre 送達に関する実験では、フローサイトメトリーを使用して送達効率を測定しました。まず細胞を TrypLE Express 解離試薬 (ThermoFisher 12604) とインキュベートして回収し、300 g で 3 分間ペレット化し、100 μl のフローサイトメトリーバッファー (2% EDTA (Life Technologies 15575020) および 5% FBS (VWR) を補充した PBS) に再懸濁しました。 97068-085))。サンプルは Beckman Coulter Cytoflex S フローサイトメーターで実行され、CytExpert (2.3.1.22) および FlowJo (10.8.2) を使用して分析が実行されました。ゲートおよびしきい値設定の代表的なスキームを拡張データの図 4c に示します。

標的細胞における PVC 誘導性のゲノム編集を検出するために、まず NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix (NEB M0541) を使用して各ゲノム DNA 抽出物から標的領域を増幅しました (「インビトロ PVC 送達実験」を参照)。次に、インデックス付き Illumina P5 および P7 NGS プライマーを使用して標的領域にバーコードを付けました。ライブラリーを Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen 28104) で精製し、NanoDrop 装置 (ThermoFisher) で定量し、Illumina MiSeq 装置 (リード長を 300 bp に設定) で配列決定しました。次に、Geneious Prime (2020.0.5) を使用して、インデルと塩基置換を定量しました。ディープシーケンシングに使用されるプライマーは、補足表 9 にあります。

PVC 遺伝子発現に対する調節遺伝子の影響を評価するために、定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) を使用しました。大腸菌 EPI300 細胞に pPVC および pPayload の各 1 つのバリアントをエレクトロポレーションし (「PVC 精製」で説明したとおり)、コロニーを 5 ml TB 中で 37 °C で 16 時間振盪しました。次に、培養物を 4,000g で 5 分間遠心し、TRI 試薬 (Zymo R2073) 750 μl に再懸濁し、室温で 5 分間インキュベートし、250 μl の 0.5 mm ジルコニアビーズ (Fisher) とボルテックス (1 分間) することにより機械的に溶解しました。 NC0450473）。次に、200 µl のクロロホルムを加え、室温で 3 分間インキュベートし、12,000 g (4 °C) で 15 分間遠心分離し、Zymo Direct-zol RNA Miniprep Kit (Zymo R2073) を使用して RNA 抽出のために水相を抽出しました。オプションの DNAse ステップ。次に、メーカーのプロトコールに従って、ProtoScript II 逆転写酵素 (NEB M0368) およびランダムプライマー (NEB S1330) を使用して、これらのバルク RNA 抽出物から cDNA を生成しました。最後に、Bio-Rad CFX Opus 384 qPCR 装置で Fast SYBR Green Master Mix (ThermoFisher 4385612) を使用して、得られた cDNA に対して qPCR を実行しました。デルタデルタ Ct 値は、ハウスキーピング遺伝子ギャップ A47 に対して計算されました。 qPCR に使用されるプライマーは補足表 10 にあります。

PVC は、質量分析による分析のために Koch Institute Biopolymers and Proteomics Facility に送られる前に、PBS で約 36 μg μl-1 に希釈されました。簡単に説明すると、タンパク質を 10 mM ジチオスレイトール (Sigma-Aldrich 11583786001) で 95 °C で 10 分間還元し、次に暗所で 20 mM ヨードアセトアミド (Sigma-Aldrich I5161) で 25 °C で 30 分間アルキル化しました。次いで、製造業者のプロトコールに従って、タンパク質をS-Trapマイクロカラム(ProtiFi CO2-micro-80)上でトリプシンで消化した。トリプシンペプチドは、PepMap RSLC C18 カラムと 2 μm EASY-Spray チップ (ThermoFisher ES903) を使用した逆相 HPLC (Thermo UltiMate 3000) によって 90 分間の勾配にわたって分離され、その後 Exploris マスを使用したナノエレクトロスプレーに供されました。分光計（サーモ）。結果としてマッピングされたペプチドのヒットは補足データ 2 にあります。

すべてのマウス実験は国立衛生研究所によって確立されたガイドラインに準拠し、MIT とハーバード大学のブロード研究所の動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコールに基づいて実施されました。動物は、盲検化することなく、対照条件または実験条件のいずれかで治療するためにランダムに選択されました。雌の Ai9 マウス (8 ～ 12 週齢) を Jackson Laboratory から入手しました (系統 007909)。すべてのマウスは、餌と水を自由に摂取できるように、12 時間の明暗サイクルで維持されました。マウスはイソフルラン (2 ～ 3%) を使用して麻酔され、定位固定手術の準備が整いました。毛皮を剃り、マウスを定位固定フレーム（Kopf Instruments）に置いた。低体温症を防ぐために、マウスの下に加熱パッドを置きました。手術中はイソフルラン (1 ～ 2%) がノーズコーンを介して送達されました。目を保護するために眼科用軟膏が使用されました。ブプレノルフィン-SR (1 mg kg-1、皮下) を手術開始前に投与した。ブピバカイン (1 mg kg-1) を局所麻酔薬として切開線に沿って皮内注射しました。メロキシカム (2 mg kg-1) も手術前に皮下投与されました。頭皮をベタジンスクラブと70%エタノールで消毒した。頭皮の正中線に沿ってメスを使用して切開を行った。露出した頭蓋骨を徹底的に洗浄し、海馬の上で開頭術を行いました。 PVC タンパク質を海馬 (-2.3 AP、1.25 ML、-3 および -1.5 DV) に標的化し、10 μl ハミルトンシリンジ (700 シリーズマイクロリットルシリンジ、ハミルトン、モデル) を使用してゆっくりと圧力注入しました (100 nl min-1)。 701 N シリンジ）およびマイクロシリンジポンプコントローラー（Micro 4; WPI）。注射後、針を所定の位置に 2 分間放置し、その後ゆっくりと引き抜きました。 7.5 μg μl-1または3,000 nlで合計1,000 nl（図4c; -2.0 DVで500 nlおよび-1.5 DVで500 nl）または3,000 nl（図4d〜fおよび拡張データ図8b、e、f。 -3.0 DV で 1,500 nl、-1.5 DV で 1,500 nl)、1.2 μg μl-1 の PVC サンプルをマウス 1 匹あたり注射しました。注射後、4-0 エチロンナイロン縫合糸を使用した単純な連続縫合パターンで皮膚を密閉しました。切開部を0.9%滅菌生理食塩水と滅菌綿棒アプリケーターで拭き取り、きれいにしました。マウスは術後に生理食塩水で水分補給され、歩行可能な状態に回復するまで温度管理された環境で飼育されました。術後の痛みを軽減するために、メロキシカム (2 mg kg-1) を術後最低 72 時間まで 24 時間ごとに皮下投与しました。

注射後 t = 12 日目に、マウスを 90 mg kg-1 の用量の Fatal-Plus で深く麻酔し、20 ml の PBS、続いて 20 ml の 4% パラホルムアルデヒド溶液で経心臓的に灌流しました。脳を素早く抽出し、4％パラホルムアルデヒド溶液中で4℃で24時間保存し、その後30％スクロースを含むPBS溶液に移し、2日間平衡化させました。次いで、ＯＣＴを使用して脳をクライオスタットに載せ、冠状に切片化した（５０μｍ）。浮遊切片を PBS で洗浄し、抗 NeuN 抗体 (Sigma-Aldrich MAB377; 1:500) および Alexa 488 二次抗体 (ThermoFisher A11001; 1:1,000) を使用してニューロンを染色しました。切片を PVA-DABCO を使用してスライドにマウントしました。画像は、10 倍および 20 倍の空気対物レンズを備えた Leica DMi8 共焦点顕微鏡を使用して取得されました。

ｔ＝１、３および７日後に動物をＣＯ２で深く麻酔し、２０ｍｌのＰＢＳで経心臓的に灌流した。 PVC または模擬注射されたマウスの脳を抽出し、メスを使用して標的半球を断片に切断し、50 μg ml-1 リベラーゼ (Sigma-Aldrich 05401119001) で 37 °C で 30 分間消化しました。単一細胞懸濁液は、ゆっくりと繰り返しピペッティングして生成されました。ミエリン除去ビーズ II、ヒト、マウス、ラット (Miltenyi Biotec 130-096-733) および LS カラム (Miltenyi Biotec 130-042-401) を使用してミエリンを手動で除去し、その後成人ニューロン分離キット (Miltenyi) を使用して神経細胞を濃縮しました。 Biotec 130-126-603) および LS カラム。濃縮された細胞集団は、Cytofix Fixation Buffer (BD 554655) を使用して 4 °C で 30 分間固定され、フローサイトメトリー用の抗体染色の前に 1:50 TruStain FcX (抗マウス CD16/32) 試薬 (BioLegend 101320) でブロックされました。抗体と希釈液は補足表 12 に記載されています。

96 ウェルプレートを、単離の 1 日前に 0.05 mg ml-1 のポリ-D-リジン (BD 354210) でコーティングしました。 10 mM HEPES (ThermoFisher 15630080)、33 mM d-グルコース (Sigma-Aldrich G8270)、および 43 mM スクロース (Sigma-Aldrich S0389) を添加した HBSS (ThermoFisher 14025092) を使用して解剖溶液を作成しました。時限妊娠雌 C57BL/6J マウス (12 週齢) を、MIT とハーバード大学のブロード研究所の動物管理使用委員会 (IACUC) の標準操作手順に従って屠殺しました。脳を胎生16.5日目の胚から抽出し、解剖溶液中で解剖した。下流のニューロンの単離には全皮質組織を使用しました。 TrypLE Select (ThermoFisher 12563011) を使用して組織を 30 分間消化し、トリプシン阻害剤 (Sigma-Aldrich T9253) および BSA (Sigma-Aldrich A9418) を添加した解剖溶液で 2 回洗浄しました。単一細胞懸濁液を繰り返し粉砕して調製し、B-27 Plus Supplement (ThermoFisher A3582801) を補充した Neurobasal-A Medium (ThermoFisher 10888022) で細胞を培養しました。

CNS 浸潤骨髄細胞および T 細胞の分離は、以前に記載されているように実行されました 48。簡単に説明すると、t = 1、3、および 7 日後にマウスを CO2 で深く麻酔し、20 ml の PBS を経心的に灌流しました。 PVC または疑似注射されたマウスの脳を抽出し、メスを使用して標的半球を断片に切断し、50 μg ml-1 リベラーゼ (Sigma-Aldrich 05401119001) で 37 °C で 30 分間消化し、その後 100 μm にすりつぶしました。および 70 µm セルストレーナー (Greiner One-Bio 542000 および 542070)。ミエリンを、2,700 rpmでの30%連続Percoll (Sigma-Aldrich GE17-0891-01)勾配および密度遠心分離を使用して除去した。ミエリン除去後、脳浸潤免疫細胞の単細胞懸濁液を PBS で調製し、フローサイトメトリー用の抗体染色の前に 1:50 TruStain FcX (抗マウス CD16/32) 試薬 (BioLegend 101320) でブロックしました。生細胞を識別するために、フローサイトメトリー分析の直前に、DAPI 染色溶液 (Miltenyi Biotec 130-111-570) を 1:100 希釈で添加しました。脳の実質細胞を取り囲む間質液を、ＰＢＳ中での注射後の示された時点での刻み脳組織の洗浄および５００ｇでの遠心分離によって単離した。インターロイキン 1β (IL-1β)、インターロイキン 6 (IL-6)、インターフェロン γ (IFN-γ)、および腫瘍壊死因子 (TNF) のサイトカイン ELISA は、メーカーのプロトコル (Invitrogen 88-7013-22) に従って実行されました。、88-7064-22、88-7314-22、88-7324-22）を使用し、450 ～ 570 nm の吸光度を測定しました。サイトカイン濃度は、メーカーのプロトコールに従って、希釈した標準に対応して計算されました。

マウスの脳における PVC の残留性を研究するために、脳ホモジネートから間質液を分離しました。簡単に言うと、PVC 処理マウスを安楽死させ、完全な無傷の脳を抽出する前に PBS による経心臓灌流を実行しました。脳組織は、滅菌メスを使用して機械的に解離され、その後、単一細胞懸濁液にダウンスホモジナイズされました。これらの単細胞懸濁液を 500 g で 5 分間遠心分離し、清澄化した上清を 28 ml PBS で希釈し、120,000 g で 2 時間、4 °C で超遠心分離して、無傷の PVC タンパク質複合体をペレット化しました。ペレットを 50 μl PBS に再懸濁し、16,000 g、4 °C で 15 分間遠心して、残留バルクホモジネートを除去しました。最後に、無傷の PVC 複合体を検出するために、ネガティブ染色 TEM で再懸濁液を分析しました。「電子顕微鏡法」を参照してください。

すべての統計分析は Prism (9.3.1) で実行されました。定量的データは、条件ごとに n = 2 ～ 4 の生物学的複製の平均 ± SD として表示されます。提示された複製の数は図の凡例にリストされています。特に明記しない限り、生物学的複製は、別個の培養ウェルまたはマウスにおける独立した処理を表します。すべての顕微鏡写真、ゲル、およびブロットは、少なくとも n = 3 回の独立した実験からの代表的な画像です。図の凡例に示すように、統計的有意性は、一元配置または二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定 (多重比較を補正するため) を使用して計算されました。 0.05 未満の P 値は統計的に有意であるとみなされます。すべての統計検定の結果 (P 値を含む) は、各図パネルの関連ソースデータとともにソースデータに含まれます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この作業中に生成されたすべてのプラスミド (補足表 7) は、Addgene から入手できます。シーケンシングリードは、BioProject ID PRJNA929529 の Sequence Read Archive から入手できます。トリミングされていないゲルおよびイムノブロット画像は補足図 1 にあります。ソースデータはこの論文に提供されています。すべての追加データは、リクエストに応じて著者から入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

著者らは、TEM および SEM イメージングに関する支援とトレーニングについて、DS Yun、M. Bisher、D. Mankus、および L. Lytton-Jean に感謝します。 Y. Zhang には、TEM イメージングに関する追加のガイダンスを提供していただきました。質量分析については RP Schiavoni 氏に協力していただきました。 G. フォーレ、バイオインフォマティクス技術の指導について。そしてZhang研究室のメンバー全員に、サポートと有益な議論をしていただきました。図中のいくつかのグラフィック (図 1f、g、および 3a の細胞、図 4c のマウス、脳およびニューロン、拡張データ図 1a および 3a の超遠心分離機、図 1b および拡張データ図 3a および 10 のペイロードタンパク質) ) は BioRender.com で作成されました。 JK はタンヤン自閉症研究センターの大学院フェローシップによって支援され、BL は国立がん研究所の助成金 (1F31CA275339-01) によって支援され、MS はヒューマンフロンティアサイエンスプログラムの長期フェローシップによって支援されています。 FZ は NIH 助成金 (2R01HG009761-05) によってサポートされています。ハワード・ヒューズ医学研究所。マサチューセッツ工科大学のポイトラス精神障害研究センター。 MITのホック・E・タンとK・リサ・ヤン自閉症研究センター。 MITのヤンタン分子治療センター。 MITのK.リサ・ヤン・ブレイン・ボディ・センター。 Broad Institute Programmable Therapeutics の寄付者。パーシング・スクエア財団、W・アックマンとN・オックスマン。 J.とP.ポイトラス。 BT慈善財団。アスネス家族財団。フィリップス家。 D.チェン; そしてR.メトカーフ。

ハワード・ヒューズ医学研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

ジョゼフ・クライツ、ミルコ・J・フリードリッヒ、アカシュ・グル、ブレイク・ラッシュ、斉藤誠、リアンノン・K・マクレー、フェン・チャン

MIT とハーバード大学のブロード研究所、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

ジョゼフ・クライツ、ミルコ・J・フリードリッヒ、アカシュ・グル、ブレイク・ラッシュ、斉藤誠、リアンノン・K・マクレー、フェン・チャン

米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、MIT マクガバン脳研究所

ジョゼフ・クライツ、ミルコ・J・フリードリッヒ、アカシュ・グル、ブレイク・ラッシュ、斉藤誠、リアンノン・K・マクレー、フェン・チャン

マサチューセッツ工科大学脳認知科学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

ジョゼフ・クライツ、ミルコ・J・フリードリッヒ、アカシュ・グル、ブレイク・ラッシュ、斉藤誠、リアンノン・K・マクレー、フェン・チャン

マサチューセッツ工科大学生物工学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

ジョゼフ・クライツ、ミルコ・J・フリードリッヒ、アカシュ・グル、ブレイク・ラッシュ、斉藤誠、リアンノン・K・マクレー、フェン・チャン

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JK と FZ がプロジェクトを発案し、すべての実験を設計しました。 JK は、PVC の発現、特性評価、エンジニアリングに関するすべての実験を実行しました。 MJF、AG、BL、JK はマウス注射およびその他のマウス関連処置を実施しました。 MJF は、マウス実験に関する計画とデータ分析に関して追加の支援を提供しました。 FZ と MS は、技術的手順に関して重要な指導と指導を提供しました。 FZ は、RKMJK の支援を受けてこの研究と実験計画を監督し、RKM と FZ の指導の下、すべての著者からの意見を得て原稿を執筆しました。

フォン・チャンへの対応。

JK と FZ は、米国仮特許出願第 2 号の共同発明者です。 Broad Instituteによって提出された「Cell-Type Specific Targeting Contractile Injection System」というタイトルの63/310,327。 FZ は、Editas Medicine、Beam Therapeutics、Pairwise Plants、Arbor Biotechnologies、Aera Therapeutics の科学顧問兼共同創設者です。 FZ は Octant の科学顧問でもあります。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Mark Hurst 氏、Martin Pilhofer 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、大腸菌での PVC 生産のワークフロー。 PVC 遺伝子座は新たに合成され、2 つの別々のプラスミドにクローン化されました。pvc1-16 を含む構造/アクセサリープラスミド (pPVC) と、考えられるいくつかの遺伝子とともに送達されるペイロード (Pdp1/Pnf) を含むペイロード/制御プラスミド (pPayload) です。 PVC 遺伝子発現を制御します (PAU_RS16570-RS24015)。 b、この原稿と以前の作品の PVC 長さ分布の比較 9。代表的な TEM 画像 (PVC の長さの測定に使用された ROI が黄色で強調表示されている) も示されています。スケールバー、200 nm。 c、推定PVC制御遺伝子のHHpred/Pfamアノテーション(PAU_RS16570-RS24015)。少なくとも 1 つの遺伝子 (PAU_RS16560) には、遺伝子制御に関与することが知られている予測ドメイン (LysR 型転写調節ドメイン) が含まれています。 d、PAU_RS16570-RS24015を使用した場合と使用しない場合の精製後のバルクタンパク質収量（500 mLの細菌培養物から）。これらの遺伝子を pvc1-16 と一緒に含めると、タンパク質収量の約 100 倍の増加が観察されました。値は、精製手順を n = 3 生物学的に独立して繰り返した場合の平均値 ± SD です。 e、PAU_RS16570-RS24015を使用した場合と使用しない場合の精製の結果を示すSDS-PAGEゲル。(d)の結果を確認します。 f、PAU_RS16570-RS24015を使用または使用しない精製の結果を示すTEM画像。(d)の結果をさらに確認し、得られたペイロード欠損粒子がまだ標準構造を保持していることを示しています。スケールバー、200 nm。 g、PAU_RS16570-RS24015を使用した場合と使用しない場合のPVC発現のRT-qPCR分析。 PAU_RS16570-RS24015 を欠く細胞では pvc1-16 の mRNA レベルの有意な減少は観察されず、これらの遺伝子がこの遺伝子座の転写調節因子として直接的な役割を果たしていないことが示されました。値は、各条件の n = 3 つの個別の qPCR ウェルでの平均です。 h、未精製細菌培養物および精製サンプル中の構造 PVC 成分 (Pvc12) に対するウェスタンブロット。 PAU_RS16570-RS24015 を欠く細菌では Pvc12 バンドが観察され、これらの遺伝子が少なくとも 1 つの PVC 構造タンパク質の発現に必要ではないことが証明されました。これは、PAU_RS16570 ～ RS24015 が PVC 粒子の (発現ではなく) 集合に影響を与えることを示唆している可能性があります。

ソースデータ

a、Flag-Pvc2 を保持する PVC は Sf9 細胞内で活性であり、Pvc2 への Flag タグの追加によってシース収縮 (標的細胞の注入に必要 7) が損なわれない可能性が高いことを示しています。値は、n = 3 の生物学的複製での平均 ± SD です。統計的有意性は、ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析を使用して計算されました。 ****P < 0.0001; ns、重要ではありません。 b、収縮したフラグタグ付き PVC が TEM で観察でき、このタグ付け戦略がシース収縮を阻害しないというさらなる証拠が得られます。収縮した表現型を示す PVC 粒子は矢印で示されています。スケールバー、100 nm。 c. T6SS (PDB: 3J9G) と PVC (PDB: 6J0B) の両方のシースサブユニット間のコネクタドメインには、シース収縮を失わずにこのタンパク質の N 末端フラグタグ付けを可能にする可能性が高い柔軟な N 末端ドメイン (NTD) が含まれています。。 d. PVC が伸長状態 (PBD: 6J0B、6J0C) にある場合、Pvc2 の N 末端が外部に露出し、Flag-Pvc2 を含む PVC 粒子の IF ベースの検出が可能になります。 Pvc2 の最初の 5 残基は、シース複合体内の位置を示すために緑色に色付けされています。 e、Flag-Pvc2 (緑色) を保持する PVC に対する IF シグナルは 24 時間後に減衰します。これは、おそらくこの IF メソッドが拡張状態の PVC を選択的に染色することを示唆しています。スケールバー、50μm。

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a、PVC でのペイロードの積載を研究するためのワークフロー。超遠心分離後のペレットには、完全に集合した PVC 粒子のみ (積載されたペイロードとともに) が局在化します。しかし、低分子量の遊離タンパク質はペレットになりませんでした。これにより、ペレット画分の変性ウェスタンブロットによる、ロードされたペイロードの同定が可能になりました。 b. PVC ペイロード Pdp1 には、予測された N 末端パッケージングドメインが含まれています。 Pdp1 の N 末端ドメイン (NTD) は、AlphaFold で低い pLDDT スコア (タンパク質の予測構造における長い無秩序な拡張として現れる) と高い PONDR VSL2 スコアを示すため、無秩序である可能性があります 49。この N 末端の無秩序な領域は、適切なペイロードを識別してロードする際に PVC のローディング機構を支援する分子識別子である「パッケージングドメイン」として機能する可能性があります。 cd、Pdp1 (c) および Pnf (d) の N 末端パッケージングドメインは、これらのタンパク質を PVC 粒子にロードするのに必要かつ十分です。 Pdp1 と Pnf は C 末端 HiBiT タグでタグ付けされ（ウェスタンブロットによる検出を可能にするため）、これらのペイロードを PVC 粒子にロードできる最小限の配列を特定するために連続的に切り詰められました。各ペイロードタンパク質のN末端上のドメインはローディングに十分であり、これらのNTDの切断によりローディングが阻害されたことから、Pdp1およびPnfのNTDがこのPVCのパッケージングドメインとして機能することが示された。図1eと同様に、各PVC粒子には同数のPvc12ユニットが見られるため、ベースプレートタンパク質（Pvc12）がこのウェスタンブロットのローディングコントロールとして選択されました。パネル (d) では、Pvc12 バンドと Pnf バンドの両方が同じゲル上で視覚化されていますが、2 つの異なる露光時間が使用されていることに注意してください (明るい Pvc12 バンドの過飽和を避けるため)。

a、アンロードされた PVC および個別に精製されたペイロード (毒素 Pdp1 および Pnf) は、Sf9 細胞で効率的な細胞毒性を生成するには不十分です。 Pdp1 および Pnf は、アフィニティー精製によって PVC 複合体とは独立して精製され、PVC にロードされた量とほぼ同等の用量で Sf9 細胞に投与されました ((b) の生物学的に関連するペイロード用量の決定)。効率的な細胞毒性は、PVC 複合体とペイロードタンパク質の両方が同時精製された場合にのみ観察されました。値は、n = 3 の生物学的複製での平均 ± SD です。統計的有意性は、ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析を使用して計算されました。 ****P < 0.0001。 b、(a)からの細胞毒性アッセイの用量決定。 HiBiT タグ付きペイロードタンパク質をロードした PVC を、コントロールタンパク質 (HiBiT コントロールタンパク質; Promega N3010) の滴定と並行して実行しました。次に、バンド強度 (ImageJ で定量化) を比較して、PVC にロードされたペイロードタンパク質のおおよその量を決定しました。この分析から、Pdp1 は Pnf よりも多量にロードされていることが観察されました (それぞれ、総タンパク質の約 1% と約 0.1%)。したがって、（a）のSf9細胞に、ロードされたPVCの用量の1％および0.1％の精製Pdp1およびPnfタンパク質を投与しました。 c、培養細胞におけるPVC媒介タンパク質送達の代表的なフローサイトメトリー分析。 FFC/SSC上で細胞をゲートして破片を除去した後、ポジティブコントロール条件（loxP-GFPとCreの両方でトランスフェクトされた細胞）を使用してGFP-/+閾値を設定しました。次に、この閾値を実験データに適用して、GFP を発現する細胞の割合を決定しました。

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a、PVC 尾部繊維遺伝子 (pvc13) のドメイン構成。尾線維には、他の CIS の尾線維と相同性のある N 末端ドメイン (NTD)、アデノウイルス線維のシャフトドメインにマッピングされるドメイン、およびバクテリオファージ尾線維の宿主結合ドメインと相同性のある C 末端ドメインが含まれています。。ドメインは統計的に有意な HHpred ヒット (>95%) に基づいて描画されており、おおよその縮尺どおりに描画されています。スケールバー、100 aa。 b、Pvc13はNTDを介してロードされており、C末端ファージファイバーチップドメインが細胞結合ドメインであることが示唆されています。 Pvc13 はいずれかの末端で切断されており、精製 PVC 粒子の変性ウェスタンブロットによってローディングを測定しました。 NTD の切断のみが Pvc13 の損失をもたらし、このドメインが尾部ファイバーを PVC に接続していることを示唆しています。組み立てられた PVC の存在を確認するために、ペイロード (Pdp1-NTD–Cre) に対する追加のブロットが含まれていました。 c、Pvc13のC末端ファージファイバーチップドメインは、バクテリオファージの既知の受容体結合ドメインと構造的および配列的類似性を共有している。 Pvc13 のファージ線維先端ドメイン (灰色) と Bizionia argentinensis のプロファージ尾部線維の類似領域 (シアン; PDB: 6OV6)、ファージ T4 の gp10 (マゼンタ; PDB: 5IV5) およびファージの gp12 の間で構造の重ね合わせが生成されました。 T4 (黄色、PDB: 5HX2)。 d. 野生型および人工 PVC 尾繊維の予測される構造と送達特性。 AlphaFold が予測した C 末端ファージ繊維先端ドメインの構造には、一端に球状先端を備えた螺旋管構造が含まれており、これが尾繊維全体の遠位標的認識ドメインであると仮説が立てられました。重要なのは、チューブを通ってループバックする短い 32 aa 領域 (CTD と標識、金色で示されている) も存在し、チューブを安定化している可能性があります。私たちは、この CTD を欠くデザイン (PVC 複合体と同時精製した場合) が、HEK 293FT での Cre 送達実験において誤解を招く活性を生成することを観察しました。これは、おそらく PVC 粒子からの Cre ペイロードの散発的な排出の結果です (遊離 Cre タンパク質は細胞に侵入する可能性があります)。配送車両とは独立して。50)。しかし、この CTD を維持した設計では、HEK 293FT では異常な信号が生成されず、ペイロードの排出が再び適切に規制されていることを示しています。代表的な Pvc13 設計のアミノ酸配列を補足表 1 ～ 4 に示します。スケールバー、150μm。

a、A549 細胞は、EGFR 特異的 PVC (Pvc13-E01-DARPin を保持) への曝露後に F-アクチンの凝縮を示し、内因性 PVC 毒素ペイロード (アクチン細胞骨格を標的とすることが知られている 24) が正常に送達されたことを示しています。スケールバー、100 μm (上の列) および 20 μm (下の列)。 b、(a)と同じPVCデザインで処理したA549細胞のSEM画像。スケールバー、100 μm (上の列) および 20 μm (下の列)。 c、EGFR特異的PVCは、A549細胞への結合を直接視覚化することができる。スケールバー、1 μm (左パネル) および 100 nm (右パネル)。 d. 収縮した PVC が細胞表面に見られ、ヒト細胞における PVC 媒介タンパク質送達が鞘の収縮によって媒介されることを示唆しています。スケールバー、100 nm。 e、Pvc13-Ad5-ノブのAlphaFold予測構造内の追加の非結合突然変異の位置。我々は、Ad5 の標的細胞への結合を阻害することが以前に示された単一アミノ酸置換をそれぞれ含む 2 つの追加の変異体 S408E および L485K をスクリーニングしました 51。 f, 新しい Ad5 ノブ変異体は、PVC を HEK 293FT 細胞に向けて再標的化することができません。 Pvc13-Ad5-ノブ（S408EまたはL485K）を備えたPVCにCreをロードし、loxP-GFPプラスミドを保有するHEK 293FT細胞に投与しました（図2a）。野生型 Ad5 ノブドメインを含む尾部繊維を備えた PVC のみが効率的な GFP 発現を生成しました。値は、n = 3 の生物学的複製での平均 ± SD です。スケールバー、150μm。 g、HEK 293FT セル上での Pvc13-Ad5 ノブを含む PVC の滴定。細胞を、ZFD-LまたはZFD-R（図2cのものと同じ粒子）をロードしたPvc13-Ad5ノブ粒子の希釈系列に曝露し、PVCを介した塩基置換をディープシーケンスで測定しました。 PVC 効率は約 1,000 ng/µL で飽和します。値は、n = 2 の生物学的複製の平均です。

ソースデータ

a、欠失pvc13（図1f、gで使用したもの）、短縮型pvc13（図2aで特徴付けられた結合ドメインであるaa 403-476を欠いている）、または欠失pvc10（図4b〜eで使用したもの）を含むPVC ）TEM 下ではすべて依然として無傷の粒子を形成しており、これらの遺伝子が PVC 複合体の構築に必要ではないことを示しています。スケールバー、100 nm。 b. pvc13 または pvc10 への変更は、ペイロードタンパク質のローディングに影響を与えません。内因性 PVC ペイロード Pdp1 および Pnf は HiBiT でタグ付けされ、野生型または変異型 PVC 複合体にロードされました。ペイロードのロードの成功は HiBiT ブロットで評価されました。変異体 PVC では Pdp1 または Pnf の有意な枯渇は観察されず、これらの遺伝子がペイロードの負荷には必要ではないことを示しています。 c、PVC の長さの規制は、pvc13 または pvc10 への変更によって中断されません。 PVC の長さは、拡張データの図 1b と同様の手法で測定されました。変異体 PVC では長さの分布に大きな変化は観察されませんでした。 d、PVC は、野生型 pvc13 または pvc10 の非存在下でマウスマクロファージに結合します。 J774A.1細胞（PVC活性の以前の研究で使用された細胞株1、2、3）をFlagでタグ付けしたPVCに曝露し（図1dのように）、結合を免疫蛍光で評価しました。修飾されたPvc13を含むPVCは依然としてJ774A.1細胞の表面にクラスター化しており、この結合相互作用は図2aのヒト細胞の場合と同じようにPvc13によって媒介されなかったことを示しています。スケールバー、100μm。 e、マウスマクロファージにおけるPVC活性は、野生型pvc13の非存在下でも持続します。 (d) の結果を裏付けるように、切断または欠失 pvc13 を含む PVC は J774A.1 細胞において効率的な細胞毒性を示し、この細胞株における PVC 活性が尾繊維による特異的認識の結果ではないことを示しています。ただし、スパイク先端 (pvc10) を削除すると活性が失われ、それでも PVC がこれらの細胞に対して非特異的に活性である可能性があることが示唆されています。値は、n = 3 の生物学的複製での平均 ± SD です。統計的有意性は、ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析を使用して計算されました。 ****P < 0.0001; ns、重要ではありません。

ソースデータ

a、図4dのin vivo tdTomatoアッセイのフローサイトメトリーゲートスキーム。 b、PVCの頭蓋内注射後のマウス脳におけるPVC誘導tdTomato信号の時間経過（図4dと同様）。ニューロン内の TdTomato シグナルは、注射後 t = 3 ～ 7 日で増加し始めました。 c、PVC は、インビトロで一次ニューロンを標的にすることができます。ほぼ完全な細胞死 (97%) が観察され、Ad5 ノブ (RGD/PK7) を備えた PVC が in vitro でニューロンに対して強い指向性を示すことが示されました。 d、図4eの免疫原性アッセイにおける活性化T細胞および顆粒球の定量のためのフローサイトメトリーゲーティングスキーム。 e、ELISAによるPVCの頭蓋内注射後のCNSにおける炎症性サイトカインの定量化。試験したサイトカインの有意な濃縮は観察されず（t = 1、3、または 7 日）、PVC 注射がバックグラウンドを超えて CNS の局所炎症反応を刺激しないことを示しています。 f、PVC注射後の動物の体重の経時変化。体重の有意な減少は観察されず、PVC 注射がこれらの動物に重大な全身毒性を引き起こさない可能性が高いことを示しています。 g、インビトロでの一次ニューロンにおける非特異的細胞毒性の研究。 Cre を負荷した PVC (毒素を含む (c) の PVC とは対照的に) を培養初代ニューロンに添加し、t = 24 時間で細胞死についてテストしました。バックグラウンドを超えると有意な細胞死は観察されず、毒素ペイロードの非存在下ではこれらの粒子が細胞毒性を誘導しないことを示しています。すべての値（b、c、e – g）は平均±標準偏差であり、n = 3（b、e – g）またはn = 4（c）生物学的複製です。統計的有意性は、ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析 (c、g) または二元配置分散分析 (b、e) を使用して計算されました。 ****P < 0.0001; ns、重要ではありません。

ソースデータ

a、P. luminescens TT01 には、ゲノム上に 4 つの PVC 遺伝子座が並んで含まれており、各構造/付属領域 (青) のすぐ後に推定ペイロード遺伝子 (赤) が続きます。 b、P. luminescens TT01 PVC アレイ内の 4 つの PVC 遺伝子座の DNA 配列アラインメント。遺伝子座は重要な配列相同性を共有していますが、標的認識遺伝子 (pvc13) とペイロード領域で分岐しています。これは、これらの PVC がコア構造を共有しているものの、異なる生物をターゲットにしており、各ターゲットに異なるペイロードを配信していることを示唆しています。同一性パーセントは、n = 50 bp のスライディングウィンドウで表示されます。 c、P. luminescens TT01 PVC アレイ内の別々の PVC 遺伝子座によって共有される 2 つの推定ペイロード遺伝子の HHpred 予測ドメイン構成。両方の遺伝子は共通のドメイン (YenB/RHS2 関連毒素; E = 0.0000067/0.0000039) を共有していますが、両方の N 末端に未知の配列も含まれています。 PVCpnf ペイロード Pdp1 および Pnf が N 末端パッケージングドメインを介してロードされることを考えると (拡張データ図 3b-d)、これらの N 末端ドメインは、これらのタンパク質を PVC 複合体にロードするパッケージングドメインを表す可能性があります。 d、(c)からの推定ペイロードタンパク質のアミノ酸配列アラインメント。 2 つのペイロードは、機能ドメイン (YenB/RHS2 関連毒素) において重要な配列相同性を共有していますが、N 末端で分岐しています。これら 2 つのペイロードは、分岐した N 末端パッケージングドメインを介して P. luminescens TT01 内の異なる PVC 粒子に「分類」される可能性があります。同一性パーセントは、n = 5 aa のスライディングウィンドウで表示されます。 e, P. luminescens TT01 による多重タンパク質送達の提案されたモデル。この生物はおそらく 4 つの異なる PVC 粒子を生成し、それぞれが異なるペイロード (固有のパッケージングドメインを介して各粒子に分類される) と異なる標的装置 (pvc13) を持ち、複数の宿主生物 (または細胞型) 内で多様な生物学的活性をもたらすために分泌される可能性があります。 /ティッシュ）を同時に実行します。

この研究では、PVC が 1.) 多様な新規ペイロードを搭載して送達することで、標的細胞への新規生物活性の導入を可能にし、2.) 新規生物を標的として、ヒト細胞や生きた細胞の送達を可能にするように設計できることを実証しました。高い効率と特異性を備えたマウス。我々は、PVC は高度にプログラム可能な新しい種類のタンパク質送達デバイスを構成すると結論付けています。

補足図 1 および補足表 1 ～ 12。

補足表 7 にリストされているプラスミドの注釈付き配列ファイル。

精製された PVC サンプルの質量分析。

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転載と許可

Kreitz, J.、Friedrich, MJ、Guru, A. 他細菌収縮注射システムを使用したプログラム可能なタンパク質送達。 Nature 616、357–364 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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受信日: 2022 年 10 月 6 日

受理日: 2023 年 2 月 21 日

公開日: 2023 年 3 月 29 日

発行日: 2023 年 4 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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