写真顆粒の高分解能機能解析とコミュニティ構造

ISME Journal volume 17、pages 870–879 (2023)この記事を引用する

1013 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

光顆粒は、複雑な光合成生態系から形成される球状の集合体であり、「曝気不要」の廃水処理の可能性を秘めています。シーケンスバッチリアクターからの光顆粒を蛍光顕微鏡、16S/18S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンス、マイクロセンサー、安定同位体および放射性同位体のインキュベーションによって調査し、顆粒の組成、栄養素の分布、光、炭素、窒素の収支を決定しました。写真顆粒は生物学的および化学的に層状になっており、糸状シアノバクテリアが別個の層に配置され、他の生物が付着する足場を形成していました。酸素、硝酸塩、光勾配も検出可能でした。光合成活性と硝化はどちらも主に外側 500 μm に限定されていましたが、光合成は試験した酸素および栄養素 (アンモニウム、リン酸、酢酸) の濃度に比較的鈍感でしたが、硝化は非常に敏感でした。酸素は内部で循環され、光合成によって生成された酸素は好気呼吸と硝化によって急速に消費されました。酸素の生成と消費はバランスが取れていました。同様に、窒素は硝化と脱窒のペアによって循環され、炭素は光合成と呼吸によって交換されました。私たちの発見は、写真顆粒が複数のリンクされた栄養サイクルを備えた完全で複雑な生態系であることを強調しており、写真顆粒廃水処理における工学的決定に役立つでしょう。

廃水処理リアクターは、微生物群集の機能的特性を継続的に選択します。動作条件を操作することで、水を浄化するための変換プロセスや微生物バイオマスの自己凝集など、望ましい形質の選択が可能になります。リアクターの混合が停止されると高密度の凝集体は急速に沈むため、自己凝集（すなわち、生物顆粒、微生物の球状凝集体の形成）により層化（酸素ゾーンと無酸素ゾーン）が可能になり、バイオマスの回収が容易になります。一般に、生物顆粒は、液体滞留時間が微生物の倍加時間よりも短い反応器内で形成されます。これにより、浮遊細胞が洗い流され、バイオマス保持のための選択圧が生成されます [1、2]。生物顆粒内の凝集したバイオマスは物質移動抵抗を受けて細胞あたりの活性が低下しますが、効率的なバイオマス保持とそれに続くバイオマスの増加により、生物顆粒リアクターでの体積変換率が大幅に向上します。

光顆粒と呼ばれる光合成生物顆粒は、北海の光合成マットの培養物で最初に観察されました[3]。顆粒は糸状ラン藻、珪藻、従属栄養細菌で構成されていました。光合成群集では球形の幾何学形状はまれですが、自然界における光顆粒の例がいくつか報告されています。たとえば、シアノバクテリアとクリオコナイトと呼ばれる従属栄養細菌で構成される光顆粒が氷河で発見されています [4, 5]。緑色とピンク色の微生物の「ベリー」は、シアノバクテリアと珪藻の共生、硫黄酸化紫硫黄細菌と硫黄還元細菌の群集の共生によって形成された塩性湿地で見られます[6、7]。

自然界の光栄養性バイオフィルムでは、光顆粒と同様に、拡散限界により、さまざまな溶解化学種 (酸素、基質など) の濃度勾配が形成されます。同様に、光強度勾配は光の吸収と散乱によって形成されます [8]。これらの交差する勾配は、光独立栄養生物、化学独立栄養生物、従属栄養生物などの異なるニッチを満たし、好気性代謝と嫌気性代謝を示す多様な微生物の同時増殖をサポートできる多様な環境を作り出します[9]。これらの微生物グループ間の複雑な相互作用が起こり、それがコンソーシアムの機能を安定化させる可能性があります [10]。たとえば、従属栄養生物は、光合成生物によって分泌される細胞外有機化合物をもとに成長する可能性があります。後者は、従属栄養成長で生成される無機 CO2 を固定する可能性があります。硝化剤などの好気性化学独立栄養生物は、光合成によって強化された酸素レベルから恩恵を受けると同時に、無機炭素および窒素を求めて光合成栄養生物と競合する可能性がある。バイオフィルムとは異なり、光顆粒は自由に生きているため、そのバイオマスは容器の表面積に限定されません。さらに、球体の表面積と体積の比は、小さな球体の場合、同じ体積の平面内よりも高いバイオマスと水の交換能力があるようなものです。この関係は、球の半径が平面の厚さの 3 分の 1 未満である限り維持されます。

最近、廃水から窒素、リン、および炭素を除去および回収するために、選択圧を用いて光顆粒を培養した[11、12、13、14、15、16、17]。これには、バイオマスの沈降後の培地の定期的な交換が含まれ、したがって、急速に沈降する顆粒の形成に向けた選択圧力が生じた。この顆粒は実際に優れた沈降特性を示し、その場での光合成酸素生成により、硝化や呼吸などの酸素を必要とする微生物のプロセスが促進されました。これにより、処理プロセス内の O2 と CO2 のサイクルがリンクされ、「曝気フリー」の廃水処理に向けて前進しました。初期の研究では、廃水からの単一光顆粒の物理的構造と代謝機能が調査されましたが、焦点は光合成生物と酸素プロファイルに限定されていました [18、19、20]。モデリングアプローチは、写真顆粒内の微生物と細胞外高分子物質（EPS）の分布、およびさまざまな栄養素入力に基づいた化合物のバルクターンオーバーとリアクター機能を予測しましたが、実際の写真顆粒ではまだテストされていません[21、22]。

光顆粒は、反応器の運転中にさまざまな外部環境条件（つまり、光の強さ、栄養素濃度）と、微生物の活動や外部変動に応じて栄養勾配が生成および除去されるための内部条件の両方にさらされます。したがって、写真顆粒内の微生物の生態を完全に理解するには、生体内でのさまざまな条件下での詳細な研究が必要です。ここでは、顕微鏡イメージング、メタ分類学、マイクロセンサー、および放射性同位体標識および安定同位体標識とのインキュベーションを用いて、これらの同じ写真顆粒の物理的および生物学的層別と機能を研究しました。私たちの発見は、光顆粒内の機能活性（光合成、硝化、脱窒）の空間的および時間的分布と、それらの外部要因（光、栄養素）への依存性についての洞察を提供します。さらに、その結果は、写真粒状廃水処理における技術的決定をサポートするために使用できます。

光顆粒は、以前に記載されているようにバイオリアクターから得られました[12]（図S1）。バイオリアクターは、高さ 38 cm、直径 10 cm、底部の円錐の高さ 10 cm の気泡柱でした。作業容積は 1.6 L、コーンの底から 28 cm の位置にありました。混合は、5% v/v CO2 を豊富に含む空気を 500 mL min-1 の速度でガス供給することによって達成されました。外部ウォーターバスを使用して温度を35℃に維持し、1M HClまたは1M NaOHを自動添加することによりpHを6.8±0.1に維持した。バイオリアクターは、静定時間 5 分、水圧保持時間 (HRT) 0.67 日、および操作サイクル 12 時間のシーケンスバッチモードで操作されました。 12 時間の昼夜サイクルをシーケンスのバッチサイクルに重ねて、各バッチサイクルが 6 時間明所と 6 時間暗所にさらされるようにしました。バイオリアクターの片側に配置された温白色光 (4000 K) LED ランプ (Avago ASMT-MY22-NMP00、Broadcom Inc.、米国) は、表面で 500 μmol m-2 s-1 の入射光強度を提供していました。明期中のバイオリアクターの様子。各バッチサイクルの終了時に蠕動ポンプを介して混合液 114 ml を自動的に除去することにより、7 日間のスラッジ滞留時間 (SRT) が達成されました。流入液には、アンモニウムとして 100 mgN L-1 (7.1 mmolN L-1)、10 mgP L-1 (0.3 mmolP L-1)、および 200 mgCOD L-1 (酢酸ナトリウム 3.2 mmol L-1) が含まれていました。バイオリアクターは 299 日間運転されました。写真顆粒は安定運転期間中の 105、186、214、270、299 日目にバイオリアクターの混合相からサンプリングされ、直接分析されるか、後の顕微鏡検査のために 5% リン酸緩衝食塩水 (PBS) 中のパラホルムアルデヒド (PFA) で固定されました。分析。写真顆粒の幅は 0.4 ～ 5 mm、平均直径は 2.6 mm でした。幅 2 ～ 4 mm の写真顆粒を分析に使用しました。

実体顕微鏡 (Leica M205C、ドイツ) を使用して、白色光下で写真顆粒の全体と切片を視覚化しました。画像は、Leica Application Suite (LAS バージョン 4.13、ドイツ) を使用して取得されました。顆粒の三次元構造は、マルチチャンネル CLSM (Leica TCS SP5X、ドイツ) によって検査されました。正立顕微鏡とスーパー連続体光源を備えたシステムは、LAS-AF 2.4.1 ソフトウェアによって制御されました。画像データスタックは、25×NA 0.95および63×NA 1.2の水浸レンズを使用して記録されました。サンプルはスペーサーを使用してカバーウェルチャンバーに取り付けられました。この目的のために、写真顆粒を半分に切り、チャンバー内で染色し、次にチャンバーを水で満たし、カバースリップで閉じました。適切なレクチンを同定するために、すべての市販レクチンを使用してスクリーニングを実施した。 Staudt et al. によれば、複合糖質は蛍光レクチン結合分析 (FLBA) によって検出されました。そしてZippelとNeu [22, 23]。いくつかのレクチンをテストした後、Alexa-568 で標識された BAN レクチンがイメージング用に選択されました。 BAN はバナナ (Musa paradisiaca) 由来のレクチンで、d-マンノースおよび d-グルコースに対する単一炭水化物結合特異性を持っています [24]。蛍光色素 Syto9 を対比染色として使用し、核酸を視覚化しました。シアノバクテリアと真核藻類は、色素に基づいて識別されました [25、26]。画像データスタックを連続的に記録するための設定は次のとおりです。励起: 480、635 nm、および 565 nm、発光: 500 ～ 550 nm (Syto9)、585 ～ 650 nm (BAN-A568、フィコビリン)、650 ～ 720 nm (Chl) A)。画像はイメージングソフトウェア Fiji [27] で処理し、Photoshop (バージョン CS6) を使用して個々の画像データスタックをつなぎ合わせました。

微生物群集を評価するために DNA サンプルが採取されました。具体的には、採取した写真顆粒 15 mL をガラス/テフロン組織グラインダーでホモジナイズし、2 mL 微量遠心管 5 本に分注し、14.87 × 103 rcf で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄しました。細胞ペレットは、さらに処理するまで直ちに -80 °C で凍結しました。 200 mg の湿った細胞ペレットの DNA を、DNeasy PowerSoil Pro Isolation Kit (Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ) を製造業者のプロトコールに従って使用して、三重に抽出しました。 DNA の量と質は、NanoDrop One (ThermoFisher Scientific、米国) を使用して分光測光的に測定されました。 DNA サンプルは、配列決定のために Génome Québec (マギル大学、モントリオール、カリフォルニア州) に提出されました。 16S rRNA 遺伝子 V3/V4 可変領域は、プライマーペア 341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) および 805R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) を使用して増幅されました [28]。 18S rRNA 遺伝子 V4 可変領域は、プライマーペア 616*F (TTAAARVGYTCGTAGTYG) および 1132R (CCGTCAATTHCTTYAART) を使用して増幅されました [29]。プライマーの両方のセットは、Illumina アダプターのオーバーハングヌクレオチド配列を遺伝子特異的配列に追加するように変更されました。配列決定は、300 bp リード (v3 化学) の MiSeq システム (Illumina、米国) を使用して実行されました。プライマーは、cutadapt (バージョン 1.18) を使用して生の配列から削除されました [30]。得られた配列は、DADA2 プログラムでさらに処理されました [31]。配列の分類学的アラインメントは、SINA (https://www.arb-silva.de) を使用して SILVA データベース (リリース 138) に対して行われました。 16S および 18S データセットは、R パッケージ metagenomSeq バージョン 1.24.1 [32] の累積和スケーリング (CSS) 関数を使用して正規化されました。マイクロバイオームデータの分析は、R パッケージ phyloseq (バージョン 1.26.1) を使用して実行されました [33]。生の 16S および 18S rRNA 遺伝子配列データは、プロジェクト番号 PRJEB54633 で EBI データベースから入手できます。

写真顆粒を、小さなペトリ皿の上に取り付けたナイロンメッシュにガラス針で固定しました（図S2）。ペトリ皿を水道水に浸し（表S1）、示されているように酢酸塩、培地ストック、および硝酸塩で修正しました。酸素濃度は、電動マイクロマニピュレーターに取り付けられ、酸素飽和水と塩基性アスコルビン酸ナトリウム（無酸素ベースライン）で二点校正されたクラーク型酸素マイクロセンサー[34]を使用して測定されました。硝酸塩濃度は、硝酸塩希釈系列で校正された自社製造の硝酸塩 LIX 膜センサー (マックスプランク海洋微生物研究所、ブレーメン、ドイツ) を使用して測定されました [35]。光プロファイルは、USB4000 光ファイバー分光光度計 (Ocean Optics, USA) [37] に接続された、80 μm の球形先端を備えたスカラー放射照度光マイクロセンサー (Zensor、デンマーク) [36] で測定されました。プロファイルを収集するために、マイクロセンサーが顆粒に穴を開け、電動マイクロマニピュレーターによって段階的に推進されました。

マイクロセンサー測定から生成された酸素と硝酸塩のプロファイルを使用して、反応物質の正味の消費/生成速度は、顆粒を「シェル」に分離し、各シェルが測定間の距離の幅で、球状の幾何学的形状を仮定することによって計算されました。シェルの外側部分の点とシェルの内側部分の点の間の流束が計算され、シェルの表面積が乗算されました。

P は骨材のシェルあたりの変換率 (この論文では nmol/h で表されます)、D は拡散係数、dCr/dxr は位置 r における反応物の濃度勾配、r はシェル表面から半径方向の距離です。集合体の中心。総変換率は、体積に対して正規化された活性ではなく、総活性を表すため、すべてのシェルの活性を加算することによって得られました。体積率を算出するには、各シェルの生産率をそのシェルの体積で割ります。酸素に使用された拡散係数は 2000 μm2 s-1 (Bionumbers ID 104440) [38、39]、硝酸塩に使用された拡散係数は 1700 μm2 s-1 (Bionumbers ID 104439) [38、39] でした。

マイクロセンサーを設定された深さに配置し、5〜10秒間光を覆うことによって、個別の光合成速度が測定されました。酸素濃度の減少速度は、その深さでの光合成の速度に相当します。

写真顆粒は、示されているように、3 mM または 10 mM 重炭酸ナトリウムで補正し、8 mM アンモニウム、3 mM リン酸塩、および/または 3 mM 酢酸で補正した水道水中で、pH 6.5 の 5.9 mL ガラスバイアル中でヘッドスペースなしでインキュベートしました。バイアル当たり 3 ～ 4 個の写真顆粒があり、アンモニウムおよびリン酸塩とのインキュベーションを除き、条件ごとに 1 つのバイアルがあり、バイアルが 2 つありました。さらに、写真顆粒には約 60 kBq の 14C 重炭酸塩が提供されました。バイアルを常に回転させ、暗所（硝化実験）または明所（光合成、約250 μmol m-2 s-1）で室温で6時間インキュベートしました。インキュベーションは同時に実行されました。 600 μL の上清を除去し、それを 20% パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液に置き換えることによってインキュベーションを停止し、最終濃度 2% PFA を達成しました。対照に使用した写真顆粒（ブランク）は、最初に PFA 中で死滅させ、次にトレーサーに 6 時間曝露しました。

写真顆粒を 10 mM 炭酸緩衝液で 2 回洗浄して未反応の炭酸塩トレーサーを除去し、最適切断温度化合物 (OCT、ライカ) に一晩浸漬して包埋し、次に 1 ml プラスチックカップで -20 °C で凍結し、厚さ 20 μm のスライスに切片化しました。クライオミクロトームで。スライスをポリリジンスライド上に捕捉し、106 カウントが得られるまで放射能分布をラジオイメージャー (BioSpaceLab、パリ) で画像化しました。妥当な時間内に 106 カウントを取得できなかったため、ブランクを 12 時間カウントしました。次に、生成された画像を M3Vision (BioSpaceLab、パリ) で分析しました。顆粒全体の CO2 吸収量が得られ、その後 mm2 ごとに正規化され、次に骨材セクションの厚さで割られて体積率が得られます（図 S6 を参照）。

写真顆粒を、3 mM 重炭酸ナトリウムおよび 1 mM 15N アンモニウムまたは 1 mM 15N 硝酸塩で補正した水道水中の 6 mL 気密ガラスバイアル中でインキュベートし、ヘッドスペースなしで室温、暗所または示されている明所でインキュベートしました。 2 つの写真顆粒を各バイアルに、小さいものと大きいものを 1 つずつ入れました。条件ごとに 4 つの別々のバイアルを準備し、グループごとに 1 つのバイアル内の写真顆粒を 4 つの別々の時点 (約 0、2、4.5、および 5.5 時間のインキュベーション) で死滅させました。写真顆粒は 1:1 w/v ZnCl 溶液で死滅させました。タイムポイント 0 をブランクとして使用しました。

写真顆粒を死滅させた後、各バイアルに 2 mL のヘリウムヘッドスペースを作成しました。バイアルを激しく振盪し、5 日間平衡化させました。続いて、150 μL のヘッドスペースを IR-MS に注入し、15N-N2 を分析しました。注入は一連の周囲空気注入に対して校正され、過剰な 15N 窒素含有量の計算が可能になりました。合計過剰 15N は (過剰 29N2 + (2 × 過剰 30N2)) として計算されました。脱窒速度は、過剰な 15N 生成に線形方程式を当てはめることによって計算されました [40]。

硝酸塩と亜硝酸塩の合計である NOx は、酸性塩化バナジウムで NO に変換され、CLD 60 化学発光 NO/NOx 分析装置で測定されました [41]。 NOx 含有量は、硝酸塩の希釈系列に対して校正されました。次に、各時点での過剰な 15 N と NOx 濃度の合計に線形方程式を当てはめることによって、硝化率を決定しました。

写真顆粒は物理的に堅牢で、明確な層状構造を示しました (図 1)。滑走運動性を持つ糸状ラン藻（フィコビリンとChlA自家蛍光）は、他の微生物の足場として機能する複雑なネットワークを形成しました。光合成性生物と非光合成性生物の両方の緻密な殻（SYTO9 で染色）が顆粒の外側 300 ～ 500 μm を形成しました。この殻の下には、放射状に並んだ糸状シアノバクテリアのゾーンがあり、その後に高密度でごちゃ混ぜな中心がありました。球状真核藻類（Chl-a 自己蛍光）は、写真顆粒全体の微小コロニーに存在していました（図 S4）。複合糖質（レクチン染色で可視化）は、写真顆粒全体にわたって糸状シアノバクテリアを取り囲んでいました（図S4D）。複合糖質は、光合成生物および非光合成生物による細胞外高分子物質 (EPS) の排泄を示し、「接着剤」として機能して光顆粒の物理的構造に寄与することができます。この研究で使用した BAN レクチンは、d-グルコースおよび d-マンノース単糖構成要素を含む複合糖質を視覚化します。

写真顆粒断面の CLSM 画像。核酸染色 (緑)、フィコビリン (赤) と紫をもたらすクロロフィル A (青) のオーバーレイとしての糸状ラン藻の光色素、真核微細藻類のクロロフィル A (青)、複合糖質のレクチンシグナル (赤)。 CLSM 画像は、14 個の個別の画像をつなぎ合わせて構成されています。 CLSM 技術の制限により、写真顆粒の半分しかキャプチャできず、表現の目的で、画像は白い垂直線の上にミラーリングされました。 B 白色光下での写真顆粒の拡大写真。左の画像は写真顆粒の全体、右の画像は同じ写真顆粒の断面を示しています。 C 写真顆粒の中心から表面までの CLSM 断面の拡大図。断面は、(1) 中心、(2) 放射状に整列したフィラメント、および (3) シェルの 3 つの異なるゾーンに分割できます。

微生物群集は、運動性糸状ラン藻や真核藻類などの光合成生物と、非光合成生物の両方から構成されていました（図2A）。 16S rRNA 遺伝子配列は、シアノバクテリア門の光合成生物 (37%) とプロテアバクテリア綱の非光合成生物 (28%) に起因するアンプリコン配列変異体 (ASV) が大半を占めていました。最も豊富な 2 つの ASV は、相対存在量 15% のシアノバクテリア Leptolyngbya boryana と相対存在量 13% の Alkalinema pantanalense でした。硝化菌 Nitrosomonas sp.、Nitrobacter sp. およびニトロスピラ sp. 原核生物群集の約 2% を占めていたのに対し、好気性化学従属栄養生物および脱窒菌である Thauera sp. およびZoogloea sp. 相対的に豊富な量の 15% を占めました。 Anaerolineaceae 科と Caldilineaceae 科の厳密な嫌気性原核生物は合わせて ASV の 5% を占めており、光顆粒の一部が酸素欠乏状態であることを示唆しています。これは、次のセクションのマイクロセンシングによって実際に確認されます。 18S rRNA 遺伝子配列は、真核微細藻類 (58%)、真菌 (18%)、および原生生物 (2%) に起因すると考えられる ASV によって支配されていました (図 2B)。存在する真核藻類はクロレラ sp.でした。 (39%)、クロロコッカム sp. (13%)、ボトリオシャエレラ sp. (1%)、および Tetradesmus sp. (1%)。存在する真菌はトリコスポロン sp.でした。 (18%)。

相対的な存在量は門レベルで示されます。存在量が 1% 未満のすべての ASV はグループ化され、2 つの棒グラフに「存在量 < 1%」として表示されます。「NA」は門レベルで割り当てられていない ASV です。 A 16S データセットと B 18S データセット。

写真顆粒は可視光スペクトル全体の光を効果的に吸収しました (図 3)。深さ 600 μm 以内では、表面光の 90% が完全に吸収されました。深さ 0 μm での参照光強度と比較した場合、700 ～ 800 nm の範囲、特に深さ 100 および 200 μm でのスカラー放射照度の増加があり、光色素による蛍光、または色素によるほとんど吸収と組み合わされた高い光散乱を示唆しています。これらの帯域幅 [36、37]。

表面照度は約 250 μmol m-2 s-1 でした。

この光顆粒は、光合成による酸素生成と酸素消費の両方に対して高い能力を持っていました（図4A〜C）。酢酸塩の存在下では、酸素消費量が酸素生成量を上回り、たとえ光の下であっても、写真顆粒の大部分全体が酸素欠乏状態に陥った。酢酸塩の非存在下では、写真顆粒は全体的に酸素で飽和し（図4A）、酸素生成速度を深さで積分すると、最大酸素生成量は738 nmol-O2写真顆粒-1 h-1でした（式1）。酢酸塩の存在下では酸素濃度は低くなりましたが、光合成は低下せず、その結果、酢酸塩の非存在下と同等の炭素固定が得られました（図4E）。これは、光顆粒内で酸素が急速かつほぼ瞬時に循環しており、光合成による高い酸素生成にもかかわらず、アセテート曝露期間中は呼吸が酸素に制限されていることを示しています。写真顆粒内で光は急速に減衰するため（図3）、写真顆粒の内部でも光が制限されている可能性が高く、したがって写真顆粒内の光による炭素固定の大部分は外縁で発生します（図4D、 E)。それにもかかわらず、最も高い光合成速度は顆粒の表面から約200μm下であり（図4C）、顆粒の表面よりわずかに下に光合成細菌の密度が高いことを示す顕微鏡画像と一致しています（図S3およびS4）。直径 4 mm の写真顆粒を考慮すると、最大炭素固定速度 383 nmol-C photogranule-1 h-1 が計算されました (式 1)。

A 酸素プロファイルは、同じ写真顆粒の 3 つの異なる条件下で測定されました。未処理の水道水 (青い丸)、酢酸塩を含まないがアンモニウムを含む増殖培地 (黄色の四角)、および酢酸塩とアンモニウムを含む増殖培地 (ピンク色の三角形) です。 B 直径 4 mm の球状凝集体を仮定して、写真顆粒の各深さでの総酸素生成量。図 A のプロファイルから計算されます。 C アンモニウムを含むが酢酸塩を含まない媒体中での、6 つの異なる深さでの 5 ～ 8 秒の暗転後の酸素濃度の変化によって決定される瞬間的な酸素生成。棒は 3 ～ 4 回の測定の平均酸素生成量を表し、白丸はそれぞれの個別の測定値を表します。 DA 写真顆粒（酢酸塩とインキュベート）中の炭素固定による 14C の分布の代表的なマイクロラジオグラフ画像。白いスケールバーは1mmです。 E 未処理の水道水 (TW)、3 mM 酢酸塩で補正された水道水 (TW + Ac.)、8 mM NH4+ (TW + N)、3 mM PO43-、およびその両方で光の下でインキュベートされた写真顆粒の炭素固定。 8 mM NH4+ および 3 mM PO43-。炭素固定は、写真顆粒を 14C-CO2 とインキュベートし、マイクロラジオグラフで 14C 固定を測定することによって測定されました。炭素固定は、凝集体内の境界をマークする活性を使用して領域ごとに分離されました：写真顆粒の内部（青）、写真顆粒全体（紫）、および写真顆粒の外縁（黄色）。黒い点は、個々の写真顆粒の測定値を表します。これらの光にさらされたインキュベーションは、(A) に示されている暗所でのインキュベーションと同時に実行されました。グループ間に実質的な差がなかったため、3 mM および 10 mM 重炭酸塩でのインキュベーションの結果を組み合わせました。

写真顆粒内の炭素固定は、栄養素濃度の短期間の変化に鈍感でした（図4D）。炭素固定は、未処理の水道水、3 mM 酢酸塩を含む水道水、8 mM アンモニウムを含む水道水、3 mM リン酸塩を含む水道水、および 8 mM アンモニウムと 3 mM の両方を含む水道水中でインキュベートしたすべての写真顆粒で同様でした。 mM リン酸塩。これは、光合成によって促進される炭素固定速度が反応器バッチサイクルの明期全体にわたって一定であることを示しています。ただし、好気呼吸や硝化などの他の酸素消費プロセスの速度は、炭素供給量が変化するため大幅に変化します。

独立栄養性硝化は、アンモニウムおよび硝化阻害剤 ATU の有無にかかわらず、14C 標識炭酸塩と暗所でインキュベートすると、光顆粒の外縁 (0 ～ 500 μm) で主に発生しました (図 5B)。炭素固定は、アンモニウムを含むインキュベーションで最も高かった(0.9 nmol mm-3)が、アンモニアを含まないインキュベーションおよびATUを含むインキュベーションでは依然として検出可能な炭素固定が存在した。 ATU でインキュベートした写真顆粒 (0.3 nmol mm-3) と比較して、未処理の水道水でインキュベートした写真顆粒の炭素固定レベル (0.4 nmol mm-3) がわずかに高いことは、写真顆粒がいくらかの残留アンモニウムを貯蔵しているか、低濃度のアンモニウムを使用している可能性があることを示唆しています。水道水中に含まれるアンモニウム量（<0.03 mgNH4 L-1 または <1.66 μmol L-1）（表 S1）。死んだ写真顆粒（ブランク、0.06 nmol mm-3）と比較して、ATUでインキュベートした写真顆粒の炭素固定レベルが高いことは、写真顆粒に顕著なアナプレロティックな炭素固定（0.2 nmol mm-3）があることを示しています。

8 mM NH4+ でインキュベートした写真顆粒内の炭素固定による 14C の分布の代表的なマイクロラジオグラフ画像。 B 未処理の水道水 (TW)、8 mM NH4+ で補正した水道水 (TW + N)、8 mM NH4+ および硝化阻害剤 ATU (TW + ATU) で暗所でインキュベートした写真顆粒の炭素固定、およびトレーサー添加前のパラホルムアルデヒド (ブランク)。炭素固定は、写真顆粒を 14C-重炭酸塩とともにインキュベートし、マイクロラジオグラフィーによって 14C 固定を測定することによって測定しました。炭素固定は、凝集体内の境界をマークするアクティビティを使用して領域ごとに分離されました：写真顆粒の内部（青色）、写真顆粒全体（オレンジ色）、および写真顆粒の外縁（黄色）。 C 最初に NH4+ なし (オレンジ色) で光の中でインキュベートした同じ写真顆粒の硝酸塩 (丸) と酸素 (三角) 濃度の 3 つのマイクロプロファイルの平均。定常状態に達した後、次に 100 μM NH4+ あり (青色)。 D 半径 1800 μm の球状写真顆粒を仮定して、(B) のプロファイルから計算された各深さでの硝酸塩生成 (nmol h-1)。正の値は生産ゾーンを示し、負の値は消費ゾーンを示します。 E アンモニアを含む水道水における、6 つの異なる深さでの 5 ～ 8 秒の暗転後の酸素濃度の変化によって決定される瞬間的な酸素生成。棒は 3 ～ 4 回の測定の平均酸素生成量を表し、白三角はそれぞれの個別の測定値を表します。

明暗における硝酸塩濃度のプロファイルは、暗所の炭素固定分布によって予測された硝化の分布を部分的に裏付けています（図5B、C）。硝酸塩の絶対濃度は写真顆粒の中心でピークに達しますが（図 5B）、同じプロファイルから計算された硝酸塩生成の体積速度は、外縁に 2 つのピークがあり、中心では比較的安定した生成が見られます。これらのピークは、他の複数の写真顆粒でも同様に観察された、酸素濃度の低下と酸素消費量のピークに対応していました（図5C〜E）。硝酸塩の消費は、写真顆粒の中心ではなく、硝化ピークの間でピークに達しました。球を通る拡散束は、深さとともに変化する球の半径 (式 1) に依存することに注意してください。したがって、線形勾配は、平らなバイオフィルムの場合のように、システムが拡散によって制御されていることを示しません。プロファイルの解釈を助けるために、球と平面を通る拡散束によって制御される基準勾配が一緒にプロットされています（図S5）。各深さでの硝酸塩生成速度を合計すると、全体の硝酸塩生成速度は 93.7 nmol photogranule-1 h-1 (NH4+ あり) および 25.1 nmol photogranule-1 h-1 (NH4+ なし) であり、15N-NH4+ とよく一致しました。孵化。

写真顆粒内の窒素循環は、インキュベーション条件に応じて、酸素または炭素制限のいずれかでした（図6A、B）。酢酸塩の存在下では、酸素が存在しないため、光顆粒を暗所で15N-アンモニウムとともにインキュベートしても硝化は起こらなかった(図6A)。 15N-N2の生成によって示されるように、酢酸塩の存在下でいくらかの硝化が光の下で起こりました（黒い棒、図6A）が、正味の硝酸塩は10μMのバックグラウンド濃度から消費されました（白い棒、図6A）。。酢酸塩の非存在下では、特に光の下でインキュベートした場合（最大150 nmol-N光顆粒-1 h-1）、硝化ははるかに高くなりました（図6B）。脱窒も酢酸塩の非存在下でより高かったが、酢酸塩の非存在下では写真顆粒は常に酸素であり、遊離有機炭素はほとんど存在しないはずである(図6A)。これは、写真顆粒内で顕著な炭素リサイクルが存在し、脱窒が酸素に対して耐性があることを示しています。それにもかかわらず、暗所で 15N-硝酸塩と酢酸塩を加えてインキュベートした写真顆粒の脱窒速度がはるかに高かったことからわかるように、酢酸塩の非存在下では脱窒は明らかに炭素制限されているか、酸素によって抑制されていました (最大 480 nmol-N 写真顆粒-1)。 h−1) (図6B)。

A 暗所または明所で、3 mM 酢酸塩を添加または添加せずに、1 mM 15N 標識アンモニウムとともにインキュベートした写真顆粒の硝化 (白色のバー) および脱窒 (黒色のバー)。速度は、異なるポイントで停止された 4 つの別々のバイアルにおける硝酸塩と亜硝酸塩、または 15N-N2 の生成の線形フィットです。硝化は、細胞外の硝酸塩と亜硝酸塩の生成速度に 15N-N2 の生成を加えたものを表します。脱窒は 15N-N2 の生成を意味します。エラーバーは傾きの標準誤差を示します。 B 暗所で酢酸塩とともに 15N-NO3- とインキュベートした写真顆粒の脱窒率。エラーバーは傾きの標準誤差を表します。

写真顆粒の層状パターンは、光合成微生物マットの層状パターンとよく似ていました (図 1)。運動性の糸状ラン藻（例、Alkalinema pantanalense、Leptolyngbya boryana、Cephalothrix komarekiana、Limnothrix sp.）と排泄された細胞外高分子物質（EPS）は、ラン藻のマットで観察されるものと同様の、構造的剛性を提供する複雑なフィラメントの網を生成した[42、43]。。バイオフィルム内の微生物群集の増殖は、EPS マトリックスに依存しています [44]。レクチン染色により、EPS マトリックス中の複合糖質の大部分が d-グルコースと d-マンノースに起因することが明らかになりました。グルコース成分は、糸状ラン藻が EPS マトリックスの複合糖質画分の主要な単糖であるため、糸状ラン藻によって生成された可能性があります [23、45、46]。グルコース含有多糖類（特にα(1-4) グルカン）とマンノース含有多糖類の両方が、好気性顆粒と光合成微生物マットの両方におけるバイオフィルムの凝集に重要な役割を果たしていることが示されている[47、48]。報告されているレクチン特異的 BAN 複合糖質は、存在する全複合糖質の一部のみを示しています。それにもかかわらず、細胞外タンパク質や eDNA など、他の種類の複合糖質やマトリックス化合物が存在すると予想されます [49]。

写真顆粒形成における糸状ラン藻の重要性は以前に強調されている[12、19、50]。当初は、糸状で運動性のシアノバクテリアが他の生物を宿らせることができる糸状体の核 (束) を形成していると考えられていました。成長するにつれて、この構造は物理的および生物学的にますます層化し、最終的には非常に多様な微環境とそれに関連する微生物プロセスを備えた写真顆粒になります。自然系および写真顆粒では、光と栄養素の利用可能性と勾配に従って物理的および生物学的な層別が発生します [8]。したがって、若くて小さな写真顆粒 (<0.5 mm) は明確な構造を持っていませんが、数ミリメートルのサイズに成長した写真顆粒は明確な層構造を示します。また、大きな (>2.5 mm) 写真顆粒内で微生物の層状化が観察され、シアノバクテリアが表面近くに層を形成していることが観察された研究者もいます [19]。私たちの研究では、写真顆粒のサイズとは無関係に、糸状ラン藻が写真顆粒全体に存在することがわかりました。しかし、彼らは表面から中心までフィラメントの配置が異なっていることを示しました。シアノバクテリアのフィラメントは表面と中心では密集してごちゃ混ぜになっていましたが、その間の領域では放射状に整列していました。この現象の説明の 1 つは、フィラメントを放射状に配置すると、光への曝露量が多い領域 (走光性) と他の基質のレベルが高い領域 (走化性) の間の移動が容易になるため、光顆粒内の空間の競合です [43]。これは、光利用可能性が最も高い領域である光顆粒の最初の 500 μm にある非光合成生物の厚い殻を「貫通」するのに特に役立ちます。このような放射状の動きは、シアノバクテリア (Cephalotrix sp.、以前は Phormidium sp. として知られていた) 珪藻と北海由来の従属栄養細菌で構成される微生物マットの継代培養に由来する生物顆粒で以前に観察されました [3]。それらの動きは光と基質によって引き起こされることが示されました。

また、光顆粒は、自然界の光栄養性バイオフィルムと同様の機能的な層化を示しました。写真顆粒の表面は最高の光と基質レベルにさらされ、最高の光合成と硝化活性をサポートしました。酢酸塩の存在下では、写真顆粒には脱窒などの嫌気性プロセスが起こる無酸素ゾーンが存在します。微生物の活動の大部分は、写真顆粒の外側 500 μm に集中していました。その領域では、光栄養生物 (シアノバクテリアと真核藻類) がすべての入射光の約 90% を減衰し、約 400 ～ 500 μm (最大 100 nmol/h) で最も高い光合成活性を示しました。

さらに、写真顆粒の外側部分には高濃度のシアノバクテリアが存在し、硝化菌 (ニトロソモナス属、ニトロバクター属、ニトロスピラ属) や化学従属栄養細菌/脱窒菌 ( Thauera sp.およびZoogloea sp.）。この高い微生物密度は、炭素固定だけでなく、高い酸素生成/消費と硝酸塩生成をサポートしました (図 4 および 5)。しかし、14℃でのインキュベーションは暗所で行われたため硝化活性を過小評価している可能性があり（明るいところでは、光合成による炭素固定は硝化によるよりも桁違いに高いはずである、図4E、5B）、明るいところでは硝化がはるかに高かった（図4E、5B）。図6）。顆粒内の硝酸塩プロファイルは、顆粒の中心内での硝化を示しましたが、最も高い速度は顆粒の外縁 (ピーク ~200 μm) に限定されており (図 5D)、これは同様の硝酸塩よりもわずかに表面に近いです。サイズのクライオコナイト (ピーク ~400 μm) [5]。同様に、酢酸塩が存在せず、アンモニウムが存在する場合の酸素プロファイルも、顆粒の中心でいくらかの硝化（すなわち、酸素消費）が起こっていることを示していますが、やはり最も高い速度は顆粒の外側部分でした（図4Bおよび5D）。）。それにもかかわらず、プロファイルで観察された硝酸塩の蓄積（図5C）は、より低い深さでの硝化速度の増加によって引き起こされたのではなく、主に中心に向かう硝酸塩の消費速度の減少によるものでした。表面直下の硝化のピークも、DOC を使用せずに成長させた写真顆粒のモデルと一致しますが、アンモニウムのレベルはこの研究と同じです。 DOC がバルク液体中で急速に消費されることを考えると、モデル化されたシナリオの中で、このシナリオは私たちのデータに最もよく適合します [21]。

写真顆粒の中心は比較的不活性であるように見えましたが、重要な機能を果たしている可能性があります。これらには、基質の貯蔵（脂質、デンプン、EPS など）、発酵プロセス、または死んだ有機成分の分解が含まれ、これらはすべて写真顆粒内の内部栄養循環に寄与します。中心部の酸素濃度は低く、酸素耐性の低い微生物が隠れている可能性があります。 Anaerolineaceae や Caldilineaceae などの嫌気性原核生物や真菌 Trichosporon sp. 写真顆粒内で見出される物質は、炭水化物を発酵させ、EPS または壊死性バイオマスに含まれる有機リンと窒素を H2、アルコール (例: ブタノール、エタノール)、ケトン (例: アセトン)、PO43-、および NH4- に石化します。写真顆粒内で再利用できます [51、52、53]。シアノバクテリアは酸素欠乏条件にも適応しており、六炭糖（グルコースなど）を乳酸塩やエタノールなどに発酵させることができます[54]。このような内部栄養素循環は、光顆粒が大きくなるほど重要性が増し、外部基質の制限にもかかわらず代謝プロセスを促進する可能性があります。

光顆粒の光合成活性は、廃水バッチプロセスに典型的な短期間の栄養素の変動の影響を受けませんでしたが、他の微生物の活性は大幅に影響を受けました。私たちの結果と廃水反応器から収集されたデータを組み合わせることで、バッチサイクルの過程で発生する栄養制限と代謝プロセスの変化のタイムラインを構築することができました（図S9）。バッチの開始時には、アンモニウム (NH4+)、リン酸塩 (PO43-)、酢酸塩などの栄養素が高濃度で利用可能でした。この段階では、光顆粒は高い光合成活性と従属栄養活性を維持することができ、その結果、アンモニウム、リン酸塩、酢酸塩、二酸化炭素、酸素が消費され、酸素が生成されます。酢酸塩の好気呼吸によって生成される酸素濃度が低いため、この段階では限られた硝化のみが発生しました。この段階での微生物の急速な増殖により、アンモニウムとリンの取り込みが促進されました。酢酸塩濃度が減少し、酸素濃度が増加すると、硝化とその後の脱窒が始まりました。暗期では、光栄養生物は光合成から内部に蓄えられた光合成産物による呼吸に切り替わった。硝化剤は群集全体のわずか 2% しか占めなかったにもかかわらず、すべてのアンモニウムが硝酸塩に変換されるまで硝化は続きました。すべての酢酸塩はすでに消費されているため、脱窒は細胞内に貯蔵された炭素（たとえば、ポリヒドロキシアルカノエートなど）[55]または有機物の分解によって内部でリサイクルされた炭素によって促進されました[56]が、炭素制限のため、すべての硝酸塩を完全に除去することはできませんでした。

15N のインキュベーションは、脱窒が酸素条件下でも起こり得ることを示しました。したがって、脱窒は好気性脱窒菌であるタウエラ種によって部分的に行われた可能性があります。 [57]。さらに、インキュベーションは、酢酸塩の非存在下でも、内部循環有機炭素（例えば、光栄養生物からの有機炭素、または内部貯蔵およびリサイクル炭素）が脱窒を維持できることを示した（図6A）。暗所で酢酸塩を添加した場合の最大脱窒速度と比較して、内部循環炭素で維持される脱窒速度は約 25 分の 1 でした (図 6B)。それにもかかわらず、これらの速度は、暗期にバイオリアクターから窒素を除去し続けるのに十分でした。

写真顆粒がどのように構造され、機能するかについての基本的な知識があれば、エンジニアは廃水処理のためにこの新しいエコシステムを再現できるようになります。私たちの研究では、高い窒素と炭素の除去/変換率を示し、内部でリンクされたプロセス（酸素、窒素、二酸化炭素の交換）を示す、活性な光合成、硝化、脱窒コミュニティを調査しました。

廃水処理プロセスに光栄養性コミュニティを導入すると、最終的には従来の活性汚泥プロセスの CO2 と酸素のサイクルを終わらせることができます。酸素は光合成によって生成され、CO2 は有機物の従属栄養変換によって生成されるため、外部からの酸素供給は不要になります。凝集体における酸素の生成と消費は、それぞれ 13.6 mmol L-1 d-1 と 13.1 mmol L-1 d-1 と計算され (式 S1 ～ S4)、正味の酸素生成が得られました。光合成によって生成された酸素は消費プロセスによってすぐに使用され、全体として密接に関連したプロセスが示されています。酢酸塩がまだ存在するバッチサイクルの開始時、光顆粒は酸素が制限されており、光合成は最大速度を達成するのに十分な酸素を従属栄養呼吸と硝化に供給できませんでした（図4A）。これは、サイクルの最初の 4 時間の 1 時間あたりの酸素生成速度 1.1 mmol L-1 h-1 と酸素消費速度 1.4 mmol L-1 h-1 からも明らかでした (4 時間後の酢酸塩の完全除去を考慮すると)。サイクルと高い硝化活性）。酢酸塩が完全に消費されると、外部からの CO2 供給がなければ光合成は炭素制限される可能性があります。外部から酸素や CO2 の供給がないシステムで酸素需要と酸素生成を最適化するには、光供給と特定のアセテート負荷を変更することができます。これは、廃水特性 (N、P、COD) や光条件が変化する場合に特に重要になります。

前述したように、光の透過と栄養素の拡散制限により、ほとんどの活性は写真顆粒の端 (外側 500 μm) にありました。したがって、この研究で調査された写真顆粒（2〜4 mm）には、かなりの比較的不活性なゾーンが含まれており、個々の写真顆粒の全体的な変換率が低下しました。サイズが小さいほど、個々の写真顆粒ごとの変換率が最適化され、その結果、写真顆粒処理システムの最大変換率が増加する可能性があります。以前の研究では、理想的な顆粒サイズは、好気性顆粒では 1.25 ～ 1.5 mm [58、59]、光顆粒では 0.5 ～ 1.7 mm であると決定されました [19]。システムの光と炭素負荷は写真顆粒のサイズに影響しますが、固体保持時間 (SRT) が写真顆粒の年齢に上限を与えるため、最終的には写真顆粒のサイズを制御します。 SRT が短いと、顆粒が小さくなり、写真顆粒特有の変換率が高くなりますが、一部の成長の遅い生物 (硝化菌など) にとっては有害であり、顆粒のサイズが小さくなりすぎると (<0.5 mm)、写真顆粒の沈降性が損なわれる可能性があります [60]。したがって、顆粒サイズは、これらすべてのさまざまな側面を念頭に置いて慎重に評価する必要があります。

最後に、我々の結果は、硝化率をさらに高めるために反応器の運転条件を変更する必要があることを示しています。硝化は酸素の利用可能性によって強く制御され、その速度は暗所よりも明所の方が 3 ～ 4 倍高かった（図 6A）。酢酸塩の存在下では、この条件下では写真顆粒全体が無酸素状態であったため、硝化は完全に阻害されると予想される。それにもかかわらず、反応器の運転中、バッチが明サイクルで開始した場合と暗サイクルで開始した場合の両方で、光顆粒は常に上清からアンモニウムを完全に除去しました。酢酸塩の消費には約4時間かかるため（図S8）、最適な硝化の条件は、明期から始まるサイクルで約2時間しか利用できません。対照的に、すべての酢酸塩を消費する暗相で始まるサイクルでは、硝化は丸 6 時間最適化されます。これは、暗期から始まるサイクルに未使用の硝化能力がかなりあることを示しています。反応器の活性を高めるために、この時点で反応器の液体の追加の部分交換がサポートされる可能性があります。これにより、ほとんどの硝酸塩は酢酸塩の除去後に生成されるため、炭素が制限される変換された硝酸塩のより多くの脱窒も可能になります（図6B、S8）。別の選択肢は、外部炭素源（メタノール、酢酸塩、糖蜜など）をパルスして炭素制限脱窒を促進することであり、これは従来の廃水処理プラントでは一般的な方法である[61]。

写真顆粒には、わずか数立方ミリメートルの中に完全な生態系が含まれています。運動性の糸状ラン藻と EPS の足場は、硝化、脱窒、光合成、好気呼吸、リン酸塩の取り込みが可能なさまざまな光栄養生物と従属栄養生物をサポートしています。この多様なコミュニティは、廃水処理において重要な少なくとも 3 つの栄養素、酸素、窒素、炭素を内部で循環させています。光合成による酸素は、それぞれ酢酸塩またはアンモニウムの存在下での好気呼吸と硝化によって直ちに消費されます。硝化剤はアンモニウムを硝酸塩と亜硝酸塩に変換し、その後急速に脱窒します。光合成によって固定された有機炭素は、酢酸塩が枯渇した後の脱窒の燃料として使用されます。写真顆粒内の状態は時間の経過とともに、完全な無酸素状態から飽和の 3 倍を超える酸素濃度まで劇的に変化し、硝酸塩と有機炭素の利用可能性はさらに大きく変化します。それにもかかわらず、光顆粒は、栄養素を交換する相互接続された細胞の密なネットワークによってサポートされ、高く堅牢な活性レベルを維持します。この緻密なネットワークと栄養素の交換により、外部有機炭素の不在下での脱窒、外部アンモニウムの供給なしでの少量の硝化、およびほぼ無酸素条件下での硝化が可能になります。したがって、光顆粒は、太陽エネルギーを利用して廃水を浄化し、処理反応器の曝気の必要性を削減または排除することにより、従来の廃水処理のエネルギー要件を削減する機会を提供します。

生の 16S および 18S rRNA 遺伝子配列データは、プロジェクト番号 PRJEB54633 で EBI データベースから入手できます。この研究の結果を裏付けるその他のデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、共焦点レーザー走査型顕微鏡での優れたサポートに対してマクデブルク大学の Ute Kuhlicke 氏、マイクロセンサーの製造と支援に対してブレーメンの MPI のマイクロセンサーグループの技術者、そして 15N インキュベーションの支援に対して Elisa Merz に感謝したいと思います。測定。この研究は、助成金番号 STW-15424 の下でオランダ技術財団 (STW) によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Lukas M. Trebuch、Olivia M. Bourceau。

オランダ生態学研究所（NIOO-KNAW）水生生態学部、Droevendaalsesteeg 10、6708 PB、ヴァーヘニンゲン、オランダ

ルーカス M. トレブッフ、スタイン MF ヴァッセン、タニア V. フェルナンデス

バイオプロセス工学、AlgaePARC Wageningen University、私書箱 16、6700 AA、ヴァーヘニンゲン、オランダ

ルーカス M. トレブッフ、シュタイン MF ヴァッセン、マルセルヤンセン、ルネ H. ワイフェルス

マイクロセンサー研究グループ、マックス・プランク海洋微生物研究所、Celiusstrasse 1、28359、ブレーメン、ドイツ

オリヴィア・M・ブルソーとビールのダーク

界面微生物学、河川生態学部門、ヘルムホルツ環境研究センター - UFZ、Brueckstrasse 3A、39114、マクデブルク、ドイツ

トーマス・R・ノイ

陸生生態学部、オランダ生態学研究所 (NIOO-KNAW)、Droevendaalsesteeg 10、6708 PB、ヴァーヘニンゲン、オランダ

ルイーズEM獣医

ノルド大学生物科学および水産養殖学部、N-8049、ボードー、ノルウェー

ルネ・H・ワイフェルズ

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LMT: 概念化、方法論、調査、形式的分析、執筆 - 原案。 OMB: 概念化、方法論、調査、形式的分析、執筆 - 原案。 SMFV: 方法論、調査。 TRN: 方法論、調査、執筆 - レビューと編集。 MJ: 監修、概念化、執筆、レビュー、編集。 DB: 概念化、方法論、調査、執筆、レビューおよび編集。 RHW: 監修、執筆、レビュー、編集。 LMV：監修、資金調達、執筆、レビュー、編集。 TVF: 監修、コンセプト化、資金調達、執筆、レビュー、編集

ルーカス・M・トレバック氏への往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Trebuch、LM、Bourceau、OM、Vaessen、SMF 他。写真顆粒の高分解能機能解析とコミュニティ構造。 ISME J 17、870–879 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01394-0

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受信日: 2022 年 7 月 30 日

改訂日: 2023 年 2 月 28 日

受理日: 2023 年 3 月 3 日

発行日: 2023 年 3 月 30 日

発行日：2023年6月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01394-0

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