新型コロナウイルスの凝固能と細胞外小胞の統合オミクス

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22191 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

細胞外小胞 (EV) は細胞間のコミュニケーションに関与し、生理学的条件下での恒常性に貢献します。しかし、EV は、がん、敗血症、鎌状赤血球症、血栓性疾患などの幅広い病態生理学にも寄与する可能性があります。新型コロナウイルス感染症患者は、超高分子量 VWF 多量体、D ダイマー、および凝固促進性 EV の循環レベルの上昇と一致して、異常凝固のリスクが増加しています。 COVID-19 関連の止血における EV の役割は、起源の細胞、小胞積荷、サイズに依存する可能性がありますが、これは十分に定義されていません。我々は、COVID-19 (+) 患者血漿から分離された EV の凝固促進能がトロンビン生成アッセイによって定義できるのではないかという仮説を立てました。ここでは、入院中の新型コロナウイルス感染症 (+) 患者 (n = 21) と健康なドナー (n = 20) の血漿から小型 EV (SEV) と大型 EV (LEV) を分離しました。 EV は、フローサイトメトリー、透過型電子顕微鏡、ナノ粒子追跡分析、血漿トロンビン生成、および凝固能を定義するためのマルチオミクスアプローチによって特徴付けられました。これらのデータは、健康なドナーの血漿から分離された SEV および LEV と比較した場合、EV 代謝産物、脂質、タンパク質含有量の差異と一致していました。まとめると、トロンビン生成によって定義され、マルチオミクスによってサポートされる血漿凝固促進能に対するEVの効果は、新型コロナウイルス感染症では増強されます。さらに、この効果はEVのサイズとホスファチジルセリンの両方によって促進されることが観察されました。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) によって引き起こされるコロナウイルス感染症 (COVID-19) は、世界中で何百万人もの人々の生活に影響を与えています1,2。 COVID-19 肺炎と急性呼吸窮迫症候群は、炎症誘発性サイトカイン、好中球、血小板、内皮細胞の活性化、微小血管血栓症によって媒介される免疫血栓症の特徴と関連しています3。研究では、凝固障害と内皮機能不全が、新型コロナウイルス感染症における重要な病態生理学的事象であることが示唆されています3,4。フォンヴィレブランド因子 (VWF)、フィブリノーゲン、フィブリン分解産物 D ダイマーのレベルの上昇、プロトロンビン時間 (PT) の軽度延長、および血栓の安定性を示すトロンボエラストグラフィーデータはすべて、新型コロナウイルス感染症特異的凝固障害仮説を裏付けています 5,6 、7、8。トロンビン生成（TG）の増加とプラスミンの利用可能性の低下も、COVID-19 関連の血栓症と血栓溶解に重要な役割を果たしている可能性があります9、10、11。循環マーカーは、新型コロナウイルス感染症 (COVID-1912) における異常凝固の同定、診断、治療に重要です。さらに、細胞膜から脱落した小胞は疾患の指標または修飾因子として機能する可能性があり、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿内に小胞が蓄積すると、凝固リスクを高める潜在的な原因となります。

細胞外小胞（EV）は、ほとんどの種類の細胞によって放出される膜に囲まれた構造であり、小さな寸法と不均一性を特徴とします 13、14、15。それらは、サイズ（直径）によって、エクソソーム（30 ～ 150 nm）、微小胞（100 ～ 1000 nm）、およびアポトーシス小体（1000 ～ 3000 nm）の 3 つの主要なグループに分類されます16、17。小型EV（SEV、エクソソームサイズ範囲内の平均サイズを示す）は、管腔内小胞を含む多小胞体と原形質膜の融合によって放出される最小の小胞です。大型 EV (LEV、微小胞とも呼ばれる) は、原形質膜の外側の水疱形成によって脱落した小胞構造です。 EV は、血液や、唾液、尿、精液、母乳、喀痰、脳脊髄液、鼻液などの体液から回収されます 13,14。細胞外小胞は循環中に存在し、タンパク質、脂質、DNA、RNA、代謝産物などの細胞由来の生体分子を含み、これらはウイルス感染を含むさまざまな疾患の発症に関与する可能性があります 18,19。研究により、組織因子（TF）とホスファチジルセリン（PS）は主にLEVによって運ばれることが示されています。したがって、それらは EV の中で最も凝固促進性があります。 LEV は、PS 上でのテナーゼおよびプロトロンビナーゼ複合体の構築を促進し、その結果、凝固促進活性を媒介し、TG を促進します。

新型コロナウイルス感染症の進行に伴う広範なEV機能について説明されています。 EV は、SARS-CoV220 によって認識される重要なタンパク質であるアンジオテンシン変換酵素 2 を制御することにより、ウイルスの細胞侵入を媒介する可能性があることが示唆されています、21、22、23。さらに、in vitro 研究では、EV が SARS-CoV2 スパイクタンパク質を保有し、中和抗体のおとりとして機能する可能性があることが示唆されています 24。 COVID-19 (+) 患者の血漿からの EV の評価に対するいくつかのオミクス主導のアプローチでは、主に凝固および炎症に特異的なマーカーが同定されています 25、26、27、28、29。フローサイトメトリーアッセイは、それぞれ CD41 および CD31 表面マーカーの同定に基づいて、COVID-19 (+) 患者の血漿から血小板由来および内皮由来の EV の増加を特定します 30。 COVID-19 患者血漿由来の EV の表面上の TF の存在は、炎症性サイトカインの血清レベルの増加と相関していると報告されています 31。さらに、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者において TF 含有量と活性の両方を有する EV の増加が報告されており、FVIIa に結合して凝固を開始する能力が示唆されています 32,33,34。 EV の分画と特性評価は、凝固障害の一因となる分子積荷のサイズ依存の違いを示唆しています。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿由来の SEV と LEV は、両方の EV 集団の平均サイズと濃度が疾患の重症度に応じて循環内で増加し、より大きな EV では血栓形成因子の含有量がより多くなることを示しています 34。現在まで、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者では、PS に曝露された血小板由来の EV のみが報告されています 35。さらに、内皮トロンボモジュリン (TM) の減少とその循環レベルの増加は、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の生存率の低下に関連していると報告されています。しかし、新型コロナウイルス感染症のEVにおけるTMの存在と機能は不明です。

疾患中に生成されるEVの凝固促進性の性質と血栓症におけるそれらの役割を考慮して、我々は、新型コロナウイルス感染症（+）患者および健康なドナーからのSEVおよびLEVが、トロンビンによって開始される凝固に対して異なる効果を及ぼすであろうという仮説を立てた。さらに、入院中の新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から分離された循環小胞体のメタボローム、リピドーム、プロテオームが、その凝固障害の可能性を支える特徴を説明していることを示唆します。この目的を達成するために、我々は、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から SEV と LEV を分離し、それらを健康なドナーから分離した EV と比較しました。サイズ分布と EV マーカーは、フローサイトメトリー、ナノ粒子追跡分析 (NTA)、および透過型電子顕微鏡 (TEM) によって特徴付けられました。さらに、SEVとLEVの両方の代謝、脂質、タンパク質組成の包括的な分析を実行し、TGに対するそれらの影響を研究しました。

この研究はメリーランド大学治験審査委員会によって承認され（プロトコル番号：HP-00091732）、2003 年のヘルシンキ宣言に従って実施されました。登録されたすべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

血液サンプルは、入院時に同意した新型コロナウイルス感染症 (+) 患者 (n = 21) から採取されました。 COVID-19 の診断は、SARS-CoV-2 RT-PCR 検査陽性に基づいて行われました。年齢と性別が一致した健康なドナー (n = 20) からの乏血小板血漿は、Innovative Research, Inc. (米国ミシガン州ノビ) から入手しました。すべての患者データは、入院時および入院期間中のカルテベースのレビューから得られました。この研究に含まれる患者の人口統計を近似するために、健康なドナー血漿が得られました。

入院後最初の 24 時間以内に、すべての血液サンプル (4 mL) を COVID-19 (+) 患者からクエン酸ナトリウム (0.109 M、3.2%) バキュテナー採血管 (Becton Dickenson、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国) に採取しました。血小板の少ない血漿に処理されます。サンプルを800×gで10分間遠心分離してRBCを分離し、血漿を再び2500×gで10分間遠心分離し、得られた血漿を分析して、血液分析装置を使用して血小板の除去を確認しました（補足図S1）。次に、血漿を 300 ～ 500 µL ずつ複数のエッペンドルフチューブに分注し、EV の分離と分析のために凍結しました。健康なドナーの血液サンプルをクエン酸ナトリウムチューブに収集し、上記のように貧血小板血漿に処理し、500 μL アリコートとして凍結しました。凍結血漿の各アリコートは 1 回のみ使用され、他のアッセイで使用するために再凍結されませんでした。

プールされたヒト血小板欠乏血漿 (アフェレーシス由来クエン酸ナトリウム) を Innovative Research, Inc. (米国ミシガン州ノヴィ) から購入し、EV 除去血漿の調製に使用しました。血漿を3200×gで10分間遠心分離して残骸を除去し、部分的に精製した血漿を100,000×gで2時間超遠心分離した。透明な血漿を収集し、0.1 μm シリンジフィルター (Minisart、Sartorius Stedim Biotech、ドイツ、ゲッティンゲン) を使用してさらに滅菌濾過し、-80 °C で保存しました38。

サイズが 100 ～ 150 nm の EV は、本明細書では小細胞外小胞 (SEV) と呼ばれ、Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen Cat# 4484450、カリフォルニア、米国）、製造元のプロトコルに従っています。簡単に言うと、乏血小板血漿を2500×gで20分間遠心分離し、さらに10,000×gで20分間遠心分離した。エキソソーム単離試薬およびPBSを血漿サンプルに添加し、氷上で30分間インキュベートし、混合物を10,000×gで5分間遠心分離した。ペレットを0.1μm濾過PBSで10,000×gで5分間洗浄し、最後に適切な量の0.1μm濾過PBSに溶解した。

サイズが200〜600 nmの範囲のEVは、本明細書では大型細胞外小胞（LEV）と呼ばれ、同じ健康なドナーまたはCOVID-19（+）患者の血漿の追加のアリコートから単離されました。サンプルを1500×gで15分間遠心分離し、続いて3200×gで室温で15分間遠心分離して、より大きな細胞破片を沈降させ、無細胞血漿上清をLEV単離のために収集した。次に、収集した血漿を 20,000 xg、4 °C で 1 時間遠心分離し、上清を廃棄しました。 LEV ペレットを 1 mL の 0.1 μm 濾過 PBS で洗浄し、さらなる分析のために同じ緩衝液に再懸濁しました。

無傷の SEV および LEV を PBS に再懸濁し、トロンビン生成アッセイに使用しました。 SEV および LEV のタンパク質の定量は、メーカーの説明書に基づいて Micro BCA タンパク質アッセイ試薬キットを使用して実行されました (Thermo Scientific、Waltham、MA、USA)。簡単に説明すると、アッセイ試薬を混合して室温で 1 分間インキュベートし、続いてサンプルを添加して室温で 30 分間インキュベートし、シナジー HTX リーダー (BioTek 機器、Winooski、バーモント州、米国) を使用して 562 nm で読み取りました。一貫性を確認するために、分離された SEV および LEV のタンパク質定量も NanoDrop One 分光光度計 (Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して行われました。タンパク質の定量には、PBS をブランクとして使用し、280 nm でのサンプルの吸光度を使用しました。どちらの手法でも同様の値が得られたため、さらなる測定には NanoDrop が使用されました。

健康なドナー、COVID-19 (+) 患者からの血小板の少ない血漿、および EV 除去血漿、SEV および LEV 調製物のプール血漿中の残留血小板を、ABX Pentra 60 C+ 血液分析装置 (HORIBA Instruments Inc.、京都、日本) を使用して定量しました。簡単に言うと、さまざまな遠心分離ステップ後の 60 μL の血漿サンプルを分析に使用しました。 200 μg/mL の SEV および LEV を EV 除去血漿に添加し、測定に使用しました。さらに、フローサイトメトリーにより残存血小板を評価した。簡単に説明すると、健康な血漿、800 xg 上清、3200 xg 上清、および 10,000 xg 上清を、血小板のマーカーとして CD41 を使用するフローサイトメトリーによって分析しました (図 S1B)。

分離された SEV および LEV の流体力学的サイズは、Zetasizer (Nano ZS、Malvern Instruments、Malvern、UK) を使用した動的光散乱 (DLS) 原理によって決定されました。

新型コロナウイルス感染症 (+) 患者および健康なドナーのサンプルから分離された SEV および LEV を透過型電子顕微鏡 (TEM) によって評価し、そのサイズと形態を視覚化しました。簡単に説明すると、10 μL の SEV および LEV 懸濁液を Formvar/カーボンでコーティングされた 200 メッシュ銅グリッドに添加し、室温で 2 分間乾燥させ、余分な懸濁液を Whatman 濾紙で拭き取りました。次いで、サンプルをナノ純水で簡単に洗浄し、２％酢酸ウラニル水溶液（１０μＬ）で２分間染色した。染色された SEV および LEV は、透過型電子顕微鏡 (日立 HT7800、東京 (本社) 日本) を使用して 60 kV の加速電圧で観察されました。

以下の抗体リストがフローサイトメトリー分析および TG アッセイで使用されました: Alexa Fluor 647 結合抗 CD63 (クローン: H5C6、カタログ番号 353015)、BV421 結合抗 CD41 (クローン: HIP8、カタログ番号 303729)、PE dazzle 594結合型抗 CD235a (クローン: HI264、カタログ番号 349119)、BV605 結合型抗 CD31 (クローン: WM59、カタログ番号 303121)、および PE 結合型抗 CD62P (クローン: AK4、カタログ番号 304905)、Percp/シアニン5.5アネキシン V (カタログ番号 640935)、精製抗ヒト CD142 (クローン: NY2、カタログ番号 365202)、精製抗ヒト CD141 (トロンボモジュリン) 抗体 (クローン: M80、カタログ番号 344102)、精製抗ヒト CD41 抗体 (クローン) : HIP8、カタログ番号 303702)、精製抗ヒト CD235a (グリコホリン A) 抗体 (クローン: HI264、カタログ番号 349102)、精製抗ヒト CD31 抗体 (クローン: WM59、カタログ番号 303101) すべて Biolegend (サンディエゴ、 Alexa Fluor 488 結合抗 CD81 (カタログ番号 FAB4615G)、マウス IgG1 Alexa Fluor® 647 結合抗体 (カタログ番号 IC002R、アイソタイプコントロール)、マウス IgG2B Alexa Fluor® 488 結合アイソタイプコントロール (カタログ番号 IC0041G) ) 米国ミネアポリスの R&D Systems 製。

フローサイトメトリー分析を行って、表面マーカーに基づいて、精製されたSEVおよびLEVの細胞起源を血小板、赤血球、または内皮細胞由来として分類しました。 SEV および LEV を、Alexa Fluor 647 結合抗 CD63、Alexa Fluor 488 結合抗 CD81、BV421 結合抗 CD41、PE dazzle 594 結合抗 CD235a、BV605 結合の組み合わせを使用して、暗所、周囲温度で 45 分間染色しました。抗 CD31 および PE 結合抗 CD62P 抗体。抗体凝集によって引き起こされるアーチファクトを避けるために、インキュベーション前に抗体溶液を 4 °C で 17,000 xg で 10 分間遠心分離しました 38。インキュベーション後、SEV および LEV を 500 μL の粒子を含まない PBS に再懸濁し、分析しました。陰性対照には、緩衝液のみおよび未染色のSEVおよびLEVサンプルが含まれていました。バックグラウンドを決定するために、特定の抗体の単一染色を実行しました。各マーカーの発現はヒストグラムとして表され、モードに正規化されました。前方散乱線 (FSC) と側方散乱線 (SSC) は、SEV および LEV 集団をゲートするように設定されました。キャリブレーションは、フローサイトメトリーのサブミクロン粒子サイズ参照キット (0.1、0.2、0.5 μm、カタログ番号 F13839、ThermoFisher Scientific) を製造元の指示に従って使用して行いました。図S2Aに示すように、SEVゲートは100 nmおよび200 nmのビーズ雲を含む200 nmの粒子分布より上に設定され、LEVのゲートは他のすべてのビーズの分布を含む500 nmのビーズ集団より上に設定されました。界面活性剤溶解コントロールを実行して、無傷の EV シグナルの純度を確認しました。 SEV と LEV は両方とも、染色プロセス中に 0.25% TritonX-100 で処理されました (CD63) (図 S3A)。フローサイトメトリーの特徴付けのための対照実験は、バッファーコントロール、アイソタイプコントロール、およびEV特徴付けマーカー（CD63およびCD81）の単一染色を使用して実行されました（図S3B）。

細胞特異的 EV の真の発現を評価するために、ブロッキング (コールド阻害) 実験を実行しました。過剰な特異的未標識抗体（20X）を使用して、室温で30分間インキュベートしてEV表面上のエピトープをブロックし、その後、蛍光標識抗体とともに室温で30分間インキュベートし、単一染色サンプルと比較して分析しました（図S4））。すべてのサンプルは BD FACSAria フローサイトメーター (Becton Dickenson、バンクーバー BC、カナダ) を使用して評価され、取得されたデータは FlowJo 10.8.0 ソフトウェア (Becton Dickenson、バンクーバー BC、カナダ) を使用して分析されました。

SEV、LEV、および EDP タンパク質を RIPA バッファー (Millipore Sigma、米国マサチューセッツ州バーリントン) で抽出し、4 × Laemmli サンプルバッファー (BIO-RAD、Hercules、CA、米国) で 99 °C で 10 分間変性し、100 分間変性しました。 μg を 4% ～ 15% トリスグリシンゲル (Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels、BIO-RAD、Hercules、CA、USA) で定電圧 (100 V) で約 90 分間分離しました。タンパク質は、ウェットブロットモジュール（BIO-RAD、Hercules、CA、USA）を使用して、固定電圧（100 V）で 90 分間、PVDF メンブレン（Immobileon®-FL、Millipore Sigma、Burlington、CA、USA）に転写されました。メーカーの指示。次に膜を、0.1% Tween® 20 Detergent (TBST) を含む Tris 緩衝生理食塩水で 5 分間洗浄し、5% ウシ血清アルブミン (BSA; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で 1 時間ブロックしました。ウェスタンブロットは、1:1000 の希釈率のウサギ抗ヒト CD63 (CST-52090S) および CD81 (CST-52892S) (Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州ダンバーズ) を用いて実行されました。ヤギ抗ウサギ IRDye® 680RD 二次抗体 (LI-COR、リンカーン、ネブラスカ州、米国) を 1:5000 の希釈で使用しました。その後の視覚化は、Odyssey CLx Imager (LI-COR、リンカーン、ネブラスカ州、米国) を使用して取得されました。

TG は、当初 HC Hemker39 によって開発されたアッセイに修正を加えて実行されました。簡単に説明すると、濃度 (50、100、200 μg タンパク質/mL) 依存性の SEV および LEV 画分を 70 μL の EV 枯渇ヒト血小板貧血プール血漿 (EDP) とインキュベートしました。サンプルに緩衝液（150 mM NaCl、20 mM HEPES、pH 7.5）を補充し、トロンビン特異的基質である Z-Gly-Gly-Arg-AMC（Bachem、スイス、ブーベンドルフ）と最終濃度 3.08 mM で混合しました。キャリブレーション測定のために AMC 蛍光色素を追加しました。最終濃度 2 pM の組織因子 (Diagnostica Stago、パーシッパニー、ニュージャージー州、米国)、0.7 μg/mL の組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) (Sigma-Aldrich、セントルイス、 MO、米国）および 16 mM CaCl2。 TG 曲線の計算と分析は、前述のように実行されました 40,41。 TM およびアネキシン V の遮断実験は、10 μg/mL の抗ヒト CD141 (TM) 抗体および 0.1、0.5、2.5 μg/mL アネキシン V (Biolegend、サン州) とインキュベートした SEV および LEV 分離株 (100 μg タンパク質/mL) を使用して実施しました。米国カリフォルニア州ディエゴ）室温で 1 時間。 TGアッセイは上記のように実施した。

組織因子（TF）活性は、製造元のプロトコールをわずかに変更したヒト組織因子活性アッセイキット（ab108906、Abcam、ケンブリッジ、英国）を使用して測定しました。 200 μg タンパク質/mL SEV または LEV をアッセイ混合物とともに 4 °C で一晩インキュベートし、続いて 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 FXa の添加後、シナジー HTX リーダー (BioTek 機器、Winooski、バーモント州、米国) を使用して、37 °C で 1 時間、2 分ごとに基質の読み取り値を 405 nm で記録しました。アッセイの変更は、この研究の目的で混合物のインキュベーション期間を一晩に延長することに特有のものでした。

ハイスループットのメタボロミクス分析は、健康なドナーおよび新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から分離された SEV および LEV に対して実行されました。サンプルを氷上で解凍し、-20 °C のメタノール:アセトニトリル:水 (5:3:2 v/v/v) またはメタノールをそれぞれ 1:9 のサンプル:抽出溶液で各チューブに加えることにより、代謝産物または脂質を抽出しました。比 (v/v) を測定し、-20 °C で 20 分間静置し、4 °C で遠心分離します。 Q Exactive 質量分析計と組み合わせた UHPLC Vanquish を使用した超高速液体クロマトグラフィー (両方とも米国カリフォルニア州サンノゼの ThermoFisher Scientific Inc. 製) により、ネガティブとポジティブの両方を使用して、すべての抽出物を 2 回分析しました (各 20 µL 注入)。極性モード。各メソッドについて、UHPLC は Acquity HSS カラムを、リピドミクスの場合は 0.3 から 0.4 mL/min、または 0.325 から 0.4 mL/min に増加する流速で 17 分間または 15 分間使用し、あるいは、リピドミクスの場合は 450 μL/min の流速で使用しました。 Kinetex C18 カラム (150 × 2.1 mm、1.7 μm、Phenomenex、米国カリフォルニア州トーランス)

メタボロミクス/リピドミクスサンプルからのタンパク質ペレットを、製造業者の手順に従って、S-Trap フィルター (Protifi、ニューヨーク州ハンティントン) で消化しました。簡単に説明すると、最初に約 50 μg のタンパク質を 5% SDS と混合しました。サンプルを 10 mM ジチオスレイトールを用いて 55 °C で 30 分間還元し、室温まで冷却し、次に暗所で 25 mM ヨードアセトアミドを用いて 30 分間アルキル化しました。次いで、リン酸を最終濃度１．２％まで添加し、続いて６倍量の結合緩衝液（９０％メタノール；１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）；ｐＨ７．１）を添加した。穏やかに混合した後、タンパク質溶液をS-Trapフィルターにロードし、遠心分離し(2000×g; 1分間)、フロースルーを収集してフィルターに再ロードした。この工程を３回繰り返した後、フィルターを２００μＬの結合緩衝液で３回洗浄した。最後に、1 μg のシーケンシンググレードのトリプシンと 150 μL の消化バッファー (50 mM TEAB) をフィルターに添加し、47 °C で 1 時間消化しました。ペプチドを溶出するために、3 段階のバッファーを適用し、それぞれ 200 μL をもう 1 回繰り返しました。これらには、50 mM TEAB、0.2% ギ酸水溶液、50% アセトニトリルと 0.2% ギ酸水溶液が含まれます。ペプチド溶液をプールし、凍結乾燥し、0.1% ギ酸に再懸濁しました。

サンプル (各 200 ng) を個々の Evotip にロードして脱塩し、20 μL の 0.1% ギ酸で洗浄し、続いて 100 μL の保存溶媒 (0.1% ギ酸) を加えて分析まで Evotip を湿った状態に保ちました。 Evosep One システムは、timsTOF Pro 質量分析計 (Bruker Daltonics、ブレーメン、ドイツ) に接続されました。データは、timsTOF Pro 装置で 100 ms の蓄積時間とランプ時間を使用して、MS および MS/MS の 100 ～ 1700 の m/z 範囲にわたって収集されました。後処理は、PEAKS スタジオ (バージョン X+、Bioinformatics Solutions Inc.、ウォータールー、オンタリオ州) で実行されました。経路分析は、DAVID ソフトウェアおよび Ingenuity Pathway Analysis を使用して実行されました。

データのすべての統計分析とグラフ化は、GraphPad Prism ソフトウェア (バージョン 9.2.0) を使用して実行されました。グループ間の比較は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定を使用して分析されました。リピドミクスデータ分析は Maven (1.4.20-dev-772) を使用して実行され、記載されているように品質管理が維持されました 42。 LipidSearch (4.2.27) と Compound Discoverer (3.1.0.305) を連携して、対象外のデータ分析を実行しました。ヒートマップと相関データは MetaboAnalyst (5.0)44 によって生成されました。グラフは GraphPad Prism (9.2.0) を使用して作成されました。

新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の人口統計と併存疾患を表 1 に示します。重症度スコア、臨床検査値、入院前および院内の薬物療法を含む臨床特性を表 2 に示します。

まず、健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から分離された SEV と LEV の粒子サイズを決定しました。健康なドナーの平均SEVサイズは136.06±33.66nmであったのに対し、新型コロナウイルス感染症(+)患者から分離されたSEVは122.54±56.46nmでした。健康なドナーの平均 LEV サイズは 304.68 ± 67.53 nm であったのに対し、COVID-19 (+) 患者の平均 LEV 粒子サイズは 316.64 ± 136.64 nm でした。健康なドナーと新型コロナウイルス感染症（+）患者のSEVおよびLEVの粒子サイズ対強度パーセントのグラフをそれぞれ図1A、Bに示します。図 1C は、健康なドナーおよび COVID-19 (+) 患者由来の SEV および LEV の平均粒子サイズを表しています。 TEM 分析の代表的な画像を図 1D に示しますが、粒子のサイジングから得られたデータと一致する視覚的な違いが明らかです。ウェスタンブロッティング分析（図1E）では、健康なドナーSEV/LEVおよび新型コロナウイルス感染症（+）患者SEV/LEVのEV特異的テトラスパニンマーカー（CD63およびCD81）発現と、陰性対照としてのEDPが表示されました。

EV の特性: (A、B) 健康なドナー (A) および COVID-19 (+) 患者の粒子サイズと強度のパーセントのグラフ (B) SEV/LEV。 (C) n = 5 のサンプルサイズのグラフの平均が記載されています。 (D) 健康なドナーと COVID-19 (+) 患者の SEV および LEV の TEM 画像 (代表画像)。粒子サイズと TEM 分析には、健康な SEV と COVID-19 の SEV および LEV のそれぞれ n = 5 が使用されました。 (E) 健康なドナー SEV/LEV および COVID-19 (+) SEV/LEV の EV 特異的テトラスパニンマーカー (CD63 および CD81) および陰性対照としての EDP のウェスタンブロッティング分析。

次に、粒子サイジング技術を使用して行われた測定値を確認するために、SEV および LEV 粒子特異的マーカーのフローサイトメトリー分析を使用して EV の特性を評価しました。フローサイトメトリーのサブミクロン粒径参照キット（0.1、0.2、0.5 μm）を使用して、SEV および LEV 粒子のフローサイトメトリーゲートを作成し、図 S2A に示すように、定義されたゲートがすべてのサンプルに適用されました。 EV除去血漿（EDP）の純度は、プールされた正常血漿（PNP）と比較して、同じゲートを使用して決定されました（図S2B）。 EV 特異的テトラスパニンマーカーである CD63 および CD81 は、健康なドナーと COVID-19 (+) 患者の両方からの SEV および LEV で発現されました。ただし、分布をモードに正規化した後、CD63 と CD81 の両方の異なる発現が、COVID-19 (+) 患者の血漿分離 SEV および LEV で観察されました。図２Ａに示すように、ＳＥＶに対応するヒストグラムと比較すると、ＬＥＶヒストグラムには明らかな正のシフトがあった。このデータは、LEVの両方のマーカーの平均蛍光強度（MFI）が、健康なドナーサンプルと比較して、COVID-19（+）患者において有意に増加した（CD63、p = 0.001; CD81、p = 0.023）ことを示唆しています（図S5A、 B)。

EV のフローサイトメトリー分析: (A) 健康なドナー (左パネル) および COVID-19 (+) 患者 (右パネル) SEV および LEV における CD63、CD81、および CD62P マーカーの分布。 (B) 新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV と LEV 間の CD41、CD235a、CD31 分布の比較 (上パネル) (C) 健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV (中パネル) (D) 健康なドナーおよび COVID-19 (+) 患者の LEV (下のパネル)。 (E) COVID-19 (+) 患者の SEV と LEV (左のパネル) 健康な SEV と COVID-19 (+) 患者の SEV (中央のパネル)、健康なドナーと COVID-19 (+) 患者の LEV (右のパネル) の間のアネキシン V 染色）。健康な SEV と COVID-19 の SEV および LEV のそれぞれ n = 6 では、フローサイトメトリーによる特性評価が使用されました。

図2Aに示すように、活性化血小板マーカーであるp-セレクチンCD62Pは、SEVと比較して、COVID-19（+）患者のLEVにおいて有意に高い（p = 0.0007）ことが観察されました。ただし、健康なドナーの SEV と LEV の間には最小限の変化が観察されました。 CD41 のヒストグラムは、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の LEV が、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV および健康なドナーの LEV からのプラスのシフトを示していることを示しています (図 2B、D)。 COVID-19 (+) 患者の LEV は、健康なドナーの SEV (p = 0.0004) および LEV (p = 0.0006)、さらには COVID-19 の SEV (p = 0.00004) と比較して、CD41 (血小板) 発現 (MFI) が有意に高いことを示します。 (+) 患者血漿 (図 S5D)。同様の傾向が、CD235a (赤血球) および CD31 (内皮細胞) 陽性小胞の場合にも観察されました (図 2B)。逆に、健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV は、血小板、内皮細胞、赤血球にわたって同様の起源を示しました (図 2C)。赤血球（CD235a）および内皮（CD31）由来のLEV発現（MFI）も、健康なドナーとCOVID-19（+）患者の間で有意に異なりました（CD235a、p = 0.016; CD31、p = 0.020）（図S5E、F）しかし、CD41 集団の正のシフトはより明らかです (図 2D、S5D)。さらに、フローサイトメトリー分析は、ホスファチジルセリン（PS）が健康なドナーのLEVと比較して、新型コロナウイルス感染症（+）患者のLEVに豊富に存在することを示唆しています（p = 0.0131）。さらに、LEV 上の PS の曝露も、COVID-19 (+) 患者の血漿から分離された SEV 上の PS の曝露よりも大きい (p = 0.0143) (図 2E、S5G)。

TG に対する EV 分離株の効果を実証するために、SEV または LEV を 3 つの異なる濃度 (50、100、および 200 μg/mL) で EV 除去血漿中に再懸濁しました。現在までに、TG ラグタイムとピーク到達時間の測定値は、健康なドナー血漿から分離された EV の濃度が増加するにつれて減少することが報告されています 45。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から分離された SEV および LEV は、TG に対して用量依存的な効果を示さなかった。平均値の TG 曲線を図 3A ～ C に示し、すべてのデータの平均と標準偏差を図 3D ～ F に個別にプロットして、より明確に視覚的に解釈できるようにしています。健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿分離 SEV および LEV の両方が TG を誘導しました。ピーク速度とピーク高さの値は、以前に報告されているように TG 曲線の主要パラメータとして計算されました 40,41。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者から分離された LEV は、100 μg/mL (p = 0.0005) および 200 μg/mL (p = 0.0004) の濃度では著しく高いトロンビンのピーク高さを生成しますが、50 μg/mL (p = 0.6342) では生成しません。健康なドナーの血漿から単離されたLEVと比較した（図3G–I）。健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者から分離された血漿 SEV によって誘発される TG のピーク速度は、評価した濃度で有意な差はありませんでした (50 μg/mL p = 0.6153; 100 μg/mL p = 0.5562; 200 μg/mL) p = 0.9642)、図 3J–L に示すように。ただし、健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の LEV の間で観察された TG ピーク速度は、100 μg/mL と 200 μg/mL (100 μg/mL p = 0.0006; 200 μg/mL p = 0.0030) の濃度で 2 つの間の有意な差を示しています。図3K、Lに示すようなグループ。さらに、図3K、Lに示すように、新型コロナウイルス感染症（+）分離LEVによって生成されたトロンビンのピーク速度は、同じ患者から分離されたSEV（100μg/mL p = 0.0369; 200μg/mL p ≤ 0.0001）よりも大きかった。。興味深いことに、この違いは、健康なドナーの血漿から分離されたSEVとLEVの間では観察されませんでした（図3J-L）。

健康なEVおよび新型コロナウイルス感染症EVによって誘発されるトロンビン生成: (A-C) - さまざまな濃度のSEVおよびLEVの平均TG曲線: 50 μg/mL (A)、100 μg/mL (B)、200 μg/mL (C) ）。 (D – F) (50 μg/mL) (D)、100 μg/mL (E)、および 200 μg/mL (F) の経時的な平均トロンビン濃度 ± SD。各グループの下の線は、グループ内のすべてのサンプル間の平均 - SD を表し、上の線は平均 + SD を表します。 (G–I) 健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV および LEV のピーク身長値。 (J–L) 50 μg/mL (G、J)、100 μg/mL (H、K)、200 μg/mL (I、 L）。 50 µg/mL: 健康なドナー SEV (n = 19) LEV (n = 17)、COVID-19 (+) 患者 SEV (n = 19) および LEV (n = 19)。 100 µg/mL: 健康なドナー SEV (n = 13) LEV (n = 14)、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者 SEV (n = 12) および LEV (n = 14)。 200 µg/mL: 健康なドナー SEV (n = 19) LEV (n = 19)、COVID-19 (+) 患者 SEV (n = 15) および LEV (n = 13)、EDP (n = 7)。データポイントは個々の測定値を示し、p 値はグループ間の比較のための一元配置分散分析からのものです。 Ns、p > 0.05; *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001。

TM は内皮細胞表面の糖タンパク質で、トロンビンと複合体を形成し、その後プロテイン C を活性化して FVIIIa および FVa29 を不活化します。したがって、細胞表面に結合した TM はトロンビンの抗凝固作用を調節します。可溶性 TM は新型コロナウイルス感染症で増加し、内皮損傷の潜在的なマーカーとなります 46。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿における TM の潜在的な役割を調査するために、SEV と LEV を分離し、SEV と LEV 濃縮物の両方で TM を阻害する遮断実験を実施しました。図4A〜Cに示すように、健康なドナーもCOVID-19（+）患者の血漿分離SEVも、抗TMインキュベーション後のTGの変化は示されませんでした。逆に、健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿分離 LEV は両方とも、抗 TM 療法のインキュベーション後に TG ピーク速度を増加させ、この効果は他のすべての EV と比較して、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の LEV で有意に (p = 0.0269) 大きかった。図 4D ～ F に示すようなタイプです。

SEVおよびLEVの血栓形成性に対するトロンボモジュリンの影響。トロンボモジュリンを使用した場合と使用しない場合の、健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) SEV (A)、および LEV (D) の平均 TG 曲線。トロンボモジュリン抗体がある場合とない場合の、健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV (B、C) と LEV (E、F) のピークの高さと速度の値。これらの実験には 100 μg/mL の SEV および LEV を使用しました。健全な SEV (n = 13)、LEV (n = 14)、COVID-19 (+) SEV (n = 12)、LEV (n = 14)。データポイントは個々の測定値を示し、p 値はグループ間の比較のための一元配置分散分析からのものです。 ns、p > 0.05; *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001。

次に、PS 媒介 TG の効果を特異的に抑制するために、3 つの濃度 (0.1、0.5、2.5 μg/mL) のアネキシン V を使用して EV 表面ブロック実験を実行しました。健康なドナーおよび新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV および LEV をアネキシン V とプレインキュベートすると、用量依存的に TG が阻害されました (図 5A、B)。重要なことに、アネキシン V 濃度 0.1 および 0.5 μg/mL で、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 患者の LEV は、EDP および健康な LEV と比較して TG の増加を示しました (ピーク高さ: p < 0.0001; ピーク速度: 0.1 μg/mL、p < 0.0001)。健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿分離 SEV は、アネキシン V のどの濃度 (0.1、0.5、2.5 μg/mL) においても、EDP と比較して TG、ピーク高さ、およびピーク速度に有意な差を示さなかった(図5C、D）。対照的に、ピーク高さ (0.1 μg/mL および 0.5 μg/mL: p < 0.0001) とピーク速度 (0.1 μg/mL: p < 0.0001 および 0.5 μg/mL: p = 0.0129)、アネキシン V 濃度 0.1 および 0.5 μg/mL での TG 曲線 (図 5C、D)。 0.1 μg/mL アネキシン V では、ピーク高さと速度の両方が、健康な LEV と比較して、COVID-19 (+) 血漿 LEV で有意に増加しました (図 5C、D; p < 0.0001)。 0.1 μg/mL アネキシン V プレインキュベーションでは、COVID-19 (+) 患者の LEV は TG を示しましたが、健康なドナーの LEV は示しませんでした (図 5C、D)。これは、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿分離 LEV 上の表面にアクセス可能な PS が、ここで研究した患者サンプルにおける TG の主な原因の 1 つであることを示唆しています。

SEV/LEV 誘発トロンビン生成に対するアネキシン V の影響: 異なるアネキシン V 濃度での健康なドナーおよび COVID-19 (+) SEV (A) および LEV (B) の平均 TG 曲線。異なるアネキシン V 濃度の EDP、健康なドナー、および COVID-19 (+) 患者の SEV および LEV のピーク高さ (C)、ピーク速度 (D) の値。健全な SEV (n = 10)、LEV (n = 10)、COVID-19 (+) SEV (n = 9)、LEV (n = 9)。

TF の寄与を説明するために、我々は健康なドナーと COVID-19 (+) 患者の血漿から分離された SEV および LEV の TF を評価しました。私たちの分析は、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者と健康なドナーの血漿から分離された SEV または LEV の間で、TF 活性に差がなかったことを示唆しています (健康な SEV 対 COVID-19 SEV p = 0.8366、健康な LEV 対 COVID-19 LEV p = 0.3839)。 (図S6)。この観察は、さまざまな病態にわたるTF活性微粒子を示す研究とは対照的であるため、新型コロナウイルス感染症に特有のものである可能性がある。 SEVとLEVの両方のTF活性アッセイでは、COVID-19（+）患者と健康なドナーとの間に有意な差は示されませんでした（図S6）。

EV 集団の潜在的な違いをさらに理解するために、メタボロミクス (図 6)、リピドミクス (図 7)、プロテオミクス (図.8）。 SEV および LEV の結果は、補足表 1 に表形式で報告されます。

新型コロナウイルス感染症 (+) 患者および健康なドナーの SEV および LEV のメタボロミクス分析。対応のない両側 T 検定による最も重要な 25 の代謝物のボルケーノプロットとヒートマップを、LEV と SEV についてそれぞれ (A、B) と (C、D) に示します。ヒートマップは、フリーソフトウェア MetaboAnalyst 5.044 を使用して T 検定 (FDR 補正) により上位の有意な代謝物を表示することによって生成されました。

新型コロナウイルス感染症 (+) 患者および健康なドナーの SEV および LEV のリピドミクス分析。対応のない両側 T 検定による上位 50 の最も重要な脂質の火山プロット (脂質クラスごとに色分け)、棒プロット (脂質クラスごとに分類)、およびヒートマップが、LEV および SEV について (AC および DF) に表示されます。、それぞれ。ヒートマップは、フリーソフトウェア MetaboAnalyst 5.044 を使用して T 検定 (FDR 補正) により上位の有意な代謝物を表示することによって生成されました。

新型コロナウイルス感染症 (+) 患者および健康なドナーの SEV および LEV のプロテオミクス分析。健康なドナーと新型コロナウイルス感染症 (+) LEV および SEV のプロテオームの比較 (それぞれ A、C) と、新型コロナウイルス感染症 (+) の LEV および SEV の教師なし階層クラスタリング (それぞれ B、D)。ヒートマップは、フリーソフトウェア MetaboAnalyst 5.044 を使用して T 検定 (FDR 補正) により上位の有意な代謝物を表示することによって生成されました。

対応のない両側 T 検定による上位 25 の有意な代謝物のボルケーノプロットとヒートマップを、LEV と SEV についてそれぞれ図 6A ～ B、C ～ D に示します。新型コロナウイルス感染症 (+) LEV には、カルボン酸 (クエン酸、リンゴ酸)、糖 (グルコース)、抗酸化物質 (タウリン、アスコルビン酸)、アルギニン代謝物 (クレアチニン)、短鎖アシルカルニチン (C0、C2、C3) が豊富に含まれていましたが、中長鎖 (C14)、遊離飽和脂肪酸 (C12:0、C14:0、C16:0)、スフィンゴ脂質 (S1P)、胆汁酸 (グリコケノデオキシコール酸)、およびオキシリピン (5-HETE、15-HETE) は含まれません。。これらの特徴のほとんどは、特にアスコルビン酸、カルボン酸（クエン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシグルタル酸）、遊離またはアシル結合カルニチンなど、SEV でも再現されました。

基本的なメタボロミクス分析から検出できる脂質種の違いを考慮して、これらのサンプルのリピドームについて、ターゲットを絞らず、より包括的な分析を実行しました（図 7）。対応のない両側 T 検定による上位 50 位の最も重要な脂質の火山プロット (脂質クラスごとに色分け)、棒プロット (脂質クラスごとに分類)、およびヒートマップが、LEV および SEV について図 7A に示されています。それぞれC、D〜F。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の LEV と SEV はどちらも、リゾホファチジルエタノールアミン (LPE)、リホスファチジルコリン (LPC)、およびホスファチジルコリン (PC) のレベルが高いことが特徴でした。 SEV はまた、不飽和長鎖遊離脂肪酸のレベルが高く（メタボロミクスデータから拡大）、コレステリルエステル (ChE) のレベルが低いことも示しました (図 7E)。

すべてのオミクス解析の中で、COVID-19 (+) 患者と健康な対照からの LEV と SEV の間の最も顕著な違いは、プロテオームで観察されました (図 8)。補足図S7は、LEVおよびSEVサンプルの教師なし階層クラスタリングの結果（図8A、B）と、COVID-19のサンプルで最も有意に増加したタンパク質の上位50位のネットワークビュー（図S7）を示しています（+）血小板由来の凝固成分が豊富な患者。具体的には、VWF、F13A1 (第 XIII 因子 A サブユニット)、F13B (第 XIII 因子 B サブユニット)、FGA (フィブリノーゲンのアルファサブユニット)、FGB (フィブリノーゲンのベータ成分)、GP1BA (糖タンパク質 Ib-アルファ) はすべて凝固促進タンパク質であり、または、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者由来の LEV と SEV の両方に富む血小板由来の血小板。スペクトリン SPTA1 や SPTB など、これらのグループに豊富に含まれる他のタンパク質は、赤血球起源の成分を示唆しています。 SEVに特異的に、複数のケラチンおよびセリンプロテアーゼ阻害剤（SERPINC1、A6、ただしG1は除く）の減少がCOVID-19（+）患者で観察されました（図8C、D）。

オミックス分析を、COVID-19 (+) 患者由来のLEVおよびSEVの凝固促進活性の機能的読み取り値と結び付けるために、(Spearman)相関分析を実行しました(それぞれ図9A、B、200μg用量の場合)。結果によると、TG パラメーター (速度、ピーク高さ、ピーク速度) は相互に強い正の相関関係がある (LEV と SEV の両方で r ～ 1) 一方で、タンパク質成分、次に脂質が機能測定値と最も強い相関関係を示したことがわかりました。注目すべきことに、TG率と相関するいくつかの重要な（マージされた）オミクスがLEVでは同定されたが（図9A）、SEVでは同定されなかった（図9B）。これは前者のより高い凝固促進活性と一致している。いくつかのホスファチジルコリン（PC）、トリアシルグリセロール、コエンザイムQ9およびセラミド（Hex1Cer）は、LEVにおけるTG率と最も強い負の相関関係にあるパラメーターにランクされました（図9A）。同様に、複数のアミノ酸（アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン）およびタンパク質（TRIM61）は、LEVのTG率と負の相関を示しましたが（図9A）、タンパク質（特にANXA2、CLU、DSC1、PROC、DSG1）および脂質のみ（図9A）。スフィンゴシン）は、LEVにおけるTG率と有意な正の相関を示した（図9A）。 ANXA2 レベルは、LEV と SEV の両方で TG 率と正の相関がありました (図 9A、B)。

TG パラメーターとオミクス解析の相関スピアマン相関解析を実施して、COVID-19 (+) 患者の TG 率をオミクス解析と相関させました。 200 μg/mL の LEV (A) および SEV (B) データを使用しました。

この研究では、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者と健康なドナーの血漿から分離された SEV と LEV の血栓形成能を比較しました。我々の結果は、健康なドナーと比較して、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿 EV では EV 特異的マーカー CD63、CD81、CD62P と凝固促進剤 PS が豊富であることを示唆しています。われわれは、新型コロナウイルス感染症（+）患者の血漿LEVがTGを上昇させ、凝固障害と一致する代謝、脂質、タンパク質の相関関係を特定する能力の影響を初めて報告する。

EV は、COVID-19 感染を含むさまざまな病状の発症において重要な役割を果たしています 18,19。この研究では、SEVとLEVが、それぞれポリマーベースの試薬と連続遠心分離を使用して、新型コロナウイルス感染症(+)患者と健康なドナーの血漿から精製されました。フローサイトメトリーにより、健康なドナーや新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV と比較して、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の LEV では EV 特異的マーカー CD63、CD81、CD62P が豊富であることが確認されました。

当初、EV は凝固促進活性によって特徴付けられ、「血小板ダスト」と呼ばれていました 47。アニオン性リン脂質、特に PS への曝露は、EV の凝固促進活性に寄与する重要な要素です 48、49、50、51。無傷の血小板および血小板由来微粒子に対する PS 曝露は広く研究されており 48、赤血球 52,53 や内皮細胞 54,55 などの他の細胞型に対する PS 曝露に関する報告がいくつかあります。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者では、疾患の重症度に応じてさまざまなレベルの PS+ 血小板 EV が報告されています 35,56。現在までに、COVID-19 (+) 患者の全血のフローサイトメトリー評価を実施し、CD41 および CD31 特異的 EV のレベルの上昇を報告した 1 つの研究を知っています 30。アネキシン V で SEV および LEV 表面 PS をブロックするために行われた実験では、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から分離された LEV によって引き起こされる PS 媒介の TG ピーク高さと速度の増加が確認されました。これは、PS が新型コロナウイルス感染症における LEV 媒介異常凝固の重要な原因であることを示唆しています。逆に、TM は抗凝固において重要な役割を果たし、トロンビン結合後のプロテイン C (LEV の TG 速度と正の相関) 活性化の触媒作用を媒介するように作用します。通常、TM は内皮と密接に関連していますが、おそらくこの疾患に伴うびまん性内皮損傷により、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の循環血漿中で増加していることが報告されています。ここで我々は、健康なドナーからのLEVと比較して、新型コロナウイルス感染症(+)患者の血漿分離LEVにおいてTMブロック後のTGがより大きいことを観察し、これは内皮からのTMの損失を示している。

新型コロナウイルス感染症 (+) 患者および健康なドナーから採取した SEV および LEV のトロンビン媒介凝固促進活性のアッセイ測定を理解するために、同じサンプルに対してメタボロミクス、リピドミクス、およびプロテオミクスを組み合わせた分析も実行しました。結果は、両方のグループの SEV および LEV で血小板由来タンパク質が豊富であることを確認し、EV の一部は赤血球由来である可能性があります。さらにプロテオーム解析を行ったところ、VWF、F13A1（第XIII因子Aサブユニット）、F13B（第XIII因子Bサブユニット）、FGA（フィブリノーゲンのαサブユニット）、FGB（フィブリノーゲンのβ成分）、GP1BA（糖タンパク質Ib-α）はすべて凝固促進タンパク質であることが明らかになった。および/または新型コロナウイルス感染症 (+) 患者由来の LEV と SEV の両方が豊富に含まれる血小板由来のもの。注目すべきことに、アネキシン 2 (ANXA2) のレベルと TG 速度の間に正の相関関係が LEV と SEV の両方で観察され、これは脂質分離と膜出芽におけるこの末梢膜結合タンパク質の役割と一致しています 57。これらの結果は、新型コロナウイルス感染症(+)患者の血清58と赤血球に関する以前のオミクス研究と一致しており、それを拡張したものであり、後者は、赤血球膜への酸化的損傷が血球由来のタンパク質成分と複合脂質の小胞化を促進した可能性が高いことを示している疾患の重症度の関数として59。オミクス分析では、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の LEV のリピドームの有意な変化も確認され、これにはいくつかのリン脂質クラス (PC、LPC、LPE、PE が上位にランクされ、他の TG パラメーターと相関している) が豊富であることが判明しました。中性脂質、例えばトリアシルグリセロール）。注目すべきことに、LEVのリピドミクス分析では、脂質レベル（特にトリアシルグリセロールとセラミド）とTGパラメータの間に有意な負の相関関係が示された一方、LEVにおけるより高いPS曝露（レベルではない）はそれに正の相関を示した。この観察は、リピドーム組成と区画化の組み合わせが、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者由来の LEV の凝固促進効果に寄与していること、および PS が LEV 表面により多く外部化されていることを示唆しています。予想外なことに、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者のEVではオキシリピンのレベルが低いことが観察されました。オキシリピンは哺乳類の赤血球に豊富に含まれる代謝物で、脾臓隔離や血管外溶血を起こす赤血球の傾向と負の相関関係があります60。現段階では推測の域を出ないが、この発見は、プロテオミクスの結果とフローサイトメトリーのデータと組み合わせると、健康なドナーと比較して、新型コロナウイルス感染症（+）患者の循環血液中のEV濃度の赤血球成分が少ないことを示唆している。 IL-6レベルと既存の状態（例：、肥満）11． EV は血管損傷のマーカーとして機能するだけでなく、血栓形成の病因にも重要な役割を果たしており、いくつかの疾患状態で TG を増加させることが報告されています 61。この研究では、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の SEV と比較し、また健康なドナーの血漿分離 SEV および LEV と比較して、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿分離 LEV の添加によって誘発される TG パラメーターの有意な増加が観察されました。この研究における、COVID-19 (+) 患者の血漿蓄積 EV の LEV 画分に関連する TG は、入院時および入院時の急性疾患患者の血漿と比較して、COVID-19 (+) 患者における TG の増加の観察を裏付けています62。

この研究には次のようないくつかの制限があります。確認された COVID-19 (+) 患者からのすべてのサンプルは入院後 1 ～ 3 日以内に採取されたため、SEV と LEV の両方の積荷や、入院期間中に一時的なサンプルが変化する可能性があります。進行性疾患の評価は得られなかった。さらに、このデータは、新型コロナウイルス感染症 (+) と健康なドナーの血漿サンプルの両方について、小規模なグループサイズ (n ≤ 21) から得られており、新型コロナウイルス感染症 (+) の患者集団は、広範囲にわたる既存の健康状態と、 SEV および LEV の構成に影響を与えた可能性のある入院前の投薬。この研究では、少量 (4 mL) の採血に限定されていたため、ポリマーベースの SEV 分離が主要な選択肢となりました。さらに、健康なドナーおよび新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の採血に使用されるチューブにトウモロコシトリプシン阻害剤 (CTI) を添加することは、物流上不可能でした。限界を考慮すると、アネキシン V の濃度依存実験とリピドミクス分析は、LEV-PS が COVID-19 (+) 患者の血漿における TG の重要な修飾因子であることを明確に示しています。 LEVと凝固因子の相互作用とTGにおける凝固因子の役割を決定するには、さらなる研究が行われる必要があり、これは他の疾患状態にも関連します。

結論として、この研究は、TG の誘導における COVID-19 (+) 患者の血漿から分離された SEV および LEV の役割を報告した最初の研究です。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿由来 LEV は、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿中の血小板、赤血球、および内皮細胞由来であることが判明した。累積 LEV 集団に対する注目すべき凝血促進因子は PS でした。そして、このリン脂質のキャッピングは、LEV誘発TGを効果的に減少させた。新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿から分離された EV の表面に機能的な TM が存在することは、内皮からの TM の損失による微小血管凝固のリスクが増大することを示唆しています。他の新しい発見により、LEV の血小板が豊富な成分と一致する VWF、F13A1、F13B、FGA、FGB、GP1BA が特定されました。さらに、新型コロナウイルス感染症 (+) 患者の血漿由来 LEV のオミクスシグネチャは、止血リスクの既知の要素を伴う新型コロナウイルス感染症およびその他の急性および慢性疾患における早期血栓形成リスクを定義するための単純な TG アッセイの有用性を示唆しています。

現在の研究中に使用および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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この研究は、R01HL146442 (AD'A)、R01HL149714 (AD'A)、R21HL150032 (AD'A) および R01HL156526 (PWB)、R01HL159862 (PWB)、R01HL158076 (PWB)、R01HL161004 (PWB)、R01HL16 からの資金によって支援されました。 2120 (PWB) National Heart, Lung, and Blood Institute から、および National Institute of General Medical Sciences からの資金、RM1GM131968 (AD'A)。 TEM 画像の作成にご協力いただいたメリーランド大学ボルチモア郡キース R. ポーター画像施設所長の Tagide deCarvalho 博士に感謝いたします。

Saini Setua と Kiruphagaran Thangaraju の著者も同様に貢献しました。

この作品は、アンジェロ・ダレッサンドロとポール・W・ビューラーの二人が共同で監修しました。

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サイニセトゥア、キルファガランタンガラジュ、デレク R. ラム、トリボイヤー、トビロウデン、アランドクター & ポール W. ビューラー

生化学および分子遺伝学科、コロラド大学デンバーアンシュッツメディカルキャンパス、12801 East 17th Ave.、オーロラ、コロラド州、80045、米国

モニカ・ジェシアトコウスカ、レベッカ・B・ウィルカーソン、トラヴィス・ネムコフ、アンジェロ・ダレッサンドロ

メリーランド大学医学部ヒトウイルス学研究所、ウイルス学、病因および癌部門、米国メリーランド州ボルチモア

Yutaka Tagaya

メリーランド大学医学部病理学部、ボルチモア、メリーランド州、21201、米国

ポール・W・ビューラー

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SS、KT、MD、RBW、TN、DRL、YT、TB、TR、AD、A.D'A.、PWB は、研究の計画と設計、およびデータの分析と解釈に貢献しました。 SS、KT、A.D'A. そしてPWBが原稿を起草した。すべての著者は内容に関して原稿を批判的に修正し、最終版を承認しました。

アンジェロ・ダレッサンドロまたはポール・W・ビューラーへの通信。

AD と TN は Omix Technologies Inc の創設者であり、AD は Hemanext Inc と Macopharma Inc の科学諮問委員会のメンバーです。他の著者には宣言すべき競合する利害関係はありません。

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転載と許可

Setua、S.、Thangaraju、K.、Dzieciatkowska、M. 他。 COVID-19 陽性患者の血漿からの細胞外小胞の凝固能と統合オミクス。 Sci Rep 12、22191 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26473-8

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受信日: 2022 年 8 月 8 日

受理日: 2022 年 12 月 15 日

公開日: 2022 年 12 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26473-8

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