グルコース代謝の再配線により改善 5

Communications Biology volume 5、記事番号: 1159 (2022) この記事を引用

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15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

5-フルオロウラシル (5-FU) が結腸直腸癌 (CRC) における化学療法のバックボーンであるという事実にもかかわらず、患者の奏効率は 50% に限られています。 5-FU 毒性の根底にあるメカニズムについては議論があり、その有効性を改善するための戦略の開発が制限されています。ドライバー変異や表現型の不均一性など、がんの基本的な側面が 5-FU 応答にどのように関係しているのかは依然として不明のままです。これは主に、CRC の主要な特徴を再現できる前臨床モデルで実施される限られた数の研究に依存しています。ここでは、CRC のさまざまな段階を再現する患者由来のオルガノイドにおける 5-FU 応答を分析しました。われわれは、5-FU がピリミジンの不均衡を誘導し、それが p53 を欠損し活発に増殖しているがん細胞において DNA 損傷と細胞死を引き起こすことを発見した。重要なことに、p53 欠損は細胞周期停止の障害により細胞死につながります。さらに、KRASG12D解糖系腫瘍オルガノイドにおけるヴァールブルグ効果を標的とすることにより、ヌクレオチドプールがさらに変化することにより、そして重要なことに、非形質転換WT細胞に影響を与えることなく、5-FUの毒性が増強されることがわかった。したがって、p53 は 5-FU 応答を決定する重要な因子として浮上しており、複製ストレス誘発化学療法と組み合わせてがん代謝を標的にすることが CRC 治療の有望な戦略として浮上しています。

結腸直腸がん（CRC）は、世界中で 3 番目に多く診断されるがんの種類であり、がん関連死亡率の 2 番目の主な原因です1。現在のところ、初期段階の大腸がん患者または切除可能な転移のある患者に対する根治的治療法は依然として外科手術だけである。 CRC 患者はさらに補助化学療法を受け、切除不能な転移性 CRC 患者は完全に化学療法に頼っています2。 5-FU ベースの化学療法は腫瘍反応が悪く (率が最大 50%)3,4,5、無病生存期間を効果的に延長することはできません2,3,4,6,7 が、依然として大腸がんに対する最も一般的な治療法です。（8でレビュー済み）。さらに、5-FU療法がどの患者に有益であるかは依然として不明である。

5-FU の重要性にもかかわらず、その毒性の根本的なメカニズムについては依然として議論が続いています。細胞に取り込まれると、5-FU は活性フッ素化代謝物に変換されます。 5-FUTP と 5-FdUTP はそれぞれ RNA と DNA に組み込まれ、F-dUMP はチミジル酸シンターゼ (TS) を阻害し、デオキシヌクレオチドプールを損傷し、その結果 DNA の複製と修復を阻害します (参考文献 8、9 で概説)。これが患者でどのように再現されるかは依然として不明であるが、5-FU が RNA への F-UTP の取り込みを介して細胞毒性を誘導する可能性があることが多くの研究で示されている10、11、12、13、14。一方、腫瘍におけるTS発現は5-FU反応と相関しているようであり、5-FUの毒性がDNA複製および/または修復の障害に依存している可能性があることを示唆しているが、相関関係は因果関係を意味するものではない8,15,16,17。、18．

精密医療と標的療法の応用はゲノム研究によって促進されてきましたが、従来の化学療法では比較的成功していません 2,19。実際、5-FU 応答の決定におけるさまざまな遺伝子変異の関連性は、依然としてとらえどころのないままです。さらに、腫瘍内の遺伝的および表現型の不均一性も、異なる治療反応と耐性に寄与します 2,20,21,22。癌幹細胞 (CSC) は、腫瘍内で活発に増殖し、分化能を示す腫瘍細胞のサブセットです 23、24、25。異なる CRC 細胞タイプが 5-FU に対して異なる反応を示すかどうかもまだ解明されていません。全体として、5-FU ベースの CRC 治療戦略の改善を制限する知識が依然として不足しています。

従来の化学療法の作用機序についての知識を高めることを目的とした研究は、操作が可能であると同時に大腸癌腫瘍の形態学的および分子的特徴を再現できる前臨床モデルで実施されるべきである。腫瘍由来の 2D 細胞株は、現在のがん生物学の理解に大きく貢献していますが、ほとんどの場合、（遺伝的）安定性が低く、in vivo での腫瘍の細胞不均一性が欠如しています 26。対照的に、腫瘍のすべての特徴を示す腫瘍生検は、材料が限られており、操作の選択肢がないため、研究には不十分であることがよくあります。患者由来オルガノイド (PDO) は、患者生検と 2D 細胞株の間のギャップを埋めます。 PDO は、CRC 腫瘍に見られる体細胞コピー数の変動と変異スペクトル、および CRC 腫瘍の遺伝的および非遺伝的不均一性を再現しています 27,28。さらに、複数の研究では、複数の種類のがん由来の腫瘍由来オルガノイドが患者の化学療法反応を予測し 29,30,31,32,33 、その反応は長期にわたって安定していることが示されています 32,34。さらに、オルガノイドを使用すると、因果関係と下流の薬物毒性のメカニズムを評価するための操作が可能になります。

腫瘍には複雑な遺伝的背景があり、すべての遺伝的病変が腫瘍の進行を促進するわけではなく、治療反応を決定するものでもありません 2,35,36。化学療法の反応を決定する特定の変異を同定するために、我々は明確に定義されたシステム、CRC 腫瘍進行オルガノイドモデル (TPO)37 および PDO を選択しました。 TPO モデルは、CRC の最も頻繁な 4 つのドライバー変異 (APCKO、KRASG12D、P53KO、SMAD4KO) を保持するように遺伝子操作された、健康な結腸組織に由来するオルガノイドで構成されています。 PDO は患者の腫瘍に直接由来しており、以前に特徴付けられています 27。今回我々は、TPOとPDOの両方において、p53欠損が5-FU処理時に一貫してDNA損傷と細胞死を引き起こすことを示す。これは、p53 欠損細胞が細胞増殖を停止できないために起こります。活性型 p53 は、非形質転換 WT および AK (APCKO、KRASG12D) オルガノイドの G1 停止を誘導することで、5-FU 誘発の DNA 損傷から保護し、生存に導きます。 PDO では、より多様な応答が観察されます。 p53 は細胞周期停止を誘導し、5-FU 誘導の DNA 損傷から保護しますが、さらに急速なアポトーシス応答を引き起こす可能性があります。 p53 に対するこの異なる反応は、p53 と PDO に存在する多数の追加の遺伝的病変との複雑な相互作用によるものと考えられます。 5-FU の作用機序がピリミジンの不均衡に依存していることが判明したため、我々は、代謝拮抗剤 5-FU の有効性を向上させるためにがん細胞の代謝を標的にしました。注目すべきことに、ヴァールブルグ効果の再配線により、p53欠損およびKRASG12D解糖性CRC細胞において選択的にヌクレオチドレベルが低下し、5-FU毒性が増強されるが、形質転換されていない腸細胞ではそうではないことが判明した。

特定の変異を CRC における 5-FU 感受性と関連付けるために、主要な CRC ドライバーのさまざまな組み合わせを保持するように遺伝子操作された TPO の 5-FU 応答を分析しました。この研究では、非形質転換 (WT)、APCKOKRASG12D (AK)、APCKOP53KO (AP)、APCKOKRASG12DP53KO (APK)、および APCKOKRASG12DP53KOSMAD4KO (APKS)37 TPO を使用しました。このモデルは in vitro および in vivo で研究されており、APK および APKS オルガノイドはそれぞれ腺癌と転移能を有する低分化腺癌の形態学的特徴を再現しています 37,38。まず、5-FU 治療に対する感受性を分析したところ、オルガノイド株ごとに反応が異なることがわかりました。 5-FU は、AP、APK、および APKS オルガノイドの細胞生存率を大幅に低下させ、WT および AK オルガノイドよりも高い増殖率も示しました。対照的に、WTおよびAKオルガノイドは細胞生存率の有意な低下を示さなかったが、オルガノイドサイズの違いが観察され、5-FUの細胞増殖抑制効果を示唆しました（図1a、bおよび補足図1a〜d）。 P53 は十分に確立された因子であり、DNA 損傷応答の構成要素であり、5-FU は DNA 合成を妨害する可能性があります 8,9,39。したがって、本発明者らは、5-FU における DNA 損傷マーカー γH2AX を評価した。ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析は、5-FU処理がp53欠損オルガノイドでDNA損傷を誘導したのに対し、この表現型はWTおよびAKオルガノイドではより穏やかであり、および/または有意ではないことを示しました（図1c、dおよび補足図1d）、e）。 5-FU によって誘発される DNA 損傷についてさらに洞察を得るために、さまざまな DNA 損傷応答経路の活性化を分析しました。複製フォークの停止と一本鎖 DNA の切断は、従来の化学療法の一般的な結果です 40,41。したがって、我々はまず、複製ストレスと一本鎖切断時に活性化される ATR-Chk1 経路を評価しました 42。経時的実験により、5-FUはWTとp53欠損オルガノイドの両方で24時間という早い段階でChk1活性化を誘導することが明らかになりました（補足図1e）。 24 時間の時点で、WT オルガノイドは DNA 損傷マーカー γH2AX の軽度の誘導を示しました。 P53WTオルガノイドは次の24時間以内に損傷を解消しましたが、p53欠損オルガノイドはこの後の時点でγH2AXの蓄積を示しました（補足図1e）。これは、P53WT 細胞は 5-FU 誘発 DNA 損傷を解決するが、p53 欠損オルガノイドは解決できないことを示唆しています。興味深いことに、ATRの阻害は形質転換オルガノイドとWTオルガノイドの両方でChk1活性化を妨げ、これはChk1活性化が複製ストレスの結果であることを示しています（図1e）。それと一致して、ATR-Chk1経路の阻害は、WTオルガノイドとAKPSオルガノイドの両方でγH2AXレベルを高めます（図1f）。複製ストレス中に、複製フォークが修復されずに停止すると、二本鎖 DNA の切断や ATM-Chk2 経路の活性化が引き起こされる可能性があります 42,44。我々は、5-FUがAPKおよびAPKSではATM依存性のChk2活性化を引き起こすが、WT、AKおよびAPオルガノイドではそうではないことを発見した（図1eおよび補足図1e）45。総合すると、これらの結果は、ATR-Chk1 経路が 5-FU 誘発複製ストレスの解決に必要であること、そして重要なことに、5-FU 治療が p53 欠損腫瘍オルガノイドにおける未解決の DNA 損傷および細胞死のレベルの増加につながることを示しています。

a 5-FUで7日間処理したWTおよびCRCオルガノイドの代表的な明視野画像（スケールバー= 500μm）。 b 7日間の5-FU処理後の生存細胞（DAPI-）と死細胞（DAPI+）を区別するためのフローサイトメトリーによるWTおよびCRC腫瘍オルガノイドの細胞生存率分析（平均±SEM、n = 3〜5、一元配置分散分析、 Sidak の多重比較検定)。 c 5-FUで48時間処理したWTおよびCRC腫瘍オルガノイドからの溶解物中のγH2AXおよびβ-アクチンのウェスタンブロット検出（n = 5の代表）。 WT、AK、AP、APK、APKS を同じゲル上で一緒に実行しました。 d 5-FUで48時間処理し、抗γH2AXで染色したWTおよびCRCオルガノイドのフローサイトメトリーによるDNA損傷のある細胞の定量化（平均±SEM、n = 5（WT）、3（AK）、6（AP））、8 (APK および APKS)、一元配置分散分析、Sidak の多重比較検定)。 e、f 5-FUで24時間処理し、ATR阻害剤VE-821またはATM阻害剤KU55933のいずれかで共処理したWTおよびAPKSオルガノイドからのライセートの(p)Chk1、(p)Chk2、γH2AXおよびビンキュリンのウェスタンブロット検出。または両方を 26 時間 (n = 3 の代表、WT: Chk2: Santa Cruz、#SC-9064、APKS: Chk2: Cell Signaling、#3440)。 WT と APKS は別々のゲル上で実行されました。 ns: 有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、****p < 0.0001。

我々の前述の結果は、一部の細胞がDNA損傷を示さず、処理を生き延びるため、すべての細胞が均一に処理に反応するわけではないことを示しています（図1b、d）。単一細胞レベルで 5-FU 応答を分析するために、5-FU 応答性オルガノイド (AP、APK、および APKS) でこれをさらに調査しました。まず、5-FU 誘発 DNA 損傷を免疫蛍光法で分析し、単一細胞レベルでの応答を調べました。実際、単一オルガノイド内では、5-FUによって誘発されるDNA損傷は細胞間で不均一です（図2aおよび補足図2a）。遺伝的不均一性の次に、CRC 腫瘍は表現型の不均一性を示します。健康な腸と同様に、癌幹細胞 (CSC) は、高い Wnt シグナル伝達によって特徴づけられ、増殖し、腫瘍の成長を促進します 23、24、25、46、47。 CSCにおける5-FUに対する応答を調べるために、我々はオルガノイド株にWntベースの幹細胞レポーターSTAR48、49、50、51を遺伝的に導入した。 WTオルガノイドとCRCオルガノイドの両方で、細胞は幹細胞性において不均一性を示しました（図2bおよび補足図2b）。さらに、EdUの取り込みと細胞周期の分析により、WTオルガノイドとCRCオルガノイドの両方でSTAR +細胞が実際に増殖する細胞集団を構成していることが示されました（補足図2c〜e）23、24。興味深いことに、フローサイトメトリーおよび免疫染色分析により、CSCは5-FU処理時に分化した細胞よりも多くのDNA損傷を獲得することが明らかになりました（図2c、dおよび補足図2c、f）。これはその高い増殖速度に関連しています。それと一致して、γH2AXと組み合わせた増殖マーカーKi67の免疫染色により、5-FUの際、Ki67+増殖細胞は非増殖Ki67-細胞よりも多くのDNA損傷を有することが明らかになった（図2eおよび補足図2g）。さらに、各細胞周期期におけるγH2AXの分析により、DNA損傷細胞の割合がG1期の細胞と比較してS期およびG2/M期で高いことが示されました（図2f）。興味深いことに、周期性CSCで観察されるこのパターンは、周期性STAR分化細胞（ごく一部）でも見られます（補足図2h）。これらの結果は、細胞内の活発な増殖状態が 5-FU 感受性にとって重要であることを示しています。

a 5-FUで48時間処理し、抗γH2AXおよびDAPIで染色したAPKSオルガノイドの代表的な画像（スケールバー= 50μm）。 b 幹細胞レポーターSTARを形質導入し、DAPIで染色したAPKSオルガノイドの代表的な画像（スケールバー= 50μm、上のパネル：単一のZスタック、下のパネル：Zスタックの最大投影）。 c 5-FUで48時間処理したAP、APK、およびAPKSオルガノイドの免疫蛍光画像のSTAR-およびSTAR+細胞におけるγH2AX強度の定量化（補足図2f）（3つの独立した実験からの12のオルガノイドからの条件あたり70〜153細胞）、マン・ホイットニー検定）。 d 5-FUで48時間処理したAP、APKおよびAPKSオルガノイドのSTAR-細胞とSTAR+細胞におけるフローサイトメトリーによるγH2AX+細胞の検出（平均±SEM、n = 6（AP、APKS）、7（APKS）、1- ANOVA、Sidak の多重比較検定など）。 e 5-FUで48時間処理したAP、APK、およびAPKSオルガノイドの免疫蛍光画像のKI67+細胞とKI67-細胞におけるγH2AX強度の定量化（補足図2G）3つの独立した実験からの12のオルガノイドからの条件あたり128〜331細胞、マン・ホイットニー検定）。 f フローサイトメトリーによるγH2AX + 細胞の検出 5-FUで48時間処理したAP、APKおよびAPKSオルガノイドのG1、SおよびG2 / M細胞（平均±SEM、n = 5（AP）、7（APK、APKS）、 AP、APK: 一元配置分散分析、シダックの多重比較検定、APKS: クラスカル・ウォリス検定、ダンの多重比較検定)。 ns: 有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

5-FU 応答における p53 の重要性は研究されていますが、明確な全体像はまだ明らかになっていません 17,52,53,54,55。 in vitro 研究では、p53 が 5-FU 誘導性アポトーシスに必要であることが示されていますが 56、57、58、59、60、疫学研究では、P53 の発現がステージ III および IV の患者における 5-FU 耐性と相関していることが示されています 52、54、61。ここで我々は、p53 の機能喪失が 5-FU 感受性につながることを発見し、したがってこの表現型の背後にあるメカニズムを調査しました。ウェスタンブロット分析により、WTオルガノイドおよびAKオルガノイドにおいて、p53およびその転写標的p21が、それぞれ4時間および16時間の5-FU処理で増加することが示されました（図3a）。 P53は、Rbをリン酸化するサイクリン/CDK複合体に結合して阻害するp21を介して細胞増殖を調節し、それによってそのリン酸化とその結果としてのG1/S移行の阻害を防ぎます(62で概説)。 5-FU処理によりP53WTオルガノイドではRbリン酸化が完全に失われるのに対し、p53欠損オルガノイドではp21誘導が欠如し、Rbリン酸化が残っていることがわかりました（図3b）。一致して、細胞周期プロファイル分析では、5-FUがP53WTオルガノイドではG1停止を誘導するのに対し、p53欠損オルガノイドではS / G2期の蓄積を引き起こすことが示されました（図3c、補足図1dおよび表1）。これらは、5-FU誘発性のDNA損傷を防ぐ機構としてp53誘発性のG1停止を示しており、これはWTおよびAKで観察されたサイズの減少と一致しています（図1aおよび補足図1b、c）。それをテストするために、CDK4/6 阻害剤 palbociclib63 によって G1 の細胞を停止させることで、p53 の機能を置き換えました。 24時間の処理後、ほとんどの細胞がG1で停止し（補足図3a、b）、5-FU投与を続行しました。 p53欠損オルガノイドにおけるG1停止により、5-FUによるDNA損傷が完全に防止され、5-FU誘発性の細胞死が救出された（図3d〜f）。これは、複製中のDNA損傷がp53-FUの毒性の主な原因であることを示唆している。欠損オルガノイド。 5-FU応答におけるp53の機能をさらに検証するために、ドキシサイクリン誘導性P53過剰発現（OE）システムを使用して条件付きP53アドバック実験を実行しました（図3g–jおよび補足図3c–f）。 P53を誘導すると、p21誘導が回復し、S / G2細胞周期の蓄積が防止されたため、APKおよびAPKSにおける5-FU応答が再確立されました（図3g、h）。それと一致して、DNA損傷と細胞死はP53 OE時に大幅に回復しました（図3g、i、j）。アドバックシステムは5-FU時のp53の一時的な安定化を再現せず（図3a）、持続的なp53活性化はアポトーシスを引き起こす可能性があるため、不完全な細胞生存率レスキューはアドバックシステムに起因する可能性があります62、64、65。これらの結果は、p53 が 5-FU 応答における識別因子として機能し、p53 の喪失が 5-FU 誘発 DNA 損傷と細胞死を引き起こすことを裏付けています。

5-FUで4、8、16、24、および48時間処理したWTおよびAKオルガノイドにおけるp53、p21およびビンキュリンのウェスタンブロット検出（n = 4のブロット代表）。 WT と AK を同じゲル上で実行しました。 b 5-FUで48時間処理したWTおよびCRCオルガノイドにおけるp53、p21、(p)Rbおよびビンキュリンのウェスタンブロット検出（n = 4の代表）。 WT、AK、AP、APK、APKS を同じゲル上で一緒に実行しました。 c 5-FUで48時間処理したWTおよびCRCオルガノイドのフローサイトメトリーによって決定された細胞周期プロファイル（平均±SEM、n = 4（WT）、3（AK）、5（AP）、7（APK）、6（ APKS）、クラスカル・ワリス検定、対応のない t 検定、マン・ホイットニー検定）。 d 5-FUで48時間処理したAP、APKおよびAPKSオルガノイドのγH2AXおよびチューブリンのウェスタンブロット分析。パルボシクリブ治療は、細胞を G1 で停止させるために 5-FU 治療の 24 時間前に開始しました (n = 3 を代表)。 AP、APK、APKS を同じゲル上で一緒に実行しました。 e、f 5-FUで6日間処理したAP、APK、およびAPKSオルガノイドの代表的な明視野イメージング（e）および細胞生存率分析（f）。パルボシクリブ治療は、G1 で細胞を停止させるために 5-FU 治療の 24 時間前に開始しました (スケールバー = 500 μm、平均 ± SEM、n = 3、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 g 5-FU で 48 時間処理したドキシサイクリン誘導性 APK-P53OE および APKS -P53OE オルガノイドにおける p53、p21、γH2AX、および β-アクチンのウェスタンブロット検出 (ドキシサイクリン (APK については 40 ng/ml、APK については 200 ng/ml) APKS) 治療は 5-FU 投与の 16 時間前に開始しました) (n = 3 を代表)。 APK と APKS は別々のゲルで実行されました。 h 5-FUで48時間処理したドキシサイクリン誘導性APK-P53OEおよびAPKS-P53OEオルガノイドの細胞周期プロファイル（ドキシサイクリン（APKでは40 ng/ml、APKSでは200 ng/ml）処理は5-FUの16時間前に開始しました）投与）（平均±SEM、n = 3、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定）。 i、j 4日間の5-FUで生細胞（DAPI−）と死細胞（DAPI+）を区別するためのフローサイトメトリーによるドキシサイクリン誘導性APK-P53OEおよびAPKS-P53OEオルガノイドの明視野画像（i）および細胞生存率分析（j）処理。 APK: ドキシサイクリン (40 ng/ml) 治療を 5-FU 投与の 16 時間前に開始し、24 時間後に洗い流しました。 APKS: ドキシサイクリン (200 ng/ml) 治療は 5-FU 投与の 16 時間前に開始され、洗い流されませんでした (スケールバー = 500 μm、平均 ± SEM、n = 6 (APK-P53 OE)、4 (APKS-P53) OE)、一元配置分散分析、Sidak の多重比較検定)。 ns: 有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

次に、このメカニズムが大腸がん患者に近いモデルで保存されているかどうかを調べました。したがって、我々は、CRC 患者の腫瘍由来のオルガノイド (PDO) における 5-FU 応答を評価しました 27。 P53に変異があるまたはない系統を選択し、MDM2阻害（Nutlin-3）に対する感受性に基づいてp53機能を検証しました27（補足図4a）。 Nutlin-3はP7tおよびP14tオルガノイドで細胞死を誘導しましたが、P9t、P16t、P19btは抵抗性であり、それぞれ機能的および非機能的p53を示しました（補足図4a）。 5-FU処理すると、p53欠損株P9t、P16t、P19btは、p21およびG1停止を誘導できず、DNA損傷と細胞死を受けたため、TPOモデルと同様に応答しました（図4a〜eおよび補足図。 1d）。機能的なp53を持つPDO株（P7tおよびP14t）では、5-FUが実際にp53の安定化、p21の誘導、およびG1停止を誘導することが観察されました（補足図4b、c）。ただし、これらの PDO は、DNA 損傷の明らかな兆候がなく、急速にアポトーシス細胞死を起こしました（補足図 4b、d、e）。 TPO とは対照的に、PDO は TPO に比べてかなりの数の追加の遺伝的病変を抱えています。これは、P14tにおけるp53の高い基礎レベル（補足図4b）またはP7t27の超突然変異状態など、これらの追加の特定の腫瘍固有の条件の存在下では、p53機能が抵抗性の媒介からアポトーシスの誘導にそることができることを示しています。 PDOのp53機能をさらに研究するために、p53欠損系統にp53アドバックシステムを導入しました（補足図4f）。 p19btおよびp16tにP53を再導入すると、p21誘導が回復し、S / G2細胞周期の蓄積が防止され、5-FU処理時のDNA損傷が効率的に防止されました（図4f、gおよび補足図4f）。 P53 OEは、P19btでは生存率を明らかに回復し、p16tオルガノイドでは穏やかに生存率を回復しました（図4h、i）。まとめると、これらの結果は、腫瘍における p53 の機能喪失が、DNA 損傷による細胞死を特徴とする一貫した結果をもたらすことを示しています。 P53WT 腫瘍では、5-FU は p53 の活性化、p21 の誘導、および G1 停止を誘導し、追加の腫瘍固有の条件に応じて、p53 は DNA 損傷に依存せずにアポトーシスを保護または誘導できます。

5-FUで48時間処理したWTおよびP9t、P16t、およびP19btオルガノイドにおけるp53、p21およびチューブリンのウェスタンブロット検出（n = 3の代表）。 WT、P9t、P16t、および P19bt を同じゲル上で一緒に泳動しました。 b 5-FUで48時間処理し、抗γH2AXで染色したP9t、P16tおよびP19btオルガノイドのフローサイトメトリーによるDNA損傷のある細胞の定量化（平均±SEM、n = 6（P9t）、3（P16t）、4（ P19bt)、一元配置分散分析、Sidak の多重比較検定)。 c 5-FUで48時間処理し、DAPIで染色したP9t、P16t、およびP19btオルガノイドのフローサイトメトリーによる細胞周期プロファイル分析（平均±SEM、n = 6（P9t）、3（P16t）、4（P19bt）4 、P9t および P16t: 対応のない t 検定、P19bt: マン・ホイットニー検定)。 d、e 5-FUで6日間処理したP9t、P16t、およびP19btオルガノイドの明視野画像（d）および細胞生存率分析（e）（スケールバー= 500μm、平均±SEM、n = 5（P9t）、8） (P16t)、4 (P19bt) 4、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 f、g 5-FUで48時間処理したドキシサイクリン誘導性P16t-P53OEおよびP19bt-P53OEオルガノイドにおけるp53、p21、γH2AX、およびβ-アクチンのウェスタンブロット検出（f）および細胞周期プロファイル分析（g）。ドキシサイクリン治療 (200 ng/ml) は 5-FU 投与の 16 時間前に開始し、24 時間後に洗い流されました (n = 3、平均 ± SEM、n = 4 (P16t-P53OE)、3 (P19bt-P53OE)、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 P16t-P53OE および P19bt-P53OE を同じゲル上で一緒に泳動しました。 h、i 5-FUで6日間処理したドキシサイクリン誘導性P16t-P53OEおよびP19bt-P53OEオルガノイドの明視野画像(h)および細胞生存率分析(i)。ドキシサイクリン治療 (200 ng/ml) は 5-FU 投与の 16 時間前に開始し、24 時間後に洗い流しました (スケールバー = 500 μm、平均 ± SEM、n = 5、一元配置分散分析、Sidak の多重比較検定)。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

5-FU 誘発性の細胞毒性のメカニズムについてはまだ議論が続いています (参考文献 8、9 で概説)。今回我々は、5-FU誘導性の細胞死が、複製ストレスを示す機能的p53を欠くオルガノイドの周期細胞におけるDNA損傷の誘発に依存していることを発見した。 TS 活性に対する 5-FU の報告された効果に基づいて、ピリミジンプールの 5-FU 誘発変化がこの表現型を説明できるかどうかを分析しました。まず、5-FU に対して最も強い応答を示した APKS オルガノイドのメタボロミクス分析を実行しました。我々は、5-FUにより、dUDPおよびdUMPレベルが増加する一方、TDPおよびTTPプールが枯渇することを観察し（図5a）、5-FUがCRCオルガノイドにおけるTS活性を阻害することを示した。最近、がん細胞はピリミジン合成の中断を相殺できるヌクレオチドオーバーフロー機構を示すことが報告されています 66。このヌクレオチドオーバーフローのメカニズムには、dUMP の蓄積を防ぐためのデオキシウリジンの排出が関与しており、デオキシウリジンの排出速度は TS 阻害の程度に依存します 66。興味深いことに、5-FU処理による細胞外デオキシウリジンレベルの増加が観察され（図5a）、これは5-FU誘発TS阻害をさらに裏付けるものでした。 5-FU による DNA 損傷および細胞死に対するピリミジンの不均衡の重要性を調べるために、ヌクレオシドアドバック実験を実施しました。ヌクレオシドの混合物（アデノシン、グアノシン、シチジン、およびチミジン）の投与は、APKSオルガノイドにおける5-FU誘発性のDNA損傷、S期蓄積および細胞死を防止した（図5b、c、e、f）。興味深いことに、他のヌクレオシドではなく、チミジンを 1 回添加するだけで、細胞周期、DNA 損傷、細胞死に対する 5-FU の影響を軽減するのに十分でした (図 5b-f)。チミジン投与自体は細胞周期の進行に影響を与えず、この救済が細胞周期の影響に依存していないことを示しています（図5d）。これらの結果を総合すると、5-FU が p53 欠損オルガノイドのピリミジンプールを変化させることにより、機構的に DNA 損傷と細胞死を誘導することが示されています。

a 5-FUで30時間処理したAPKSオルガノイドにおけるメタボロミクスによるピリミジンの検出（平均±SEM、n = 3技術的反復、一元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定）。 b 5-FU、ヌクレオシド混合物（A、G、C、およびT（各25μM））、またはT（25μM）で48時間処理したAPKSオルガノイドのγH2AXおよびチューブリンのウェスタンブロット検出（n =のブロット代表） 3)。すべてのサンプルは同じゲル上で実行されました。 c 5-FU、ヌクレオシド混合物（A、G、C、およびT（各25μM））、または別のヌクレオシド（25μM）で48時間処理したAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによるDNA損傷のある細胞の定量化（平均） ± SEM、n = 5、6 (5-FU)、4 (混合)、3 (G)、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 d 5-FU、ヌクレオシド混合物（A、G、C、およびT（各25μM））、またはT（25μM）で48時間処理したAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによる細胞周期プロファイル分析（平均±SEM、 n = 5 (ctrl、5-FU)、4 (+AGCT)、3 (+T)、一元配置分散分析、Sidak の多重比較検定)。 e、f 5-FU、ヌクレオシドミックス（アデノシン、グアノシン、シトシン、チミジン（各25μM））、またはチミジン（25μM）で処理したAPKSオルガノイドの代表的な明視野画像（e）および細胞生存率分析（f）。 6 日間 (スケールバー = 500 μm、平均 ± SEM、n = 3、一元配置分散分析、Sidak の多重比較検定)。 A アデノシン、AU 任意単位、C シチジン、dUDP デオキシウリジン二リン酸、dUMP デオキシウリジン一リン酸、G グアノシン、ND 検出されない、ns ミックスヌクレオシドミックス、ns 非有意、T チミジン、TMP チミジン一リン酸、TDP チミジン二リン酸、TTP チミジントリホスフェイト、 TS チミジル酸シンターゼ。 ns: 有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

がん細胞は、酸素の利用可能性に関係なく、グルコースを熱心に取り込み、解糖によって乳酸塩に代謝することによってワールブルグ効果を受けます。この解糖の増加により、ATP の迅速な生成が可能になり、ヌクレオチド合成などの解糖中間体に依存する同化経路の活性がサポートされます。 5-FU 毒性におけるヌクレオチドの重要性に基づいて、我々はヴァールブルグ効果を標的とすることで 5-FU の有効性を改善できる可能性があると合理化しました。タツノオトシゴの生体エネルギー分析では、AK、APK、APKS オルガノイドの解糖速度が WT および AP オルガノイドよりも高いことが示されました 67 (図 6b)。一方、呼吸パラメーターには大きな違いはありません (補足図 5a、b)。これらの結果は、ワールブルグ効果が in vitro オルガノイドで再現されることを示しています。注目すべきことに、これらの結果は、CRCにおけるヴァールブルグ効果の主な要因として、p53の機能喪失ではなく、構成的活性Rasシグナル伝達（KRASG12D）を指摘している。

a 解糖およびさまざまな解糖を標的とする薬剤の概略図。 b Seahorse XF分析による解糖ストレス試験によって決定されたWTおよびCRCオルガノイドの細胞外酸性化率（ECAR）（平均±SEM、n = 4（WT、AK）、5（AP、APK、APKS）、一元配置分散分析、 Sidak の多重比較検定)。 c 5-FUで48時間処理したAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによる、DNA損傷のある細胞の定量化。 2-DG治療は5-FU治療の20時間前に開始した(平均±SEM、n = 4、一元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定)。 d 2-DGで24時間処理したAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによるEdU取り込み分析（平均±SEM、n = 5、対応のないt検定）。 e 5-FUで48時間処理したAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによる、DNA損傷のある細胞の定量化。グルコース飢餓は、5-FU治療の20時間前に開始した(平均±SEM、n = 6、5 (2 mMグルコース)、一元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定)。 f 24時間グルコースを欠乏させたAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによるEdU取り込み分析（平均±SEM、n = 4、一元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定）。 g DCAで24時間処理したWT、APK、およびAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによるEdU取り込み分析（平均±SEM、n = 4、5（APKS）、一元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定）。 h 5-FUで48時間処理したWT、APK、APKS、およびP19btオルガノイドのフローサイトメトリーによる、DNA損傷のある細胞の定量化。 DCA治療（TPOについては20 mM、P19btについては10 mM）を5-FU治療の20時間前に開始した（平均±SEM、n = 5、4（WT）、6（AK）、7（APKS -/-および5-FU） )、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 i DCAおよびTEPP-46で24時間処理したAPKSオルガノイドのタツノオトシゴXF解糖ストレス試験中の細胞外酸性化率（ECAR）の決定（平均±SEM、5回の技術的反復、n = 3を代表）。 j DCAおよびTEPP-46で24時間処理したAPKSオルガノイドのメタボロミクスによるTTP、dATP、およびATPの検出（平均±SEM、3回の技術的反復（反復測定による）、一元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定）。 k 5-FUで48時間処理したAPKSオルガノイドのフローサイトメトリーによる、DNA損傷のある細胞の定量化。 DCAおよびTEPP-46治療は、5-FU治療の20時間前に開始した(平均±SEM、n = 4、3(DCA)、一元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 2-DG 2-デオキシグルコース、ATP アデノシン三リン酸、dATP デオキシアデノシン三リン酸、DCA ジクロロ酢酸、G6P グルコース 6-リン酸、HK ヘキソキナーゼ、PDH ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、PDK ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ、PEP ホスホエノールピルビン酸、PKM2 ピルベートキナーゼ M2、TTP チミジン三リン酸。 ns: 有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

腫瘍オルガノイドの高い解糖速度を下げるために、我々はまず、代謝できずに細胞内に蓄積するグルコース類似体である2-デオキシグルコース（2-DG）を投与しました。これは、ヘキソキナーゼ-2（HK2；HK2;図6a;参考文献68で概説)。 2-DGは解糖を効率的に減少させましたが（補足図5c）、5-FUと組み合わせると、5-FU誘発性のDNA損傷は増加せず、5-FUのみの治療と比較して有効性が低下しました（図6c）。 EdU取り込み分析により、2-DGが増殖の大幅な低下を引き起こすことが明らかになり（図6d）、増殖を低下させながら解糖を標的にしても5-FU効果は強化されないことが示唆されました。次に、グルコースの利用可能性を下げました。実際、5-FU処理前のグルコース利用可能性の限定的な減少により、DNA損傷が増加しました（図6e）。しかし、グルコース濃度をさらに下げると細胞増殖が低下し、その結果、5-FUの有効性が低下しました（図6e、f）。したがって、我々は腫瘍オルガノイドの解糖を軽減するための薬理学的選択肢を探しました。 DCAはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）の阻害剤であり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）活性を増加させ、その結果、乳酸生成を犠牲にしてピルビン酸のアセチル-coAへの変換を増加させます（図6a）。 DCA処理により、すべてのオルガノイド株でPDHリン酸化が減少し（補足図5d）、PDK活性が阻害されることが確認されました。 DCAは、呼吸パラメーターを増加させながら、ワールブルグ効果を示すオルガノイドの高い解糖速度をWTオルガノイドの解糖速度に匹敵する解糖速度に低下させました（補足図5e-g）。重要なことに、24時間のDCA処理による増殖の有意な変化は見つかりませんでした（図6g）。次に、DCAがヌクレオチド代謝を変化させるかどうかをメタボロミクスによって評価し、DCA処理が実際にヌクレオチドレベルを低下させることを発見しました（図6jおよび補足図5h）。重要なことに、5-FUへの短い前処理としてDCAを投与すると、解糖性APKおよびAPKSオルガノイドでは5-FU処理時にDNA損傷を受ける細胞の数が実際に増加しましたが、これは解糖性が低いAPオルガノイドでは観察できませんでした（図1）。 6hおよび補足図5i）。興味深いことに、PDO モデルでも同様の結果が得られました。 DCAはP19btの解糖を阻害し、ヴァールブルグ効果を示し、5-FU誘発性のDNA損傷を増強しました（図6hおよび補足図5j-l）。 APと同様に、p16tでは、これらの系統がワールブルグ効果表現型を示さないため、DCA処理によって追加の効果は観察されませんでした（補足図5j、k、m）。

次に、5-FU 治療に対する DCA の相乗効果が実際に解糖の阻害に依存しているかどうかを評価しました。ヴァールブルグ効果を示す増殖中のがん細胞は、多くの場合、ピルビン酸キナーゼ M2 アイソフォーム (PKM2) を発現します 69。 PKM は解糖の律速段階を触媒するため、PKM2 の特異的活性化因子である TEPP-46 が DCA 治療の効果を救済できるかどうかを評価しました (図 6a)70。そのために、Seahorse による解糖速度とグルコース FRET センサーのライブイメージングによるグルコースの細胞内レベルを分析しました 71。これらの分析は、PKM2の活性化により解糖阻害が逆転し、DCA処理時に細胞内グルコースレベルが回復することを示しました（図6iおよび補足図5n〜p）。重要なことに、これらの結果と一致して、TEPP-46処理はDCA処理に起因するヌクレオチドの減少を救い、実際に5-FU誘発性DNA損傷に対するDCAの相加効果を防止した（図6j、k）。まとめると、これは、DCA がワールブルグ効果の阻害の結果としてヌクレオチドレベルを低下させることにより、5-FU 誘発 DNA 損傷を増強することを示しています。

次に、DCA と 5-FU の組み合わせが細胞死をさらに増加させることができるかどうかを評価しました。そのために、WT および 5-FU 応答性オルガノイド (APK、APKS、および P19bt) を 5-FU および 5-FU/DCA で処理しました。定性分析により、5-FU処理では一部のオルガノイドが処理後に生存するが、DCA / 5-FU処理ではそれらのオルガノイドが存在しないことが示されました（図7aおよび補足図6a）。我々は、この表現型をフローサイトメトリーによって一括して、および画像解析に基づいて生存率スコアを計算することによって単一オルガノイドレベルで定量的に分析しました。どちらの場合も、DCAと5-FUの組み合わせは、APK、APKS、およびP19btオルガノイドでの単一の5-FU処理と比較した場合、細胞生存率の低下につながり、DCAのこの相加効果はWTオルガノイドでは存在しないことがわかりました（図7a- cおよび補足図6b、c）。治療後の生存率と再発の可能性の代用として、治療後の成長能力を評価しました。オルガノイドを5-FUまたはDCA/5-FUで処理し、オルガノイドの回復を可能にするために処理を除去し、それらを再播種してオルガノイド形成能力を分析しました。 APKおよびAPKSオルガノイドの両方において、DCA / 5-FUの組み合わせが5-FU処理と比較して形成されるオルガノイドの数が少ないことがわかりました（図7d、eおよび補足図6d）。したがって、5-FUと組み合わせてグルコース代謝を再配線することによりワールブルグ効果を標的にすると、非形質転換細胞に影響を与えることなく、解糖性の高いp53欠損腫瘍におけるDNA損傷と細胞死が増加します。

a 5-FUで7日間処理したWT、APK、およびAPKSオルガノイドの代表的な明視野画像。 DCA治療は5-FU投与の20時間前に開始した(スケールバー=500μm、矢印は生存オルガノイドを示し、星印は損傷オルガノイドを示す)。 b CYQUANT（生）およびHoechst（全体）で染色し、5-FUで7日間処理したAPKSオルガノイドの代表的な画像。 DCA 処理は 5-FU 処理の 20 時間前に開始しました (スケールバー = 300 μm)。 c bおよび補足図6cの画像の生存スコアの定量化（中央値、3つの独立した実験からの237〜720のオルガノイド、クラスカル・ウォリス検定、ダンの多重比較検定）。 d 再プレーティングから4日後、48時間の5-FU処理（50μM）（5-FU投与の20時間前に開始したDCA処理の有無にかかわらず）、その後7回のWT、APKおよびAPKSオルガノイドの代表的な明視野画像。回復時間は日数 (スケールバー = 200 μm)。 e 補足図6dに基づく生きたオルガノイド粒子の決定（平均±SEM、WT：2つの独立した実験からの8マトリゲル液滴、APKおよびAPKS：4つの独立した実験からの16マトリゲル液滴、WTおよびAPK：対応のないt検定、APKS：マン・ホイットニー検定）。 ns: 有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、****p < 0.0001。

今回我々は、ヒト由来のオルガノイドの2つのモデルを使用して5-FUの作用機序を詳しく分析し、結腸直腸腫瘍における5-FUの有効性の決定におけるさまざまなドライバー変異の関連性を理解する。私たちは、腫瘍が非機能的な p53 を保有している場合、DNA 損傷とそれに伴う細胞死の誘発により 5-FU に対して感受性が高くなることがわかりました。興味深いことに、このモデルでは、5-FU の有効性は細胞の活発な増殖状態に依存しており、機構的には、5-FU は TTP 合成の阻害を通じて作用します。 p53欠損および解糖系腫瘍における5-FUの有効性を高めるために、ヌクレオチドプールをさらに変更する目的でグルコース代謝の方向を変えることによりヴァールブルグ効果を標的とした。この戦略は実際に、すでに感受性の高い p53 欠損および解糖系腫瘍における 5-FU の有効性を改善し、重要なことに、健康な非形質転換細胞に対してさらなる毒性を示さなかった。

精密医療は、がん患者が最も適切な治療を受けられるように、遺伝学に基づいて治療のために患者を層別化することを目的としています72。しかし、5-FU などの従来の化学療法では、作用機序の理解が未解決であることもあり、これは成功していません 2,19。蓄積されている証拠は、5-FU が DNA と RNA の両方を介して細胞毒性を誘導することを示しています 8、9、10、11、12、13、14、73。この明らかな異なる作用機序は、5-FU の用量 (これらの研究では 1 ～ 1000 μM の範囲) から生じる可能性があり、高レベルの 5-FU は RNA 毒性を通じて細胞を標的にすることが提案されていますが、低用量への長期曝露は危険です。 TS阻害によって誘発されるDNA損傷を介して細胞毒性があると提案されています8、74、75、76。患者の血漿および腫瘍中の（低い）5-FU 濃度（それぞれ 8 μM および 45 μM/kg 77）は、DNA 損傷効果が CRC 腫瘍において毒性を引き起こす可能性が高いことを示唆しています。それと一致して、TS 発現と 5-FU 応答は相関しており、一般に TS レベルが高い腫瘍は TS レベルが低い腫瘍よりも 5-FU 療法に対する抵抗性が高くなります 8、15、16、17、18。 CRCオルガノイドでは、p53欠損により、5-FUが主にピリミジン合成誘発性のDNA損傷蓄積の障害を介して周期細胞において細胞毒性を誘導することが判明した。非周期細胞における 5-FU 誘導性の細胞毒性は観察されていませんが、異なる 5-FU 濃度またはタイミングにより、5-FU 誘導性の細胞毒性の別のメカニズムが明らかになる可能性があります。

薬効における特定のドライバー変異の役割を特定することは困難です2,35,36。ここで我々は、p53活性の欠損が、DNA損傷誘発細胞死を介して5-FU毒性を一貫して確保していることを発見した。一方、p53 が機能している場合、p53 は安定化して p21 を誘導し、その結果細胞周期が停止し、5-FU 誘導による DNA 損傷が防止されます。この応答は、非形質転換WTおよびAKオルガノイドで観察されるように、5-FUから保護するのに十分で生存につながるか、またはDNA損傷の兆候がない急速なアポトーシス細胞死を誘導するかのいずれかであることがわかりました。 P7t および P14t オルガノイド。これまでの研究では、p53 について 2 つのシナリオが示されています。1 つは細胞周期停止に依存した 5-FU に対する保護的役割 56,78,79 ですが、p53 は 5-FU 依存性のアポトーシスを誘導するのに必要であることも示しています 14,56,57,58,59,60 。我々の観察は、p53 誘発アポトーシスは DNA 損傷とは無関係である可能性が高く、したがって RNA 毒性などの他の 5-FU 誘発ストレスによって引き起こされる可能性があることを示しています 8,9,10,11,12,13,14,73。 p53 誘導性の細胞周期停止とアポトーシスのバランスは、5-FU 用量、または腫瘍内因性因子 (エピジェネティックな状態、活性なシグナル伝達経路) および細胞状況 (細胞微小環境) に依存する可能性があります 80、81、82、83。追加の突然変異の存在に関する結果を示します。例えば、最近の研究では、発癌性 HRAS が複製ストレスに対する p53 依存性の転写反応を低下させる可能性があることが示されています 84。

CSCは、高い腫瘍開始能力を有する腫瘍内の細胞の部分集団として定義されました。したがって、当初は CSC が治療に対する抵抗性と腫瘍再発の原因であることが示唆されていました 21。しかし、非CSCがCSC表現型を獲得できる細胞可塑性の発生は、治療抵抗性が特定の細胞型に起因する可能性が低いことを示しています。 CRC 腫瘍では、ほとんどの CSC が高い Wnt シグナル伝達と活発な増殖を示します 23、24、25、46。ここで、我々は、周期細胞が5-FUによって効率的に標的とされることを発見した。興味深いことに、DNA損傷を蓄積しないG1の幹細胞集団が観察されました。これは、以前に報告された、CRC腫瘍における耐性および再発の可能性の増加を示すCSC亜集団内の低速周期/静止CSCの亜集団と一致している可能性があります85。これらの結果を総合すると、特定の細胞型ではなく細胞の挙動が 5-FU 感受性を決定することが強調されます 81。

がん細胞の代謝は、制御されない増殖をサポートするために変化します (参考文献 86、87、88、89 で概説)。ヴァールブルグ代謝の役割（十分な酸素の存在下での乳酸塩への高い解糖速度）は最近見直され、最終生成物としての乳酸塩が細胞の酸化還元状態のバランスをとり、同化経路を促進することが提案されています（参考文献86、 87）。 DCA は、代謝性疾患の治療に現在使用されている (副作用が最小限に抑えられた) FDA 承認薬です90,91。以前の研究では、DCAは、とらえどころのない代謝機構を通じて、獲得耐性を持った細胞に対する化学療法感受性を回復できる可能性があると提案されています92,93。ここでは、5-FU への短い前処理として適用すると、グルコース代謝が変化し、有効性が向上することを示します。 DCAは、機能的p53の喪失とヴァールブルグ効果の両方を示すオルガノイドにおいてのみ、この相加効果を誘発することができる。我々の結果と以前の証拠94は、p53の機能喪失ではなく、KRASG12D変異がCRCにおけるヴァールブルグ効果と呼ばれる代謝変化を引き起こすことを示唆している。これは、この治療の組み合わせから恩恵を受ける可能性のある腫瘍のサブグループを示しています。機構的に、本発明者らは、DCAが細胞静止を誘導することなくヴァールブルグ効果を阻害した結果としてヌクレオチドレベルを低下させることにより5-FUの有効性を改善することを示す。これは、長期間の DCA 処理で以前に観察された成長速度の低下に対する追加のメカニズム 92 であり、下流の代謝遷移における増殖および分化プロセスの違いによる可能性があります 95,96。 DCA のこの作用に基づいて、グルコース代謝を再配線すると、DNA 複製を標的とする他の化学療法の有効性も向上する可能性が高いと考えられます。

精密医療が進歩する一方で、従来の化学療法は依然として腫瘍学の主力です。患者の治療を改善するための「低コスト、低毒性」戦略を見つけるには、それらの作用機序をより深く理解することが鍵となります。グルコース代謝の再配線が健康な組織に悪影響を及ぼさないように見えることを考慮すると、これは従来の化学療法を改善する有望な戦略として浮上します。

腫瘍進行オルガノイドは、Clevers lab から寄贈されました 37。患者由来のオルガノイド P7t、P9t、P14bt、P16t、および P19bt は HUB バイオバンクから入手され、以前に特性評価されていました 27。オルガノイドは 37 °C、5% CO2 で培養されました。マイコプラズマのない状態が定期的に確認されました。基本培地には、ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES、および 20 mM グルタマックスを補充した高度な DMEM/F12 が含まれていました。実験では、単一細胞/小さな細胞塊へのトリプシン処理後、細胞をマトリゲル (Corning、#356231) または BME (Bio-Techne、#3533-010-02) 中で Rock を補充した拡大培地 (表 2) で培養しました。阻害剤 Y-27632 (Gentaur、#607-A3008)。

7日後、オルガノイドを希釈して24ウェルプレートに再播種し(11μlを4滴)、培地を分化培地に交換した(表3)。 3日後、分化培地を交換し、さらに20時間後、5-FU (Sigma、#F6627)を添加した。別段の記載がない限り、すべての実験では 100 μM の 5-FU を使用しました。 5-FU 治療のタイミングは図の凡例に記載されています。

ATR阻害剤VE-821（5μM、Bioconnect、#S8007）およびATM阻害剤KU-55933（10μM、Sigma、#SML1109）による治療を5-FU投与の2時間前に開始した。ヌクレオシド (各 25 μM、すべて Sigma: アデノシン #A4036、チミジン #T9250、グアニン #G6264 およびシチジン #C4654) を 5-FU と一緒に添加しました。パルボシクリブ (1 μM、selleckchem、#S1116)) による治療を 5-FU 添加の 24 時間前に開始しました。 DCA (20 mM、Sigma、#347795)、2-DG (10 mM、Sigma #D8375)、および TEPP-46 (100 μM、Selleckchem、#S7302 処理) またはグルコース飢餓を 5-FU 処理の 20 時間前に開始しました。グルコース飢餓培地は、SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex Media (Gibco、#A2494301)、ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES および 20 mM Glutamax、L-アルギニン (147.5 mg/L、Sigma、#A6969) を補充して調製しました。 l-リジン (91.25 mg/L、Sigma、L8662) および記載のグルコース (Merck Millipore、#1.08337.1000) 濃度。 EdU 取り込み分析では、収集の 6 時間前にオルガノイドを 1 μM EdU (Thermofisher、#C10636) とともにインキュベートしました。ドキシサイクリン (Sigma、#D9891) および Nutlin-3 (Sanbio、#10004372) の濃度とインキュベーション時間の詳細は、図の凡例に記載されています。

pInducer-mKate2-NLS-P2A-P53 は、Snippert 研究室からの贈り物です。幹細胞 ASCL2 レポーター (STAR) プラスミド 48,50 から、8x STAR-sTomato-NLS 配列をピューロマイシン耐性カセットを備えたレンチウイルスベクターにクローニングしました。 pcDNA3.1 FLII12Pglu-700uDelta6 (Addgene プラスミド #17866) は、Wolf Frommer71 からの贈り物でした。 YFP 配列との組換えを防ぐために、eCFP 配列をコドン最適化 eCFP 配列に置き換えました。新しいグルコースセンサー配列は、Hef1 プロモーターの制御下およびピューロマイシン耐性カセットを備えたレンチウイルスベクターにクローン化されました。これらの構築物を、第 3 世代のパッケージングベクター、HEK293T 細胞、および LentiX Concentrator (Clontech) とともに使用して、レンチウイルス粒子を生成および濃縮しました。オルガノイドは、参考文献に記載されているようにレンチウイルスによって形質導入されました。 97）。簡単に説明すると、オルガノイドをトリプシン処理し、濃縮ウイルスとインキュベートしました（RT、600 rpmで遠心分離しながら60分間、その後37℃で4時間）。次に、オルガノイドをマトリゲルに播種しました。

オルガノイドを 1 回洗浄し、5 mM NaF (Vwr、#1.06449.0350) および 1 mM NaVO3 (Sigma、#S6508) を補充した氷冷 PBS に回収しました。オルガノイドを遠心分離し、ペレットを、NaF および NaVO3 を補充した Cell Recovery Solution 中で氷上で 15 分間インキュベートしました。遠心分離後、ペレットを溶解バッファー (50 mM Tris pH 7.0、1% TX-100、15 μM MgCl2、5 μM EDTA、0.1 mM NaCl、5 mM NaF、1 mM NaVO3、1 μg/mL ロイペプチン (Sigma、 #11034626001) および 1 µg/mL アプロチニン (Sigma、#10981532001)、タンパク質含量は Biorad タンパク質アッセイ (#500-0006) によって決定されました。サンプルはタンパク質含量に合わせて調整され、Laemli サンプルバッファーが追加されました。タンパク質は SDS で分析されました。 -PAGE を行い、Immobileon Polyscreen PVDF 転写膜 (#IPVH00010、Merck Millipore) または Amersham Protan ニトロセルロース膜 (#10600001 GE Healthcare Life Sciences) に転写し、次のものを認識する一次抗体を使用してウェスタンブロット分析を実行しました: ビンキュリン (1:10,000、Sigma、#) V9131)、チューブリン (1:5000、Merck Millipore、#CP06 OS)、γH2AX (1:10,000、Sigma、#05-636)、pChk1(S345) (1:2000、Cell Signaling、#2348、Chk1 (1: 1000、サンタクルーズ、#SC-8408)、pChk2(T68) (1:1000、セルシグナリング、#2661)、Chk2 (1:1000、セルシグナリング、#3440 およびサンタクルーズ、#SC-9064)、pRb( S780) (1:2000、セルシグナリング、#9307)、Rb (1:1000、サンタクルーズ、#SC-7905)、p53 (1:1000、サンタクルーズ、#SC-126)、p21 (1:1000、 BD Bioscience、#556430)、pPDH(S293) (1:1000、Abcam、#ab92696)、および PDH (1:1000、Invitrogen、#459400)。マウスおよびウサギ IgG を標的とする二次 HRP 結合抗体は、Biorad から購入しました (1:10,000)。

オルガノイドを、ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES、および 1x Glutamax を補充した氷冷 DMEM/F12 培地 (DMEM/F12 +++ 培地) に収集し、その後トリプシン (Sigma) とインキュベートしました。細胞生存率分析では、細胞を氷上で DAPI (Sigma-Aldrich、#D9564) で 5 分間染色し、すぐにフローサイトメトリーで分析しました。生存率はDAPI染色によって決定され、DAPI-細胞は生きていると見なされ、DAPI+細胞は死んでいると考えられました。

γH2AX 染色、細胞周期プロファイル分析、および EdU 取り込み分析では、単一細胞を (PFA) (#1004965000、Merck Millipore) 中で室温で 10 分間固定し、70% EtOH を用いて氷上で一晩透過処理しました。 γH2AX 染色、細胞周期プロファイル分析の場合、オルガノイドを 10 mL PBS + 1% BSA および 0.02% tween で 1 回洗浄し、Phospho-Histone H2A.X (Ser 139)-Alexa Fluor 488 (eBioscience、#53-9865-) とともにインキュベートしました。 82) 光を遮断し、室温で 30 分間。細胞周期プロファイリングのために、オルガノイドを、PBS中のRNAse（100μg/ml）とともにRTで20分間、DAPIとともに2時間、光を遮断した氷上でインキュベートした。 EdU 検出の場合、メーカーの指示に従って、Click-iT Plus EdU Pacific Blue フローサイトメトリーアッセイキット (Thermofisher、#C10636) によって細胞を染色しました。フローサイトメトリーは、BD FACS Celesta #660345 を使用して実行されました。

オルガノイドを氷冷したPBSで1回洗浄し、1 mLの氷冷した細胞回収溶液（Corning、#354253）と1 mLの氷冷したPBSを15 mLチューブに入れて収集し、氷上で10分間インキュベートしました。。オルガノイドを氷冷したPBSで1回洗浄し、4% PFA (#1004965000、Merck Millipore)で室温で20分間固定し、PBS中で4℃で保存しました。染色のために、オルガノイドを 1.5 mL エッペンドルフチューブに移しました。オルガノイドを、10% DMSO、2% Triton X-100、および 10 g l-1 BSA を含む PBS 緩衝液で 4 ℃で 4 時間透過処理しました。オルガノイドを一次抗体 (γH2AX 1:400、Sigma、#05-636、および Ki67 1:200、Abcam、#ab15580) で一晩染色し、Alexa 蛍光標識二次抗体 (Invitrogen) で 4 時間、DAPI で 1 時間染色しました。 4℃で。イメージングは、SP8 共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems) を使用して実行されました。光学顕微鏡法はEVOS M5000イメージングシステム(Invitrogen)を使用して実施した。

画像解析はImageJで行った。画像解析のために、画像は 32 ビット画像に変換されました。核は、DAPI 染色に基づいて Stardist-2D マクロによって自動的に検出されました。これらの ROI 内で、gH2AX、KI67、または STAR の強度が決定されました。 STAR- 細胞と STAR+ 細胞は、オルガノイドあたりそれぞれ 20% の最低 STAR 強度と最高 STAR 強度を持つ核として同定されました。 Ki67 陽性の場合、強度 20 のカットオフが使用されました。

FLII12Pglu-700uDelta6 グルコース FRET センサーのイメージングは 4 つの独立した実験で実行されました。データ分析はImageJで実行されました。 YFP および CFP チャネルの画像は 32 ビット画像に変換され、自動閾値処理が実行され、画像計算ツールを使用して YFP/CFP 比が視覚化されました。 YFP/YFP比は、オルガノイド全体の比の平均を測定することによって定量化されました。

トリプシン処理の 7 日後、オルガノイドを 96 ウェルプレートに再播種しました (5 μL BME/ウェル、5 ウェル/条件)。分化培地中での 3 日間のインキュベーション後 (t = 0)、5-FU を投与し、EVOS M5000 イメージングシステムで 2 日ごとにオルガノイドをイメージングしました。オルガノイドのサイズは、ImageJ での手動分析によって分析されました。

トリプシン処理の 7 日後、オルガノイドを 96 ウェルプレートに再播種しました (5 μL マトリゲル/ウェル、3 ウェル/条件)。細胞生存率分析では、オルガノイドをメーカーの説明書に従って CyQUANT Direct アッセイ (Thermofisher、#C35011) で染色して生細胞を検出し、Hoechst (#H1399、Life Technologies) ですべての死細胞と生細胞を検出し、37 で 1 時間染色しました。 ℃。オルガノイドは Cell Observer Z1 (Zeiss) で画像化されました。

imageJ では、画像が 32 ビットに変換され、C1 (CyQUANT) および C3 (Hoechst) 画像の最大投影が作成されました。両方のチャネルのオルガノイドは Stardist-2D マクロによって自動的に検出され、それぞれ生きている部分 (生きている ROI) とオルガノイド全体 (総 ROI) を反映する関心領域 (ROI) が生成されました。 C1 画像では、生きている ROI がマスクされ、バイナリ画像に変換されました。ここで、バイナリ C1 画像で総 ROI がインポートされ、これらの総 ROI 内で生存 ROI の面積 % が決定され、オルガノイドごとの生存率スコアとして使用されました。

トリプシン処理の 7 日後、オルガノイドを 24 ウェルプレート (11 μL の 4 滴) に再プレーティングし、分化培地で培養しました。 3日後、培地を交換し、DCA (20mM)を添加した。 20 時間後、5-FU (50 μM) を投与し、オルガノイドを 48 時間培養しました。その後、薬物を洗い流し、オルガノイドを分化培地でさらに 7 日間培養しました。 7 日後、オルガノイドをトリプシン処理して小さな塊にし、24 ウェルプレートおよび 96 ウェルプレートのマトリゲルに再播種しました (5 μL マトリゲル/ウェル、4 ウェル/条件)。 4日後に、24ウェルプレート内のオルガノイドをEVOSによって画像化した。 96ウェルプレート内のオルガノイドを、製造業者の指示に従ってCyQUANT Directアッセイ(Thermofisher、#C35011)およびHoechstを用いて37℃で1時間染色した。オルガノイドは Cell Observer Z1 (Zeiss) で画像化されました。

imageJ では、画像を 32 ビットに変換し、C1 (CyQUANT) 画像の最大投影を作成しました。生きているオルガノイド (粒子) は Stardist-2D マクロによって自動的に検出されました。

Seahorse Bioscience XFe24 アナライザーを使用して、前述のように細胞外酸性化速度 (ECAR) を 1 分あたりのミリ pH (mpH) 単位で、酸素消費速度 (OCR) を 1 分あたりの pmol O2 単位で測定しました 67。つまり、オルガノイドを、XF24細胞培養マイクロプレート(Seahorse Bioscience)のウェルあたり3μLのマトリゲルに播種した。測定の 1 時間前に、培地をアッセイ培地に交換し、オルガノイドを 37 °C で 60 分間インキュベートしました。 DCAを用いた実験では、DCAもアッセイ培地に添加しました。ミトコンドリアストレス試験では、培地を、10 mM グルコース (Sigma-Aldrich)、2 mM l-グルタミン (Sigma-Aldrich)、5 mM ピルビン酸 (Sigma-Aldrich) を補充した Seahorse XF Base 培地 (Seahorse Bioscience) に置き換えました。および０．５６μＬｍｌ−１ＮａＯＨ（１Ｍ）。試験中、5 μM オリゴマイシン、2 μM FCCP、および 1 μM のロテノンおよびアンチマイシン A (すべて Sigma-Aldrich) を、それぞれ 18、45、および 63 分後に各ウェルに注入しました。解糖ストレス試験では、培地を 2 mM L-グルタミンおよび 0.52 μL mL-1 NaOH (1 M) を補充した Seahorse XF Base 培地に置き換えました。試験中、10 mM グルコース、5 μM オリゴマイシン、および 100 mM 2-デオキシグルコース (Sigma-Aldrich) を、それぞれ 18、36、および 65 分後に各ウェルに注入しました。注射後、トリプロで 2 分間の測定を実行し、その後 4 分間の混合時間を設けました。オリゴマイシン注射後の最初の測定の前に、5 分間の混合時間、続いてミトコンドリアストレステストの 8 分間の待機時間、および 5 分間の混合時間の後に解糖ストレステストの 10 分間の待機時間を設けました。グループごとの OCR および ECAR 値は、対応するグループのすべてのウェルに存在する DNA の総量に対して正規化されました。

有機溶媒は ULC-MS グレードで、Biosolve (Valkenswaard、オランダ) から購入しました。化学物質と標準物質は分析グレードのもので、Sigma-Aldrich (Zwijndrecht、オランダ) から購入しました。水は、使用当日に Milli Q 機器 (Merck Millipore、アムステルダム、オランダ) から入手しました。

メタボロミクスでは、条件ごとに 200 μL のオルガノイド含有マトリゲルを含む 3 つのウェルを使用しました。処理中、培地と薬剤は収集の 7 時間前に更新されました。収集時間に際し、各ウェルからウェルあたり 500 μl の培地を収集し、同じ条件の他のウェルの培地と一緒にプールし、2 mL エッペンドルフチューブ内の液体窒素中で急速冷凍しました。同じ条件のオルガノイドを収集中にプールしました。オルガノイドを氷冷 PBS で 1 回洗浄し、その後 15 mL ファルコンチューブ内の氷冷 PBS に回収しました。氷冷ＰＢＳで再度洗浄した後、オルガノイドを２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、遠心分離し、８０％氷冷メタノールに再懸濁し、液体窒素中で急速冷凍した。

サンプルを Labconco Centrivap (VWR、アムステルダム、オランダ) で蒸発乾固させました。残留物に、350μLの水、10μLの1mMリビトール内部標準水溶液、375μLのメタノールおよび750μLのクロロホルムを加えた。パルスボルテックス混合後、サンプルを VWR サーモスタットシェーカー (900 rpm、37 °C) 内で 2 時間インキュベートしました。室温で遠心分離 (10 分、15,000 × g) した後、上部の水相を定量的に清潔な 1.5 µL エッペンドルフチューブに移し、Labconco Centrivap で一晩蒸発乾固させました。残渣を 100 µL 水に溶解し、注射バイアルに移し、LC-MS 分析中 6 °C に保ちました。

LC-MS 分析は、VanGuard カラムに接続された 2.1 × 100 mm Atlantis premier BEH-C18 AX カラム (2.1 × 100、2.5 μm) を使用して実行されました。両方とも Waters (Etten-Leur、オランダ) から購入しました。カラムセットアップは、Ultimate 3000 LC システム (Thermo Scientific、Breda、オランダ) に設置されました。カラム出口は、HESI イオン源を備えた Thermo Scientific Q-Exactive FT 質量分析計に接続されました。 UPLC システムは 250 μL min-1 の流量で動作し、カラムは 30 °C に維持されました。移動相は、それぞれ、水、pH9 (A)、およびアセトニトリル (B) 中の 10 mM 酢酸アンモニウムおよび 0.04(v/v) 水酸化アンモニウムから構成されました。 5 µL のサンプル注入後、システムは 0% B に 1 分間維持され、その後 4 分間 0 ～ 30% B の直線勾配が続きました。その後、勾配は 3 分間で 95% B まで直線的に増加し、2 分間 95% に維持されました。分。次の注入の前に、カラムを 0% B で 6 分間再生しました。すべてのサンプルは 3 回注入されました (3 回の技術的反復)。質量分析データは、m/z 72 ～ 900 のスキャン範囲にわたって取得されました。システムは、-2.5 kV (ネガティブモード) および 120,000 の質量分解能で動作しました。さらなるソース設定は次のとおりでした: 移送管と気化器の温度は 350 °C と 300 °C、シースガスと補助ガスの圧力はそれぞれ 35 と 10 でした。高い質量精度を得るために、各実験の前に質量校正を実行しました。生データファイルは、XCalibur Quan ソフトウェアを使用して処理および分析されました。

画像解析、フローサイトメトリー、メタボロミクス結果の統計解析は、Graphpad Prism 8 を使用して実行されました。最初にデータのガウス分布がシャピロウィルクテストによってテストされ、次にパラメトリック統計またはノンパラメトリック統計が適用されました。統計の詳細は図の凡例で説明されています。

図の凡例に示されているサンプルサイズは、別段の記載がない限り、独立した実験の数を指します。サンプルサイズが技術的反復を指す場合、これは図の凡例で説明されています。メタボロミクスの場合、技術的な複製は繰り返しの測定から得られます。他のすべてのケースでは、技術的複製は個別のサンプルから得られました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成されたすべてのデータがこの記事に含まれています。ソースデータは補足データ 1 (主要な図) および 2 (補足図) として提供されます。トリミングされていない未編集のブロット画像は補足図7に含まれています。

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幹細胞活性レポータープラスミドを共有してくれた HJG Snippert (UMC ユトレヒト) に感謝します。 P53 過剰発現構築物の共有については、SEM van der Horst および HJG Snippert (UMC ユトレヒト)。 W. Frommer (ハインリッヒ・ハイネ大学)、グルコース FRET センサー・プラスミドを共有してくれました。 I. R-スポンジンおよびノギン馴化培地を調製するためのVerlaan (UMC ユトレヒト); 原稿の批判的な読解に対して A. Janssen と J. Lehman に感謝します。この研究は、オランダ癌協会 (KWF 2016-I 10471、KWF 2017-II 11315) によって財政的に支援されました。

分子癌研究、分子医学センター、ユトレヒト大学医療センター、3584 CG、ユトレヒト、オランダ

マーリーズ・C・ルディクハイゼ、シラ・ジェヴァース、グエン・TB・グエン、マーイケ・メルロ、S・カディジェ・シャフィエイ・ロウドバリ、M・カン・グレルソンメス、エドウィン・CA・スティグター、ブーデワイン・MT・バーゲリング、マリア・J・ロドリゲス・コルマン

プリンセス・マキシマ小児腫瘍センター、3584 CS、ユトレヒト、オランダ

ヤルノ・ドロスト & ハンス・クレヴァース

Oncode Institute、ユトレヒト、オランダ

ヤルノ・ドロスト & ハンス・クレヴァース

ヒュブレヒト研究所、オランダ王立芸術科学アカデミー、3584 CT、ユトレヒト、オランダ

ハンスクレヴァーズ & ブーデワイン MT バーガーリング

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概念化、MJRC、MCL、BMTB。方法論と調査、MJRC、MCL、MM、SG、NTBN、および SKSR。メタボロミクス: MCG および ECAS。腫瘍進行オルガノイドモデルの開発：JDおよびHC。原稿執筆、MJRC および MCL。レビューと編集、MJRC および BMTB。資金調達、MJRC、BMTB

マリア・J・ロドリゲス・コールマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Ozgur Sahin と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Maralice Conacci Sorrell と Eve Rogers。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ludikhuize, MC、Gevers, S.、Nguyen、NTB 他グルコース代謝の再配線により、p53欠損/KRASG12D解糖性結腸直腸腫瘍における5-FUの有効性が向上します。 Commun Biol 5、1159 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

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受信日: 2021 年 11 月 26 日

受理日: 2022 年 9 月 30 日

公開日: 2022 年 10 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

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