Moによる生物学的窒素固定の定量化

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22011 (2022) この記事を引用

683 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

標準的なモリブデン、相補的なバナジウムおよび鉄のみのニトロゲナーゼアイソフォームによる生物学的窒素固定 (BNF) は、新たに固定された窒素の主な天然源です。地球規模の窒素循環の制御を理解するには、環境 BNF の原因となるアイソフォームについての知識が必要です。同位体アセチレン還元アッセイ (ISARA) は、アセチレン還元アッセイにおけるエチレンとアセチレン間の炭素安定同位体 (13C/12C) 分別を測定するもので、アイソフォーム特異的な BNF フラックスを定量できる数少ない方法の 1 つです。環境中の BNF 活性が低すぎることが多く、同位体分析に十分なエチレンを生成できないため、古典的な ISARA の適用は困難でした。ここでは、エチレン前濃度とガスクロマトグラフィー燃焼同位体比質量分析 (EPCon-GC-C-IRMS) のインラインカップリングによってエチレン δ13C を測定する高感度方法について説明します。 10% v/v アセチレンを含むサンプルのエチレン要件は、> 500 から約 20 ppmv に減少します (事前のオフラインアセチレン除去では約 2 ppmv)。キャリブレーション誤差を減らして堅牢性を高めるために、単一ニトロゲナーゼアイソフォームのアゾトバクター・ビネランディ変異体および環境サンプルのアッセイは、エチレン生成のための共通のアセチレン源に依存しています。窒素固定活性の低い土壌、落ち葉、朽ちた木材、クリプトガム、およびシロアリに低 BNF 活性 ISARA (LISARA) メソッドを適用すると、ほとんどの種類のサンプルで相補的な BNF が示され、アイソフォーム特異的 BNF の追加研究が必要になります。

窒素 (N) は基本的に生物学的生産性の限界を設定し、おそらく地球規模の環境変化に対する自然生態系の反応を制限します1、2、3。大気中の二窒素 (N2) をアンモニアに変換する原核生物のプロセスである生物学的窒素固定 (BNF) は、世界および地域の窒素収支に対する新たな生物学的に利用可能な窒素の主な生物学的投入です。したがって、熱帯、温帯、高緯度の森林、山地の草地や低木地、さらには底生および外洋の環境を含む多様な生態系において重要な生物地球化学的機能を果たしています4,5。 BNF の原因となる金属酵素であるニトロゲナーゼは、活性部位に存在する遷移金属によって特徴付けられる 3 つの主要なアイソフォームで存在します。標準的なニトロゲナーゼと、「代替」、または最近では「相補的」バナジウム (V) のみと呼ばれるニトロゲナーゼと鉄 ( Fe) のみのニトロゲナーゼ 6,7。 V および Fe のみのニトロゲナーゼは Mo に依存せず、Mo8 の代わりに地殻由来の微量金属である V および Fe をより豊富に含んでいます。

環境BNFに対するさまざまなニトロゲナーゼアイソフォームの寄与を決定することは、生態系BNFの機構制御、特に多量栄養素と生物学的に活性な微量金属の結合した生物地球化学サイクルが人為的摂動にどのように反応するかを理解するために重要です。従来の方法（アセチレン還元アッセイおよび 15N/14N 自然存在量法）に基づく BNF 比率の計算はニトロゲナーゼアイソフォームの影響を受けやすいため 9、10、11、BNF で活性なニトロゲナーゼアイソフォームの帰属が不正確であると、次のように N バジェット推定値が変更される可能性があります。 50% にも達し12,13、生態系 N の状態と管理に影響を与えます。

環境 BNF フラックスの金属特異性は、同位体アセチレン還元アッセイ (ISARA) およびニトロゲナーゼ遺伝子配列分析と組み合わせたエタン収率法によるアイソフォーム特異的フラックス追跡の適用により評価できるようになりました 6、12、13、14。これらのアプローチにより、温帯エバーグレードのマングローブ落葉、温帯沿岸塩性湿地の堆積物、北方シアノリケンに至るまでの多様なサンプルにおいて、非根粒菌 BNF に対する相補的な V および Fe のみのニトロゲナーゼの重要な寄与が特定されました 12、13、15、16。ごく最近では、600 km の北方森林栄養勾配にわたるシアノリケン BNF の研究により、Mo 制限条件下で BNF 投入量の維持における V-ニトロゲナーゼの役割について生態系規模での最初の証拠が提供され 13、「バックアップ」に関する長年保持されてきた仮説が検証されました。もともと実験室研究によって示唆された相補的ニトロゲナーゼの役割17。さらに、相補的 BNF を示唆するアセチレン対窒素還元活性の低い比率 (すなわち、R 比率) が、温帯土壌 9、北方苔 11,18、および腐朽木材 19 で観察されています。さらに、相補的で特徴づけられていないニトロゲナーゼ遺伝子が木材マルチ 20、シロアリの後腸 21、土壌 9、苔 22、およびシアノリケン 23、24 で検出されています。これらの研究は、北方域 18,25,26、温帯および熱帯の森林生物群系 27,28,29,30,31,32,33 における Mo 制限 BNF の例の蓄積と併せて、Mo に依存しない相補的な BNF が世界的な役割を果たす可能性があることを示唆しています。それにもかかわらず、BNF 活性が低いことが多い環境サンプル中の Mo 非依存性 BNF 比率の定量化は、相補的 BNF 帰属のための最も信頼できる方法である ISARA12 が、通常観察されるよりもはるかに高いエチレン収量を必要とするため、困難でした（土壌、コケなど）。、落葉は通常、1 ～ 2 日間のアセチレン削減アッセイのインキュベーションで 300 ppmv 未満のエチレンを生成します。重要な生態系内での相補的な BNF とその制御に関する広範な研究には、ISARA の方法論的な改善が必要です。

ISARA 法は、BNF 活性に関して広く使用されているアセチレン還元アッセイ (ARA) のプロキシに基づいており、アセチレンをエチレンに還元する自然存在量の炭素安定同位体 13C/12C 分別 (13εAR = δ13C アセチレン – δ13C エチレン、ここで δ13C (``) = ( [(13C/12C)サンプル/(13C/12C)標準) − 1] × 1,000 ) を使用して、さまざまなニトロゲナーゼアイソザイムの活性を定量します12。 ARA インキュベーションからのヘッドスペースサンプルは、ガスクロマトグラフ燃焼反応器同位体比質量分析計 (GC-C-IRMS、図 1a) への手動注入によって分析されます。エチレン (C2H4) は、ガスクロマトグラフィーによってヘッドスペース内の他の成分 [通常、二酸化炭素 (CO2)、水 (H2O)、メタン (CH4)、アセチレン (C2H2)] から分離され、燃焼反応器でエチレンが CO2 に変換されます。生成された CO2 の 13C/12C 比の IRMS 測定による。これはエチレンの 13C/12C に相当します。同様のプロセスにより、13C/12C のアセチレンが得られます。現在実装されている方法には、いくつかの技術的な制限と問題が伴います。第一に、分析感度 (つまり、エチレン濃度の単位当たりに得られるシグナルの大きさ) とエチレンの良好なクロマトグラフィー分離 (つまり、他のヘッドスペース成分と重ならない、シャープで明確なピークが得られること) の間にはトレードオフの関係があります。正確で再現性のある分析に必要です。この現象は主に、システムへのサンプル注入条件 (注入量、流量、GC インジェクター内の希釈「分割」比など) に起因します。正確なδ13セチレン測定は、最大注入量約 1 mL に対応するため、ARA 中のエチレン濃度が高い (> 500 ppmv) サンプルが必要です。第 2 に、アセチレン測定 (δ13C アセチレン) には、ピークテーリングやメモリー効果により大きな不確実性が生じることが多く、頻繁な GC カラムコンディショニング (つまり、カラムに蓄積した水、アセチレン、その他の分析対象物を除去するための短時間の温度上昇) と燃焼が必要になります。反応器の酸化能力を再生するために、純粋な O2 を高温で反応器に流し込む反応器酸化。最後に、エチレンおよびアセチレン同位体測定値は、NIST 追跡可能な δ13C 値を備えたエチレン標準が存在しないため、メタン同位体標準を使用して VPDB 国際炭素同位体基準スケールに校正されます。クロマトグラフィーによる分離および燃焼中のメタン標準物質とターゲット分析物であるエチレンおよびアセチレンの間の化学的挙動の偏差は、反復測定で構成される複数のサンプル実行に沿った、および複数のサンプル実行全体にわたるドリフト補正中にバイアスを引き起こす可能性があります。したがって、古典的な ISARA メソッドは比較的時間がかかり、BNF 活性の高いサンプルに限定されます。

10% v/v アセチレンを含む、またはアセチレンを含まないバックグラウンドマトリックス中のエチレンの δ13C 測定の分析方法論 (a) 直接注入 12 を含む古典的な ISARA メソッド、(b) エチレンの事前濃縮とアセチレン除去ステップを追加する EPCon システム、および(c) EPCon にサンプルをロードする前に、アセチレン 34 を除去するためのオプションの化学沈殿。 EPCon の開発と概略図は Weigand et al.35 から引用されています。略語: Ac – アセチレン。

ここでは、窒素固定活性の低いサンプルを対象とした高感度 ISARA メソッド (低 BNF 活性 ISARA、LISARA) について説明します。これには、自動化された方法でサンプル中の Mo 非依存性 BNF 比率の正確な定量化を可能にする、古典的な ISARA メソッドに対する機器的および方法論的な改良が含まれています。この新しい分析設計は、従来の ISARA 分析で使用される市販の GC-C-IRMS システムと、Weigand らによって開発された社内で製造された全自動オンラインガスエチレン前濃縮システム (EPCon) のインターフェイスに依存しています 35。 EPCon は、エチレンとのピーク干渉が最も大きいヘッドスペース成分であるアセチレンを除去し、非ターゲット分子からの分析干渉がほとんどなく、100 万分の 1 レベルでの高精度同位体分析を可能にするレベルまでサンプル中のエチレンを濃縮します。この更新されたメソッドでは、ISARA サンプル要件は、エチレン約 500 ppmv から約 2 ppmv まで減少しました。校正ベースの不確実性を軽減するために、当社は市販の微生物由来の社内エチレン標準物質の使用を提案します。これにより、アセチレン測定の必要性がなくなり、実験室内および実験室間でのより適切な比較が可能になります。環境への適用可能性を実証するために、私たちは LISARA を使用して、木材を食べるシロアリの低活性 BNF と、米国北東部の郊外の森林からの落ち葉、土壌、コケ、地衣類、および朽ちた木のサンプルを調査しました。結果は、さまざまなサンプルにおける有意な相補的 BNF 活性を示唆しています。

従来の ISARA12 の直接注入アプローチにいくつかの変更を加えたものに続き、10% v/v アセチレン中の高エチレン収率 (> 500 ppmv) の ARA サンプルを、Agilent HP-PLOT/ を使用して Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink に手動で注入しました。 Q キャピラリ GC カラム (30 m、内径 = 0.32 mm、ft = 20 μm) と Thermo Scientific Delta V Plus 同位体比質量分析計に接続された燃焼反応器 (GC-C-IRMS、図 1a)。修正には、アセチレンによるメモリー効果を制限するために、GC オーブン内の銀のフェラルを Valcon ポリイミド (グラファイト強化ポリマー) フェラルに置き換えることが含まれます。燃焼反応器は各運転前に純酸素で 1 時間酸化され、反応器の酸化を再生するために測定バッチ間で短時間 (15 分間) シード酸化が実行されました (つまり、エチレン注入約 6 ～ 8 回、アセチレン注入約 4 ～ 6 回ごとに必要)。容量を増加させ、δ13C 値のドリフトを最小限に抑えます。追加の機器設定については、オンラインの補足表 S1a を参照してください。

エチレン濃度が 500 ppmv 未満の ARA サンプルは、Weigand et al.35 に基づいて開発され、社内で製造されたエチレン事前濃縮システムを使用して分析されました (EPCon、図 1b)。 EPCon は、正確にタイミング調整された一連のバルブ、極低温トラップ、ガスクロマトグラフ (GC) を使用して、バックグラウンド成分 (特に水とアセチレン) を除去し、エチレンを濃縮してからエチレンを濃縮する完全自動オンラインガス準備システムです。 GC-C-IRMS。 EPCon は、海水および淡水の硝酸塩中の窒素および酸素同位体を測定するために Weigand ら 35 によって設計された同様の社内システムを改良して開発され 35、36、37 、低濃度エチレン δ13C の測定用に最適化されました。直接の前身 35 との違いには、EPCon のバルブ 4 (図 1 の「V4」) と市販の GC-C-IRMS システムの GC カラムの間の直接接続が含まれ、関連する問題 (例:感度の低下、ピークの広がり）。流量、圧力、バルブおよびトラップのタイミングは、エチレンとアセチレンを効果的に分離するように調整され、アセチレンを検体ストリームから除去し、エチレンを GC-C-IRMS に導入する前に極低温で少量に集中させることができました。機器の詳細な情報と設定については、オンラインで補足メソッド S1 および補足表 S1b-c を参照してください。

エチレン含有量が約 20 ppmv 未満の ISARA サンプルの場合、検体の極端な質量不均衡のため、EPCon システム内でのアセチレンとエチレンの完全な GC 分離は、当社の実験室の作業条件では達成できませんでした。これらのサンプルの EPCon δ13Cetic 分析の前に、アンモニア中で硝酸銀 (AgNO3) を用いたアセチレンの化学沈殿によってサンプルのヘッドスペースからオフラインでアセチレン除去を実行し、炭化銀塩 34 を生成しました (化学沈殿、図 1c)。アンモニア性 AgNO3 溶液 (10 mL 水中 0.5 g AgNO3) を各サンプルに添加しました (0.5 mL AgNO3/10% v/v アセチレンを含む 10 mL ヘッドスペース)。反応が完了したら（約 10 分）、サンプルのヘッドスペースを EPCon 分析用のオートサンプラーバイアルに移し（図 1b）、残りの炭化物塩溶液を中和しました（1 mL の 5 N HCl）。アセチレンが完全に除去されたことは、炎イオン化検出器 (GC-FID) を備えたガスクロマトグラフで分析することによって確認されました。 10% v/v アセチレンを添加した場合と添加しない場合の 2000 ppmv エチレン (タンク EY-4 から) で作成した対照サンプルを使用して、アセチレンの化学的沈殿がδ13セチレン値に及ぼす影響を推定しました (n = 3、表 1)。乾燥時の沈殿生成物である炭化銀塩の反応性が高いことを考慮すると、アセチレン沈殿は細心の注意を払って取り扱う必要があり 34、この研究では必要な場合にのみ実行されました（例、サンプルエチレン < 20 ppmv）。

実行内および長期 (実行間) のサンプル分析間の連続性を確保するために、社内タンク標準として市販のエチレンおよびアセチレンガスタンク (エチレン EY-4、EY-8、アセチレン AY-1、 AY-4、表 1) ドリフト補正と毎日の品質保証チェック用。 IRMS および EPCon のパフォーマンスをテストするための品質管理基準は、サンプルの各バッチを実行する前に分析されました。長時間 (約 30 時間) の実行中に EPCon-GC-C-IRMS によって生成されたすべてのδ13セチレン測定値は、サンプル実行全体を通じて均一な間隔で測定されたドリフト補正標準 (EY-4) と比較して、経時的な機器応答のドリフトが補正されました。ドリフト補正標準間の線形補間を使用します。 2 番目の標準 (EY-8 または EY-4 標準の別のバッチ) を使用して、ドリフト補正プロセスを独立して検証しました。直接注入からのデータは、Zhang et al., 201612 によって記載された古典的な方法に従って処理され、反応器の頻繁なシード酸化によるドリフト補正は必要ありませんでした。品質管理チェック基準の配置に関するサンプル負荷の詳細については、オンラインの補足表 S2 を参照してください。データ処理計算については、オンラインの補足データ S1 を参照してください。

各測定方法 (つまり、直接注入、EPCon、および化学沈殿 + EPCon) について、感度、定量限界、直線性の範囲、日内再現性、および実験室再現性 (Carter and Barwick, 201138 で定義されているとおり) を繰り返し測定して決定しました。社内の主なエチレンタンク規格（EY-4）をさまざまな条件で分析した結果です（表1）。感度は、負荷されたエチレン炭素 (C) の量 (nmol C 単位) に対する IRMS 応答質量 44 シグナル (ボルト秒単位の面積 [Vs]) の線形回帰によって決定されました。直線性の範囲は、1 ～ 6 V の質量 44 ピーク振幅 (典型的な保守的な分析範囲) を得るために GC に直接注入できるか、EPCon オートサンプラーにロードできるエチレン C の最低量と最高量によって定義されました。サンプルは、質量 44 信号の最大 2 V を目標としてロードされました。再現性 (つまり、日内変動) は、EPCon の場合は 26 日間、直接注射の場合は 6 日間にわたる毎日の標準偏差の平均として推定されました。実験室内での再現性は、EPCon の場合は 26 日間、直接注入の場合は 6 日間にわたる毎日の平均 δ13C 測定値の標準偏差を使用して計算されました。

定量限界 (LOQ) は、各方法を使用して測定できる最小エチレン濃度 (ppmv 単位) に基づいて決定されました。エチレン標準およびアセチレンを含まないサンプルに基づく技術 LOQ は、許容される最小ピーク振幅 (質量 44 で 1 V) および各メソッドの最大負荷容量 (直接注入、インジェクターと GC カラムによる制約に従って 1 mL) によって制限されます。ローディング; EPCon および化学沈殿法、オートサンプラーのバイアル容量による制約に従って 20 mL)。 10% マトリックスを含むサンプルの方法論的 LOQ は、システムへのアセチレンの過負荷を回避する最大充填量によって設定され、アセチレンの場合は 0.5 mL、EPCon の場合は 1.5 mL です。化学沈殿を使用した場合の方法論的な LOQ は約 2 ppmv で、炭化カルシウムから生成されたアセチレンに持ち越されるバックグラウンドエチレン濃度がサンプルのアセチレン還元によるエチレンよりも高くなる前の最低サンプル濃度です。

窒素固定に Mo-ニトロゲナーゼのみ (「MoNase」変異体、CA70.139 株) または V-ニトロゲナーゼのみ (「VNase」変異体、CA11.7040) を利用する Azotobacter vinelandii 変異体を、改変バークス培地中で 30 °C で好気的に増殖させました。、４１、１００ｎＭ〜１μＭのＮａＭｏＯ４（株ＣＡ７０．１）またはＮａＶＯ３（株ＣＡ１１．７０）を含む。 CA70.1 は、nif 遺伝子 (Mo-ニトロゲナーゼ) のみを発現する二重遺伝子欠失変異体 (ΔvnfDGK::spc、ΔanfHD70::kan) です。 CA11.70 は、vnf 遺伝子 (V-ニトロゲナーゼ) のみを発現する二重遺伝子欠失変異体 (ΔnifHDK、ΔanfHD70::kan) でもあります。指数相細胞 (OD620nm ~ 0.3 ～ 0.8) をサンプリングして、アセチレン還元アッセイを開始しました。詳細については、オンラインの補足メソッド S2 を参照してください。

サンプルのδ13セチレン値をV-ニトロゲナーゼによるアセチレン還元パーセント（%VNase）に変換するための直接δ13セチレンおよび13εAR（=δ13Cソースアセチレン – δ13セチレン）スケーリング法の概要。直接スケーリング法 1 では、環境サンプルと同じバッチのソースアセチレンが、Mo または VNase のみを発現するアゾトバクター変異体の ARA インキュベーションに使用され、δ13C ソースアセチレンを測定する必要がなくなり、δ13C エチレンのみに基づいて %VNase を計算できるようになります。。 13εAR スケーリング法 12 に従って、異なるバッチのアセチレンをサンプルおよび単一ニトロゲナーゼキャリブレーション (変異体など) ARA に使用できます。 ARA の各バッチの δ13C 源アセチレンの測定値 (方法 2) または推定値 (方法 3) と δ13C エチレンの測定値を使用して 13εAR 値を計算し、次に 13εMo および 13εv との比較によって %VNase に変換します。方程式の詳細については、上記のメソッドセクションおよびオンラインの補足メソッド S5 を参照してください。

自然表面サンプル (コケ、シアノリケン、落葉、表土、朽ちた木材) および BNF 活性の低い木材を食べるシロアリの相補的ニトロゲナーゼ活性を評価しました。サンプルは、2019 年から 2021 年にかけて、ニュージャージー州中央部（先進研究所、ストーニーフォード保護区、パインバレーズ、ウォーターシェッド研究所）およびニューハンプシャー州（ムーシローク山）の森林地帯から収集されました。各サイトで、各サンプルタイプの 3 つのサンプルが収集されました。 1 つ以上のステーション (ステーションごとに 10 m × 10 m、間隔は 500 ～ 1000 m)。サンプルは室温で保存され、収集から 5 日以内に ARA によって評価されました。木材を食べるシロアリ (Zootermopsis 属) は Ward Scientific (https://www.wardsci.com) から入手し、ARA の前に 2 ～ 16 日間管理された実験室生息地内で維持されました。詳細については、オンラインの補足メソッド S3 および補足テーブル S3 を参照してください。

アセチレン低減アッセイ 42 (ARA) は、炭化カルシウムから生成された 10% v/v アセチレンを使用して、アゾトバクター培養物および環境サンプルに対して実施されました。ヘッドスペースのエチレン濃度は GC-FID によってモニタリングされました。 ARA の詳細については、オンラインの補足メソッド S2、S3、および補足表 S3 を参照してください。

アゾトバクター ARA は、20 mm の青色ブチル栓 (Bellco) で密封された 25 ～ 240 mL の血清ボトル内で 30 °C、200 ～ 250 rpm で振盪し、10 体積％の細胞培養物と 90％ v/ の開始ヘッドスペース組成を含有して実施されました。 v 空気および 10% v/v アセチレン。ヘッドスペースガスを、20 mm 青色ブチルストッパー (Bellco) を備えた真空血清バイアル (10 mL) に移し、ヘッドスペースのエチレン濃度が 100 ～ 2200 ppmv (MoNase 株、通常はインキュベーション 4 時間以内) および 50 ppmv に達したら後の IRMS 分析用に保存しました。 –200 ppmv (VNase 株、インキュベーション 6 時間以内)、社内エチレンスケーリング標準 EY-Mo-1 および EY-V-1 が得られます (表 1、図 2)。

野外サンプル ARA は、20 mm の青いブチル栓が取り付けられた金属蓋を備えた 100 ～ 500 mL のガラス製缶詰瓶 (Mason、Ball) で実施されました (落ち葉、土壌、および木材、補足表 S3)。 PTFE/シリコンセプタムが取り付けられたスクリューキャップ付きの30 mLガラスバイアル中（コケ、地衣類、土壌、補足表S3）。または20 mmのブチル栓で密封された15 mL血清バイアル（シロアリ、補足表S3）。対照インキュベーション（アセチレン無添加）は、落葉、土壌、朽ちかけた木材（ムーシローク山、パイン・バレンズ）、コケおよび地衣類（ムーシローク山）、およびシロアリのサンプルを用いて実行され、アセチレンの減少とは無関係に自然の内因性エチレン生成を評価しました。環境サンプルの ARA インキュベーション時間は、少なくとも 20 ppmv エチレンを取得することを目標として、エチレン生成速度に応じて約 2 から 300 時間まで変化しました (補足表 S3)。 ARA インキュベーションのサンプル重量は、サンプルの入手可能性と推定エチレン生成速度により変動し、場所とサンプルの種類ごとに補足表 S3 にリストされています。 ARA ヘッドスペースをサブサンプリング (≤ 3 mL) して GC-FID によるエチレン濃度を測定し、残りのヘッドスペースを後の同位体分析のために真空密閉バイアル (10 mL) に移しました。

BNF 活性が低いため、Δ13 セチレンは、10% v/v ソースアセチレンによって ARA に持ち込まれたバックグラウンドエチレン (約 2 ppmv) の同位体影響について補正されました (オンラインの補足方法 S4、式 S1 を参照)。エチレン生成量が 20 ppmv 未満の ARA サンプルにはバックグラウンド補正が必要でした。バックグラウンドのエチレンの同位体の影響により、5 ppmv 未満のエチレンを生成するサンプルからはニトロゲナーゼに関する定量的な情報を得ることができませんでした。エチレン生成量が 5000 ppmv (つまり、アセチレン濃度の 5%) を超える ARA の場合、δ13セチレンもレイリー分別用に補正されました 12,43。

3つの方法のうちの1つ（図2）を使用して、Δ13CエチレンおよびΔ13Cアセチレンを使用して、ARAにおけるアセチレン還元に対する相補的ニトロゲナーゼの寄与を（％VNaseまたは％FeNaseとして）定量しました。使用されるスケーリング方法は、サンプルの入手可能性およびクロマトグラフィーおよび燃焼における技術的困難を考慮して、ソースδ13C アセチレン値の正確な測定が達成可能かどうかに依存していました。 EPCon-GC-IRMS を使用してδ13セチレンを測定しました。すべてのδ13C アセチレン測定は、直接注入アプローチを使用して行われました。詳しい計算の詳細については、オンラインで補足メソッド S5、補足テーブル S4、および補足データ S1 を参照してください。

方法 1 - δ13C アセチレンの測定の必要性を回避する直接スケーリングアプローチ (図 2) を使用して、MoNase で実行される一連のキャリブレーション ARA として環境サンプル ARA にアセチレンストックの同じ供給源が使用された場合に、相補的ニトロナーゼの寄与を計算しました。およびアゾトバクター・ビネランディのＶＮａｓｅ株。環境サンプル ARA 中の測定されたδ13セチレンは、MoNase および VNase アゾトバクターキャリブレーション ARA によってそれぞれ生成された 0% および 100% の VNase 活性を診断するエンドメンバーのδ13 セチレン値 (例、エチレンスケーリング標準、表 1、図 2) を使用して %VNase に変換されます (オンラインの補足メソッド、S4、式 S3 を参照してください)。アゾトバクター ARA のセットアップと分析の詳細については、オンラインの補足メソッド S2 を参照してください。

サンプル ARA で使用されたソースアセチレンストックがアゾトバクターキャリブレーション ARA で処理されなかった場合、古典的な ISARA アプローチ 12 (図 2、方法 2 および 3) を使用して相補的ニトロゲナーゼの寄与を定量しました。これには、同位体変動を説明するためにサンプル δ13C アセチレンとδ13 セチレンの両方の知識が必要です。 13εAR（= δ13Cアセチレン – δ13Cエチレン）の計算におけるさまざまなアセチレンストックにおける。

方法 2 - 直接注入法で測定したサンプルおよびアゾトバクター ARA で使用したさまざまなアセチレンストックの δ13C アセチレンをサンプル δ13Cエチレンとともに使用して 13εAR を計算し、続いてアゾトバクターおよびその他のジアゾトロフスの 13εV および 13εMo を使用して %VNase スケールに校正しました。 Rhodopseudomonas palustris および Anabaena variabilis (図 2、補足方法 S5、補足表 S4、補足データ S1; Zhang et al., 201612 から修正された計算)。

方法 3 - ARA 内のアセチレンの特定のストックについて直接注入による δ13C アセチレンの正確な測定が不可能な場合、過去 4 年間に炭化カルシウムから生成された 7 つの異なるアセチレンバッチのδ13C アセチレンの平均と標準偏差を使用しました (δ13C アセチレン = 14.9 ± 0.9 ``、n = 8; 13εAR 計算における補足図 S1; 式 S5)。 %VNase は、方法 2 と同様に、アゾトバクターおよび他のジアゾ栄養菌からの 13εV および 13εMo 値を使用して計算されました (図 2、補足方法 S5、補足表 S4、補足データ S1)。

A. vinelandii Fe-only ニトロゲナーゼ株 (RP1.1144、「FeNase」変異体) の不安定な増殖により、Azotobacter に基づく %FeNase の計算ができなくなりました。 %FeNase の計算 (図 2、補足方法 S5、表 S4、データ S1) は、ARA の FeNase12 のみを使用して Rhodopseudomonas palustris から EPCon から導出された 13εFe = 5.2 ± 0.7 `` (sd) を使用しました。 13εFe < 13εV < 13εMo12 であるため、顕著な FeNase 活性は %VNase 値 > 100% につながる可能性があります (つまり、100% FeNase は約 140% VNase に相当します。補足表 S4)。 %FeNase スケールの推定不確実性は最大でも 20% です。

N2 固定に対する相補的なニトロゲナーゼの寄与およびアイソフォーム調整された総 N2 固定率は、AR に対する %VNase または %FeNase の寄与 (上記を参照) と、各ニトロゲナーゼの N2 固定に対する AR の割合を指定する R 比 (例: RMoNase = 4、 RVNase = 2、RFeNase = 0.5)12.

GC-C-IRMS によるδ13セチレンの測定感度は、EPCon ペリフェラルを追加すると、直接注入よりも約 40 倍高くなります (4.3 vs. 0.1 Vs nmolC-1、表 1)。

GC-C-IRMS へのオンカラム導入前にアセチレンを除去し、エチレンを凝縮することにより、EPCon-GC-C-IRMS システムはわずか 1.1 nmol C エチレンで信頼性の高いδ13 セチレン測定を生成しますが、直接注入法では 23.6 nmol 以上のエチレンが必要です。 nmol C。GC-C-IRMS サンプル入口ポート (≤ 1 mL) に比べて EPCon オートサンプラー (20 mL) の許容容積が大きくなり、感度が向上するため、バックグラウンドのアセチレンが存在しない場合でも 0.7 ppmv 以上のエチレンを含むガスの測定が可能になります。バックグラウンドが 10% v/v アセチレンのサンプル (典型的な ARA サンプル) の最小エチレン濃度は 9 ppmv で、EPCon 分析の前にバックグラウンドのアセチレンが化学沈殿によって除去される場合は 2 ppmv です。控えめに見て、ARA サンプルの最小作業エチレン濃度は 500 ppmv (直接注入)、20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS)、および 5 ppmv (化学沈殿 + EPCon-GC-C-IRMS) です。直接注入 GC-C-IRMS メソッドの感度が低いのは、サンプルインジェクターポート内で高い分割比 (40:1 – サンプルとサンプルから排出される He キャリアガス流の比率) を使用する必要があることが部分的に原因です。キャピラリ GC カラムを使用してエチレン (約数～数百 ppmv) とアセチレン (約 100,000 ppmv) のピークを完全に分離します。

日内ドリフト補正（2 ～ 4 パーセント）のために、〜 30 時間の実行（〜 75 のサンプルと〜 45 の品質管理、オンラインの補足表 S2 の典型的な実行設定）にわたって、内部標準として一定のδ13C 組成を持つタンクエチレンを使用しました。 -範囲;補足図S3）反応器の経時劣化（頻繁なシード酸化なし）によって引き起こされ、複数日にわたる結果の比較可能性が保証されます（長期sd = 0.2パーセント、表1）。タンク EY-4 からのδ13セチレンの再現性とラボ内での再現性は、直接注入法と EPCon-GC-C-IRMS 法の両方で同様です (再現性はそれぞれ 0.11 および 0.20 、再現性は 0.27 および 0.17 パーセント)。 EPCon システムからのδ13 セチレンの高い再現性に加えて、すべてのエチレン標準に対する EPCon および直接注入法によって得られたδ13 セチレン値はよく一致していました (表 1)。 EPCon システムは結果の精度に実質的なバイアスを導入しておらず、EPCon データは直接注入法を使用して得られた公表された結果と直接比較できると結論付けています 12、13、15、16。

エチレンおよびアセチレンのδ13C 測定の不確実性とバイアスのいくつかの原因は、タンク標準を使用して特定されました。ソフトウェアによって提案された自動積分は、おそらく燃焼反応器に関連する 12C と比較して 13C の大幅なテーリングが原因で、標準の期待される δ13C 値を過小評価することがありました（補足図 S3）。この現象は、おそらくアセチレンと燃焼反応器金属 (CuO、NiO、Pt) および GC カラム自体の間のより強い相互作用のため、δ13C アセチレン分析でより顕著でした。 δ13セチレン分析中に明らかな過剰なアセチレン（つまり、質量44のピーク振幅> 5 V）は、ピークテーリングの問題を悪化させ、δ13セチレンの精度の低下（最大5パーセント）を引き起こしました。過剰なアセチレンが誤って GC-C-IRMS に導入された場合 (EPCon 内の排気が不完全な場合など)、GC カラムと燃焼反応器の再調整が必要でした。

私たちは、環境サンプル中に一般的に存在するさまざまなガスと、ARA 中に生成されるバックグラウンドガスの干渉をテストしました。 EPCon システムは、ほとんどのバックグラウンドガス (空気/N2、CH4、CO2、アセチレン) を除去し、エチレンとのピーク干渉を最小限に抑えます (表 1)。 ARA12,14 のニトロゲナーゼによってエチレンの 3% 未満の割合で生成されるエタンのみが EPCon に保持されますが、GC-C-IRMS ではエタンとエチレンのピークが十分に分離されているため、エチレンとの同位体干渉は最小限に抑えられます。。

サンプル ARA に対する EPCon-GC-C-IRMS によるδ13C-IRMS および直接注入 GC-C-IRMS によるδ13C アセチレンの測定は、低 BNF 活性同位体アセチレン還元アッセイ法 (LISARA) の基礎を形成します。私たちは、ARA 中のエチレン収量が広範囲 (5 ～ 1000 ppmv) である多様な環境サンプル (米国北東部の現場で採取された土壌、落ち葉、朽ちた木材、コケ、およびシアノリケン、および実験室で飼育された木材を餌とするシロアリ) に LISARA を適用しました。。 3 つの計算方法 (図 2) のうち 1 つ (または複数) を使用して、アセチレン還元に対する %VNase (または %FeNase) の寄与 (AR; 方法 1、2、3、図 2 および 3) を取得しました。

古典的な ISARA 法 12 では、13εAR、ARA のアセチレン還元による炭素安定同位体分別 (つまり、δ13C アセチレン – δ13C エチレン)、および各ニトロゲナーゼアイソフォーム (13εMo、13εV、および 13εFe、補足表 S4) による AR の診断 13εAR 値を使用して、 %VNase または %FeNase (図 2 および 3)。アセチレン δ13C 測定を回避するために、アセチレン δ13C 測定は一般的にエチレンの 3 ～ 4 倍高い不確実性があり (表 1)、システム内に残留して頻繁な GC-C 再コンディショニングが必要になることが多いため、デルタ 13C 測定では、デルタ 13C 測定のみに基づいて相補的ニトロゲナーゼの寄与を計算する直接スケーリングアプローチを開発しました。 δ13セチレンについて（図2、方法1）。これは、環境サンプルARA（δ13Cサンプル）内で使用されるアセチレンストックの一般的な供給源から生成されたδ13セチレンと、アゾトバクター・ビネランディのMoNaseおよびVNase株を使用して実行された同位体校正ARAのセット（δ13CMoおよびδ13CV、図2、補足方法S5）を比較することによって達成されます。。 FeNase 株 RP1.1144 の増殖が不安定であったため、直接スケーリングアプローチによって A. vinelandii を用いた %FeNase 計算の δ13CFe 値を決定することはできませんでした。

理想的には、方法 1 (直接スケーリングアプローチ) を使用して、すべてのサンプルの同位体値を%相補的ニトロゲナーゼにスケーリングします。これは、不確実性が最小限に抑えられるためです。直接スケーリング標準および関連プロトコルが開発される前に分析されたサンプルに適用された方法 2 および 3 は、直接スケーリング手順を完了できなかった場合（例、アセチレン不足、アゾトバクター ARA 実験の失敗など）にも使用できます。方法 3 は最も高い不確実性を伴いますが、BNF に対する相補的ニトロゲナーゼの寄与を推定する最速の手段となります。

シアノリケンを除いて、すべてのサンプルタイプは相補的ニトロゲナーゼ活性と一致する同位体シグナルを示しました（図 3、凡例の要約統計量、140% VNase が 100% FeNase に相当することに注意してください。上記の方法を参照）。落葉およびコケサンプル中の AR に対する相補的ニトロゲナーゼの潜在的な寄与は、195％ VNase を含む 1 つの落葉サンプルを除いて、0 ～ 100％ VNase の範囲でした。腐朽木材およびシロアリにおける潜在的な寄与は、VNase の 40 ～ 160% の範囲でした。土壌データも VNase が 30 ～ 180% と非常にばらつきがあります。分析された 114 個のサンプルのうちのいくつかは、VNase が約 200% を超える異常値でした (コケ 1 個、土壌サンプル 2 個、データは図 3 には示されていません)。これは、ストッパーの漏れによるガスの同位体分別が原因であると考えられます。

δ13セチレン値の直接スケーリングによって定量化された、環境サンプルの AR に対する VNase 寄与率の推定不確実性は、13εAR ベースの方法による不確実性よりも低くなります。直接スケーリング方法 1 では約 9%、13εAR 方法 2 では約 15%、13εAR 方法 2 では約 20% 13εAR メソッド 3 (図 3、補足メソッド S5、補足データ S1)。 δ 13 セチレンを %VNase に直接スケーリングすることで得られる精度の向上 (方法 1) により、δ 13 セチレン測定に伴う不確実性が回避されます。これは図 3 で明らかであり、単一ニトロゲナーゼ変異体の %VNase 値 (つまり、図 3 の Av MoNase および Av VNase の値) は、方法 1 (サンプルと変異体の δ13Cetic 値の直接スケーリングを使用) の方がより緊密にクラスター化されています。 ) 方法 2 および 3 のものよりも異なります (明示的な 13εAR 値を使用します)。単一ニトロゲナーゼ培養 ARA のほとんどの相補的ニトロゲナーゼ属性は、期待値の 15% 以内に集まります (つまり、A. vinelandii MoNase 株では 0% VNase、A. vinelandii VNase 株では 100% VNase、R では 100% FeNase = 140% VNase)。 palustris FeNase 株）しかしながら、いくつかのサンプルは約 20 ～ 30% の誤差を示します（例、A. vinelandii VNase 株では約 130% VNase、A. vinelandii MoNase 株では約 20% VNase）。 Rhodopseudomonas palustris FeNase の 13εAR および 13εFe を使用して定量化された %FeNase の不確実性は、約 15 ～ 20% です (補足方法 S6、補足データ S1)。したがって、相補的ニトロゲナーゼ寄与の定量化に最高の精度 (非常に低い BNF 活性) を必要とするサンプルでは、δ13 セチレンベースの直接スケーリング法 (方法 1) を使用する必要があります。

BNF 活性が低い環境サンプルおよびジアゾトロフ培養物を利用した単一ニトロゲナーゼにおける ARA 内のアセチレン還元に対する相補的なニトロゲナーゼの寄与 (%VNase または %FeNase として)。サンプル概要統計 (平均 ± sd %VNase、範囲 %VNase、サンプル数): 落ち葉 (32.4% ± 45.4%、- 19.9 ～ 195.4%、30)、地衣類 (- 0.8% ± 4.7%、- 8.9 ～ 5.6) %、6)、コケ (65.3% ± 37.9%、− 14.5 ～ 123.0%、31)、土壌 (123.9% ± 37.2%、25.4 ～ 177.8%、21)、シロアリ (130.1% ± 22.0%、104.8 ～ 156.6%) 、7)、および朽ちた木材 (125.9% ± 32.6%、40.6 ～ 167.6%、43)。略語は次のとおりです: Av MoNase – Azotobacter vinelandii MoNase 株、Av VNase – A. vinelandii VNase 株、および Rp FeNase – Rhodopseudomonas palustris FeNase 株。スケーリングと不確実性の計算の詳細については、オンラインの補足メソッド S5 および S6、および補足データ S1 を参照してください。

不確実性を考慮すると、%VNase スケールで > 160%、%FeNase スケールで > 120% の ARA サンプルは、BNF とは無関係のプロセス (例: 自然な内因性エチレン循環 - 生産または消費、ストッパーからのガス漏れ) によって強い影響を受けているはずです。 BNF に関連しない分画は、落葉 (n = 1)、コケ (n = 1)、土壌 (n = 4)、朽ちた木材 (n = 2) の特定のサンプルで観察された 160% を超える VNase 値を説明できる可能性があります。

GC-C-IRMS (表 1) と比較して EPCon-GC-C-IRMS システムの感度が向上すると、サンプルのエチレン要件が約 120 ～ 450 倍低くなります (サンプル中にアセチレンが存在するかどうかによって異なります、表 1)。重要なのは、ARA サンプルの EPCon 分析では、GC カラムと燃焼反応器の ARA サンプル中のアセチレンへの曝露が制限されるため、GC カラムと反応器の性能のアセチレン劣化により分析出力に大きな変動が生じることです。 δ13C が一定のタンクガスに基づく日内ドリフト補正と組み合わせることで、EPCon システムを使用すると、より再現性の高い結果が得られ、リアクターの酸化回数が制限され、リアクターとキャピラリー GC カラムの寿命が延び、結果として時間と長さが短縮されます。 -IRMS 分析ごとの期間コスト。さらに、これらの機器および分析の改善により、再現性を損なうことなく、分析実行および実験全体ではるかに低いエチレン濃度で同等の結果が保証されます。その結果、GC-C-IRMS への直接注入を使用した場合、1 人が 7 ～ 10 日間フルタイムで作業するのと比較して、EPCon システムでは 30 時間の実行で 120 件のδ13 セチレン測定を自動化された方法で達成できます。

LISARA メソッドは、地球環境における相補的ニトロゲナーゼによる窒素固定の研究に必要な重要な分析的改良です。 EPCon-GC-C-IRMS 分析アップグレードにより、事実上あらゆるエチレン濃度で ARA サンプル中のエチレンの信頼性と再現性のある同位体特性評価が可能になります。実際には、EPCon によるアセチレン除去能力に達する前に、エチレン濃度が 20 ppmv 程度のサンプルでも日常的に測定できます (図 1)。非常に低収率の ARA サンプル (5 ～ 20 ppmv エチレン) も、化学沈殿を使用してヘッドスペースからアセチレンを完全に除去した後、EPCon システムで測定できます (「方法」セクションを参照)。ただし、ARA に使用されるアセチレンにキャリーオーバーされたバックグラウンドエチレンの存在と、潜在的な自然内因性エチレン生成 (つまり、BNF とは無関係) が δ13 セチレン値に影響を与える可能性があり、LISARA を使用して評価した非常に低い BNF 活性サンプルにおける相補的ニトロゲナーゼの寄与の解釈が複雑になります。

LISARA 分析からのδ 13 セチレンのみに基づいて相補的ニトロゲナーゼの寄与を計算する直接スケーリングアプローチの開発により、エチレン濃度 > 500 ppmv の必要性やδ 13 C アセチレン測定の要件など、従来の ISARA に関連するいくつかの制限が回避されます。さらに、ARA サンプルのヘッドスペースからアセチレンを完全に除去するオフライン沈殿ステップにより、微生物学または湿式化学の研究室が、サンプルからのエチレンの ISARA 分析と、同じソースアセチレンを使用して実行される単一ニトロゲナーゼの校正 ARA を、δ 13 セチレンの他の安定同位体分析研究室に委託することが可能になります。測定。複数の要因（GC カラムの種類や酸化反応器の状態など）が δ13C 絶対値に影響を与える可能性があるため、研究グループ間での δ13C 絶対値の比較可能性は異なり、評価が難しいことに注意してください。このため、単一ニトロゲナーゼキャリブレーション ARA と環境サンプルの同時分析が特に重要になります。

EPCon システムは、相補的ニトロゲナーゼの研究以外にも、植物生物学などの他の分野にも応用できます。例えば、ストレス反応や種子の発芽に関与する植物ホルモンであるエチレン(土壌細菌や植物など)の内因的に生成されるエチレンの同位体組成をEPConで分析することは、その発生源を特定し、複雑な土壌環境におけるその循環を追跡するのに役立つ可能性がある。

LISARAを使用して特徴付けられた多様な陸生サンプルのうち、6種類のサンプルのうち5種類は、BNF活性に対する相補的ニトロゲナーゼのある程度の寄与と一致するδ13セチレン値を示しました（図3）。これらの結果は、陸上生態系における広範な相補的ニトロゲナーゼ活性を示唆する証拠を増やすものである。北方林のシアノリケン種ペルティゲラに関する以前の研究では、高レベルの相補的ニトロゲナーゼ活性が明らかになりましたが 13 、米国北東部の温帯で収集された同属のサンプルでは VNase 活性の証拠は見つかりませんでした（図 3、地衣類）。このシアノリケン属における相補的なニトロゲナーゼ活性は、主に大気の沈着を反映する葉状地衣中のモリブデンの量によって制御されることがわかっています（Mo 葉状体含有量 < 300 µgMo.gdry_lichen−1）13。温帯北東部 US46 では大気中の Mo の堆積速度が高いため、これらの地衣類サンプルに十分な Mo が供給され、相補的なニトロゲナーゼ BNF の必要性がなくなる可能性があります。

ここで北東部の落ち葉、土壌、腐朽木材サンプル、および木材を食べるシロアリで観察された一貫した相補的ニトロゲナーゼ活性は、Moが豊富な大気中の沈着とより直接的に関係しているシアノリケンやコケとは異なり、BNFに対する異なるより複雑なMo制御を反映している可能性があります。。おそらく、生物レベルの金属管理戦略 47 と、Mo の生物学的利用能を調節する可能性があるジアゾ栄養細胞周囲の環境の物理化学的特性の違いを反映して、ジアゾ栄養生物間の Mo 要件に違いが存在する可能性があります。たとえば、サンプル中の強い Mo 結合能力 (カテコール部分) を持つ特定の有機物 (カテコール部分) のレベルが高いと、Mo BNF の総 Mo 要件が高くなり、サンプル全体の Mo と相補的ニトロゲナーゼの関係に影響を与える可能性があります 49。まとめると、我々の結果は、多くの一般的なサンプルタイプにおける相補的BNFとそのコントロールに関するより詳細な研究の必要性を強調しています。

非常に低い活性（ARA で生成されるエチレンが 20 ppmv 未満）の環境サンプル中の相補的ニトロゲナーゼを定量する場合、ソースアセチレン中のバックグラウンドエチレンの存在（炭化カルシウムからの 10% v/v アセチレンあたり約 2 ppmv エチレン）が依然として課題となっています。原料アセチレン中のバックグラウンドエチレンの同位体シグナルは、現在の EPCon メソッドを使用して簡単に決定できますが、大きなばらつきがあります (8.4 ± 1.9 パーセント、n = 8 アセチレンバッチ)。バックグラウンドエチレンの同位体補正は、10 ～ 20 ppmv のエチレン収量を含む ARA 内では精度と精度に大きな損失は生じませんが、エチレンが 10 ppmv 未満のサンプルでは不確実性が大幅に増加します。したがって、LISARA メソッドは、2 ～ 5 ppmv エチレンを含むサンプルの相補的ニトロゲナーゼに関する定性的な情報しか提供できません。

環境サンプルを調査する場合、土壌細菌や植物による内在性エチレンの自然循環も、相補的ニトロゲナーゼ寄与の定量化を妨げる可能性があります (Hendrickson 198950 およびその参考文献を参照)。低酸素条件はエチレンの生成に有利であり、エチレンの酸化を阻害するため 50、長時間のインキュベーションはこの現象を増加させる可能性があります。この研究では、「アセチレン無添加」対照サンプル 93 個のうち 12 個で、エチレンの有意な内因性生成 (つまり、特定のサンプルの種類および場所で ARA 生成エチレン濃度の > 5%) が観察されました。内因性エチレンを含む 12 個のサンプルすべてを 290 ～ 300 時間インキュベートしました (27 個のサンプルが同じ時間インキュベートされました)。 165 ～ 175 時間インキュベートした 27 個のサンプルの別のバッチでは、内因性エチレン生成の兆候は示されませんでした。アセチレンはエチレンの酸化を阻害することが報告されているため、「アセチレン無添加」対照サンプルは、エチレン収率が非常に低い（< 20 ppmv）ARA における内因性エチレン生成を評価するには不十分である可能性があります50。したがって、ISARA または LISARA 調査を実施する場合、理想的には 60 時間未満サンプルをインキュベートすることをお勧めします。全体として、インキュベーション中のサンプルからの内因性エチレン生成率が低く（補足表S3）、4つのサイト、2年間、およびさまざまなインキュベーション時間（2〜300時間）にわたって各サンプルタイプで得られた同位体シグネチャー間の類似性は、自然なエチレン生成率を示しています。エチレン循環は、報告された結果に最小限の影響を与えます。

ARA からの非常に低収率のエチレンサンプルの LISARA 分析には依然として限界があるにもかかわらず、当社の更新された分析手順と方法論により、ほとんどの N2 固定サンプルにおける相補的ニトロゲナーゼの寄与と環境制御の調査が可能になりました。 LISARA メソッドは、アセチレン測定に関連する不確実性とバイアスを軽減し、純粋培養および高収量生物に対する ISARA メソッドのより広範な使用を可能にします。最後に、米国北東部のいくつかの温帯生態系における一般的なサンプルタイプに関する我々の研究は、陸上生態系における窒素と微量金属の循環に対する相補的ニトロゲナーゼの生態学的重要性についてのさらなる証拠を提供する。私たちの結果が示唆するように、寄与におけるサンプル固有の違いは、自然環境におけるアイソザイム特異的ニトロゲナーゼの制御についてのさらなる調査を必要とします。

ここに示されているすべてのデータは、補足情報 1 (方法 S1 ～ S6、図 S1 ～ S3、表 S1 ～ S5 を含む) および補足データ S1 でオンラインで見つけることができます。

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私たちは、ウォーターシェッド研究所 (https://thewatershed.org)、炭素緩和イニシアチブ (プリンストンハイメドウズ環境研究所から XZ へ)、タトル基金 (プリンストン地球科学局から XZ)、NSF EAR 助成金 1631814 (へXZ)、およびサイモンズ財団ライフサイエンス研究博士研究員フェローシップ (RD へ)。ウォーターシェッド研究所、ラトガース・パインランド・フィールド・ステーション、プリンストン大学ストーニー・フォード生態学研究センター、高等研究所、ダートマス・カレッジ・マウント・マーティンの協力者に感謝します。野外サンプルへの許可とアクセスに関するムーシローク諮問委員会。 Katja Luxem と Linta Reji がフィールドワークを支援し、Anne Kraepiel、F. Morel、JP Bellenger、および Zhang 研究室のメンバー全員がディスカッションに協力してくれました。

シャノン J. ヘインズとロマンダルナジューの著者も同様に貢献しました。

プリンストン大学地球科学部、Guyot Hall、プリンストン、ニュージャージー州、08544、米国

シャノン・J・ヘインズ、ロマン・ダルナジュー、ウナ・ハン、セルゲイ・オレイニク、シンニン・チャン

ハイメドウ環境研究所、プリンストン大学、Guyot Hall、プリンストン、ニュージャージー州、08544、米国

エズラ・ジンブル & シンニン・チャン

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SJH、RD、XZ が原稿本文を書きました。 SJH と RD が図を作成しました。 SO は、この研究で使用された EPCon 機器を構築しました。 SH は RD、SO、XZ の貢献を得て方法論開発を主導し、SJH、RD、EH、EZ はフィールドサンプルを収集し、データ収集に貢献しました。 SJH、RD、EH がデータ分析を実施しました。 XZ は技術的な専門知識、プロジェクトの指導、財政的サポートを提供しました。著者全員が原稿をレビューしました。

Shannon J. Haynes または Xinning Zhang への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Haynes、SJ、Darnajoux、R.、Han、E. 他窒素固定活性の低い環境サンプルにおける、Mo 非依存性の相補的ニトロゲナーゼによる生物学的窒素固定の定量化。 Sci Rep 12、2011 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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受信日: 2022 年 8 月 22 日

受理日: 2022 年 11 月 22 日

公開日: 2022 年 12 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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