園芸バイオマスの生分解におけるリグニンモノマー含有量とメトキシ基の水素安定同位体比の変動

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8734 (2022) この記事を引用

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植物細胞の高度に重合した有機成分であるリグニンは、最も分解が難しい芳香物質の 1 つです。 温和な条件下での選択的生分解は有望な方法ですが、リグノセルロースの生分解中のリグニンモノマーの動的な変化は完全には理解されていません。 本研究では、リグニンモノマー含有量、モノマー比、リグニンメトキシ基の安定水素同位体比（δ2HLM）に基づいて、異なる微生物接種下でのリグニン分解の差異を評価しました。 分解中の重量損失とリグノセルロース成分の純損失は、真菌接種により劇的に改善されました。 メトキシ基を 2 つ含むシリンギル モノリグノール (S-リグニン) は、メトキシ基を 1 つだけ含むグアヤシル (G-リグニン) よりも分解が困難でした。 シュードモナス・マンデリとアスペルギルス・フミガタスの共培養では、G/S比が最も大きく減少しましたが、真菌接種内で濃縮が行われたにもかかわらず、δ2HLM値は3つの生分解実験間で有意な差はありませんでした。 生分解の初期段階におけるδ2HLM 値の変動は、主に落ち葉に由来するペクチン多糖類 (別のメトキシ供与体) の損失に関連している可能性があります。 全体として、3 つの分解システムで G/S 比が減少したにもかかわらず、相対的な δ2HLM シグナルは保存されました。 それにもかかわらず、生物地球化学サイクルのバイオマーカーとしてのリグニンδ2HLMの詳細については、さらに調査する必要があります。

世界的な都市化の急速な拡大に伴い、庭園バイオマスは有機固形廃棄物の主要な構成要素になりつつあります1。 しかし、その無制限の廃棄は、潜在的に重要な資源（すなわち、有機物）を浪費し、潜在的には環境汚染源にさえなり得る2。 堆肥化を含む生分解は、商業用途や生態学的価値のある化学物質や栄養素を効率的に回収しながら、このバイオマスを処分する方法として特に注目を集めています3,4。 研究者らは、制御された条件または自然条件下でこのバイオマスを生分解すると、リグノセルロース系物質をうまく分解し、異なる代謝経路を通じて作用する複数の微生物酵素によって潜在的に有用な代替有機産物の生産を可能にすることを示しました。 それにもかかわらず、高分子ポリマーの相対的な疎水性と芳香族構造の抗菌特性により、リグニンの解重合は生物変換中の特別な課題です7、8。

2 番目に豊富な生体高分子であるリグニンは、主に 3 つの 4-ヒドロキシフェニルプロパノイド単位、グアヤシル モノリグノール (G-リグニン)、シリンギル モノリグノール (S-リグニン)、および少量の p-ヒドロキシフェニル モノリグノール (H-リグニン) で構成されています。対応する割合は植物や組織の種類によって異なります。 植物では、これらの芳香族モノマーはアリールエーテル、ビフェニルエーテル、レジノール、フェニルクマラン、ジフェニル結合を介して高度に相互結合しているため、これらの分子の強度と剛性が高まり、微生物の酵素や化学的加水分解による分解がより困難になります9。 さらに、リグニンの成分には酵素加水分解のための複数の切断部位と、非特異的フリーラジカルに対する高い酸化電位があるため、生分解は依然としてリグニンの解重合において効率的で費用対効果が高く、環境に優しいアプローチです10,11。 リグニンの酵素加水分解の複雑な生化学プロセスは、不均一な芳香族炭化水素を形成する分解から始まり、その後、中心的な炭素代謝によって消費されます12。 一般に、ラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼなどのこれらのリグニン分解酵素（細胞外オキシダーゼ）は、主に真菌や一部の細菌によって分泌されます 13,14。 ほとんどの研究は、リグニン分解微生物を同定し、多酵素活性の発現を特徴付けるためのスクリーニングに焦点を当てている。 しかし、さまざまな微生物によるリグニン分解の効率に関する研究は無視されてきました15。

リグニンの解重合中に起こる化学変化に関するこれまでの研究では、フェニルプロパノイド構造のメタ位 (3 位と 5 位) に 2 つのメトキシ (OCH3) 基を持つモノリグノール S-リグニンは、G-リグニンよりも解重合が難しいことが示されています。リグニン (OCH3 基を 1 つ持つ) および H-リグニン (OCH3 基を持たない)16、17、18。 これは主に、カフェ酸 O-メチルトランスフェラーゼ、カフェオイル CoA O-メチルトランスフェラーゼ、またはその両方を介したコニフェリル アルコールおよびシナピル アルコールの不可逆的なメチル化 (3/5-O-メチル化) によるものであり、芳香族炭化水素の異性化とは異なります。モノリグノール生合成中のプロパン側鎖の結合9。 したがって、これらの安定な OCH3 基は、リグニンモノマーの構造の違いの化学マーカーであるだけでなく、多数の有機化合物の注目すべき前駆体でもあります 19。 現在まで、リグニンのメトキシ基は、CH 結合の安定性と、リグニンの水素および炭素の安定同位体 (δ2HLM およびδ13CLM) により、同位体生物地球化学、生態気候学、および有機物の起源の証明の研究に広く使用されてきました。源水または有機代謝産物からの水素および炭素原子と交換しませんでした20、21、22、23、24。

植物材料の δ2HLM 値は、リグニン生合成からの主要な兆候と局所的な沈殿の δ2H 組成 (δ2HPre) を記録することが示されています 21。 これは、植物 δ2HLM と降水量 δ2HPre の間の強力な同位体分別 (εapp = − 216 ± 19 mUr) によるものであり、中緯度地域の気温によって制御されます 25,26。 δ2HLM 値の研究のほとんどは、古気候 27,28,29,30 の再構築、生物地球化学プロセスの区別 20,22、および有機物の地理的起源の追跡 31,32 にそれらを適用しています。 しかし、植物材料の分解を研究するためのδ2HLM の分析応用はほとんど報告されていません。 最近の研究では、有機物のメトキシ基含有量の分析とそのδ2HLMおよびδ13CLM値を組み合わせて、同位体の信頼性に対する植物のリターの分解の影響を調査しました33。 リターの総質量損失とリター中のメトキシ基の組成の変化は、自然生分解中のδ2HLM サインに本質的な影響を与えませんでしたが、生物的および非生物的分解中のδ2HLM の変動性、特に細菌分解と真菌分解のさまざまな役割と特徴の観点から。 さらに、これまでの研究では、リグニンに対する酵素の吸着能力と変換効率に重点が置かれており 34、さまざまな微生物によるリグニン分解中のリグニンモノマーの動的変化とその δ2HLM 特性を説明する研究は報告されていないことがわかりました。 不足している情報を提供することは、リグニンの構造特性評価を実行し、この物質を生物地球化学サイクルや有機物分解における環境トレーサーのバイオマーカーとして応用する能力を拡大する上で、かなりの価値があるだろう。

私たちの知識のこれらの限界に対処するために、私たちは園芸バイオマスの生分解中のリグニンの変化を比較するために本調査を設計しました。 我々は、リグニン生分解において活性であることが以前に示されている真菌株および細菌株を選択し、制御された好熱性条件下で、インビトロでの生分解有効性を個別および組み合わせの両方で試験した。 15 日間の培養中、2 日間隔で分解残渣のガスクロマトグラフ質量分析 (GC-MS) およびガスクロマトグラフ同位体比質量分析 (GC-IRMS) 分析を実行しました。 我々は、リグニンモノマー含有量とδ2HLM値が独立して変化し、生分解における細菌対真菌の異なる相対的役割を明らかにするだろうと仮説を立てた。 私たちの具体的な目的は、(1) シュードモナス マンデリ、アスペルギルス フミガタス、およびそれらの共培養によるリグニン分解の変動性を調査すること、(2) 2 つの主要なモノマーの比率とその δ2HLM に基づいてリグニン分解の動的特性を評価することでした。分解残留物の値。 我々は、リグニンのメトキシ構造の特殊化と微生物の作用中の選択的加水分解により、2 つのモノマーの比率が不均衡になるが、分別がしっかりしている場合、δ2HLM 値は本質的に一定のままであることを発見しました。

西安植物園（中国陝西省）から収集した落ち葉、枯れ木、園芸剪定残渣から構成されるマルチソースの庭園バイオマスを使用しました。 各成分を剪定ばさみで長さ約 1 cm の断片に切断し、徹底的に混合して、各材料の重量割合が等しいプールサンプルを作成しました。 次いで、均一な混合物をガラス三角フラスコに加えた。 バルク材料の主な化学組成は、セルロース (32%)、ヘミセルロース (17%)、および総リグニン (27%) であり、これには次の割合でリグニン モノマーが含まれます: G-リグニン (10.0%)、S-リグニン ( 13.6%)、合計メトキシ基 (5.7%)。

この研究で使用した微生物接種物は、細菌シュードモナス マンデリ（QL-1 株、以下「PM」）、真菌アスペルギルス フミガタス（QL-4 株、以下「AF」）、および 2 つの株の組み合わせ（以下「AF」）でした。 QL-1 および QL-4、以下「PM + AF」）。 これらのリグニン分解株は、2019年9月に中国中部の秦嶺山脈の自然林の下層部にある土壌腐植土から単離され、北京六和BGIテクノロジー有限公司で16SリボソームDNAと内部転写スペーサー配列決定によって同定された。 . (北京、中国) (補足図 S1)。 クロマトグラフィーグレードの内部標準 (テトラコサン、99.5%) と反応試薬 (ヨウ化水素酸、55 ～ 58%) を Macklin (中国、上海) から購入して使用しました。 他の化学物質はすべて分析グレードであり、Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (天津、中国) から購入しました。

生分解実験の前に、すべてのバイオマス材料はボルテックスオシレーターを使用して完全に均質化され（5分間）、高温（121℃）および高圧（103kPa）で20分間滅菌され、その後85℃のオーブンで1時間乾燥されました。 8時間。 リグニンモノマーの変動と分解残渣のδ2HLM 値を捕捉するために、微生物ごとに個別に (PM および AF)、共培養としてそれらの組み合わせを使用して (PM + AF) 生分解実験を実行しました。 別々の微生物株については、同様の細胞濃度（107 ～ 108 CFU/mL）の懸濁液を使用し、PM の場合はルリア・ベルターニ培地、AF の場合はポテトデキストロース寒天培地で、どちらも 30 °C で 150 rpm で振盪培養しました。 。 共培養懸濁液は、単一株懸濁液で使用したものと同じ総量 (30 mL) を混合することによって生成されました。

実験のセットアップと操作は、Yoon と Ji35 の方法に若干の変更を加えたものに従いました。 要約すると、均質化した園芸バイオマス 5 g を含む 250 mL 三角フラスコに 5 mmol/L リン酸緩衝液 (pH 7.0) 30 mL を加えました。 続いて、培養懸濁液 0.5 mL (体積対基質質量比 10%) をフラスコに接種し、通気性フィルム (Mlbio、上海、中国) で開口部を密閉しました。 対照処理として、30 mL の緩衝液を含む同量 (0.5 mL) の滅菌水を使用しました。 次に、生分解実験を暗所で、振盪インキュベーターを使用して 45 °C、150 rpm で 15 日間実施しました。 7 つのサンプリング期間で使用するために、84 のバッチ (3 つの接種とコントロールについて、所定の測定期間に 3 つの反復) を作成しました。

毎日分解状況を観察し、必要に応じて滅菌水を追加して溶液量を一定に保ちました。 3 日目、5 日目、7 日目、9 日目、11 日目、13 日目、および 15 日目に、実験ごとに分解残留物の 3 つの反復バッチを分析サンプルとして収集しました。1 日目の最初のサンプルは、分解実験を開始する前に取得されました。 サンプルを 15 mL の滅菌水で 3 回洗浄し、濾過し、固体を一定重量になるまで乾燥 (85 °C) しました。 園芸バイオマスの分解重量損失 (DWL、%) は次のように計算されました。

ここで、Mb は生分解前の材料の初​​期量 (5 g) であり、Ma は生分解の n 日目の実験または対照処理の生分解後の値を表します。 庭園バイオマスの正味分解損失 (NDL、%) は、接種実験と非接種対照の間の DWL の差でした。 分析サンプルは、リグニンモノマー含量およびリグニンメトキシδ2HLM の測定前に（直径 < 0.1 mm まで）粉砕されました。

リグニンモノマーの定性的および定量的分析は、リグニンモノリグノールのエーテル結合を効果的に切断してチオエステル誘導体を生成できるチオ酸分解反応を使用して実行されました36。 分解残渣中のリグニンモノマーの組成は、7000D 質量分析計 (GC-MS、Agilent、米国) に接続された G4513A オートインジェクターを備えた 7890B ガスクロマトグラフ (GC) を使用して測定されました。 GC には HP-5MS カラム (30 m × 0.32 mm × 0.25 µm、Agilent) が取り付けられ、次の条件が使用されました: 入口温度 250 °C、注入量 1 μL、分割注入 (10:1)、初期オーブン温度を 150 °C で 2 分間加熱し、20 °C/min で 250 °C まで昇温し、5 分間保持します。 ヘリウムをキャリアガスとして 1.0 mL/min の一定流量で使用しました。 次の MS 条件を使用しました: 電子イオン化 (EI) モード、イオン源温度 230 °C、界面温度 250 °C、電子エネルギー 70 eV、溶媒遅延 3.5 分、スキャン範囲 40 ～ 650 amu。 GC-MS は、次の分子イオンと保持時間について選択イオンモニタリング モードで実行されました。G-リグニン誘導体では 17.5 分で m/z 269、S-リグニン誘導体では 20.8 分で m/z 299、および m/ 12.7 分の内部標準テトラコサンの場合は z 338。

リグニンモノマー含有量の最終測定は Lapierre37 の方法に従い、応答係数 (k) は内部標準とターゲットサンプル間の相対面積に対する相対濃度の比に等しくなります。

ここで、kは1.5に等しく、CsとCiはそれぞれリグニンモノマー誘導体とテトラコサンの濃度を表し、AsとAiは対応するピーク面積を表します。 さらに、この研究ではチオ酸分解反応が十分かつ完全であると仮定し、基質の変換と内部標準の回収率を 100% と定義しました 38,39。 次に、モノリグノールとその誘導体の分子量比（G-リグニンは0.67、S-リグニンは0.70）を使用して、サンプルのリグニンモノマー含有量をG-およびS-リグニンの量に変換しました36。 G-リグニンおよびS-リグニンの正味分解損失(NDL、%)は、接種実験と非接種対照の間のリグニンモノマー含量の差であり、正味分解損失率(NDR、%・day-1)は次のように定義されました。各分解段階におけるリグニンモノマーの正味分解損失。 チオ酸分解反応、GC-MS条件、およびクロマトグラフチャートの詳細については、補足情報（補足図S2、S3a;補足テキストS1.1）を参照してください。

分析用粉末サンプルのδ2HLM 値は、分解残基のメトキシ基とヨウ化水素酸 (HI) の間の選択的置換反応によって放出されるヘッドスペース ヨードメタン (CH3I) として測定されました。 私たちは Keppler ら 21 および Greule ら 40 の確立された方法に若干の変更を加えて従いました 29。 具体的には、小さな磁石を含む茶色のクリンプガラスバイアル (1.5 mL; Agilent) 内の分解残渣 (10 ± 0.5 mg) に 0.5 mL の HI を加えました。 バイアルを、PTFE で裏打ちされたブチルゴム隔膜 (クリンプ 11 mm、厚さ 0.9 mm) を含むアルミニウム キャップで密封し、油浴中で 120 °C で 30 分間撹拌しました。 この変換温度は、110 °C での Keppler ら 21 および 130 °C での Greule ら 40 による検証に基づいて重み付けされた値です。 インキュベート後、サブサンプルを 22 ± 0.5 °C (空調室内) で少なくとも 40 分間平衡化させました。 最後に、手動気密シリンジ (100 μL; Hamilton, USA) を使用して、CH3I のアリコート (80 ～ 100 μL) を分析システムに直接注入しました。

CH3I のδ2HLM 値は、ISOLINK II Delta V Advantage 同位体比質量分析計 (IRMS) と組み合わせた TRACE 1310 GC を使用し、熱変換反応器 (セラミック管 [Al2O3]、長さ 320 mm、内径 0.5 mm、反応器温度 1400℃) を介して測定しました。 °C) (サーモフィッシャー、ドイツ)。 測定は陝西師範大学生物地球化学研究室で行われました。 GC には TG-5MS カラム (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm、Thermo Fisher) が取り付けられ、次のパラメータに基づきました: 注入口温度 200 °C、分割注入 (12:1)、初期オーブン温度 40 °Cで3.8分間、20°C/minで80°Cまで上昇させて1分間保持し、その後40°C/minで最終温度100°Cまで上昇させて3分間保持します。 ヘリウムをキャリアガスとして 0.8 mL/min の一定流量で使用しました。 高純度水素ガス (99.999%、中国、Beijing AP Baif Gases Industry Co.) をモニタリングガスとして使用しました。 測定期間中の H3+ 係数は 4.7 ～ 5.0 ppm/nA の範囲でした。

精度を向上させるために、測定は分析サンプルと標準物質の同一処理の原則に従う必要があり、δ2HLM 値は 2 点校正によって正規化される必要があります 37。 ただし、参照材料として真の δ2HLM 値を備えた入手可能な市販サンプルが不足しているため、GC-IRMS 結果の安定性と平行性を調べるには、地理的位置と樹種が異なる 2 つの均質化木材サンプルしか使用できませんでした。 これら 2 つの木材サンプルは最近、ハイデルベルク大学のフランク ケプラー研究室によって、同研究室の基準に照らして測定されました41。 したがって、この研究で報告されたδ2HLM データは、監視中の水素ガスと比較して表現され、社内標準に対して校正されました。 さらに、同位体δ値の単位として、パーミル (‰) 単位の V-SMOW (ウィーン標準平均海洋水量) スケールの代わりに、ミリユーレイ (mUr) が使用されました42。 標準偏差 (n = 3 または 7、1σ) は 0.6 ～ 2.4 mUr の範囲でした。 置換反応、測定条件、補正方法、クロマトグラフの詳細については、補足情報（補足図S2、S3bおよび補足テキストS1.2）を参照してください。

報告されたデータは、3 回の反復実験の平均 ± 標準偏差です。 測定値の統計的有意性は、一元配置分散分析 (ANOVA、P < 0.05 で有意性) によって評価され、ANOVA 結果が有意な場合は、Tukey の HSD 検定を使用して、分解間で有意に異なる値のペアを特定しました。実験。

図1および補足表S1は、研究期間中の2日間隔での園芸バイオマスの分解重量損失(DWL、%)および正味分解損失(NDL、%)を示します。 所定の分解段階では、両方の微生物がリグノセルロース系バイオマスを分解できましたが、微生物の共培養では、有意に（P < 0.05）より大きな分解が達成されることがよくありました。 15 日間の分解実験では、細菌の DWL 値 (PM 実験) は 4.3% (3 日目) から 18.9% (15 日目) に増加し、対応する NDL 値は線形近似と 3.1 から 11.9% に増加しました。傾きは 1.16 (P < 0.001)。 真菌の最終的な DWL 値 (AF 実験) は 23.9% に増加し、NDL 値は研究期間中に 1.68 の傾きで 3.9 から 17.0% に増加しました (P < 0.001)。 これは、真菌が酵素加水分解によってリグノセルロース成分をさまざまなバイオ製品に急速に分解または発酵できることを示しました。 予想通り、共培養 (PM + AF 実験) での生分解効率は一般に単一株の生分解効率よりも高く、最終 DWL 値は 26.7% と高く、NDL の適合勾配は 1.75 (P < 0.001) でした。 。 通常、多種の共生混合物は、多様な酵素の生産と相乗効果を促進する最良のアプローチです43。 これが、異なる種の共培養が、単一の真菌や細菌の場合よりも化学シグナルに対するより多くの反応を引き起こす可能性がある理由である可能性があります44。

15 日間の実験中の園芸バイオマスの分解重量損失 (DWL) と正味分解損失 (NDL、接種実験と非接種対照間の DWL 値の差) の変化 (測定は 2 日間隔)。 方程式と破線は、15 日間の実験にわたる NDL の線形近似を表しています。 実験: Con.、非接種対照。 首相、シュードモナス・マンデリ。 AF、アスペルギルス フミガタス。 PM + AF、2 つの微生物の共培養。 異なる文字でラベル付けされた特定の日付のバーは、4 つの処理間で有意に異なります (P < 0.05)。

分解物質の変換効率は、特に真菌接種実験 (AF および PM + AF) において、7 日目から大幅な増加を示しました。 アミノ酸などの小分子は最初に微生物によって代謝され、次に難治性高分子物質の前駆体（つまり、セロビオース、キシロース、オリゴマー）が代謝されます 3,45。 一部の良好な熱溶解性物質を除いて、これらの分解物質は主に多糖単位に由来しており、炭素源およびエネルギー源として微生物によって優先的に代謝されます。 したがって、セルロースとヘミセルロースの効率的な加水分解は、3 回の接種実験の初期段階で明らかでした。 これまでの研究では、アスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリウム、ケトミウム種を含むリグノセルロース分解糸状菌が、高い細胞外酵素活性を持つさまざまなリグノセルロース系酵素を効率的に分泌できることが報告されています2,46。 本研究における A. fumigatus と P. mandelii はいずれも落葉分解微生物のグループに属しますが、共培養で最も高い分解効率が得られました。 Miao et al.47 によると、A. fumigatus が分泌する主要なセルラーゼとキシラナーゼの活性は最初の 3 日間は比較的低いままであり、菌糸体の成長に伴うそれらのピーク値は一般に 6 日目頃に得られます。 対照的に、低温適応細菌である P. mandelii の酵素は、中温から高温 (45 °C で 15 日間培養) のため、低い触媒活性を示した可能性があります 48。 これらの温度依存性酵素の中で、細胞外グルコシダーゼとセロビオヒドロラーゼは、多糖類の加水分解に対して基質を優先します。 したがって、真菌と細菌を組み合わせたコンソーシアムには、種と酵素間の相乗効果により、独特の生分解上の利点があります49。

リグニンモノマー（G-およびS-リグニン）の含有量の変化は、PM、AF、およびPM + AF実験で同様のパターンを示しました（図2、3）。 最初の 5 日以内に、G リグニンと S リグニンの含有量はわずかに減少し、PM ではそれぞれ 10.0% と 13.6% から 9.6% と 13.0% に、AF では 9.5% と 13.1% に、AF では 8.9% と 13.1% に減少しました。 PM + AF の場合は 12.8% (補足表 S2)。 翌日、G-リグニンの減少は、S-リグニンと比較して特に顕著でした（図2a、b）。 分解期間の終了時（15 日目）、AF および PM + AF 真菌実験における G-リグニン含有量はそれぞれ 5.1 および 6.7 パーセントポイント減少しましたが、S-リグニンは 3.4 パーセントおよび 3.8 パーセントポイントしか減少しませんでした。それぞれ（表1）。 全体として、G-リグニン含有量と S-リグニン含有量の合計は、3 回の接種でそれぞれ 4.5、8.5、および 10.5 パーセントポイント減少しました (図 2c、表 1)。 さらに、7 日目以降、G-リグニンの NDL 値は S-リグニンの NDL 値よりもはるかに大きかった (補足表 S3)。 両方のリグニンモノマーの対応する線形適合は分解期間全体にわたって有意でしたが、3つの実験の方程式の急峻さと重要性は異なり、PM + AFの傾きが最大で、次にAFとPMが続きました（図3a）。 この結果は、リグノセルロース系バイオマスの総分解重量損失と一致しており、共培養系で急速な分解が起こったことを示している。 さらに、G-リグニン含有量の正味分解損失率（NDR）は、分解実験全体を通じて異なるが有意な増加を示しましたが、S-リグニンの場合、NDRはPM処理とPM + AF処理の間で大幅に増加しました（図3b、補足図S4） ）。 これらの結果は、特に細菌と真菌の両方との共培養モードにおいて、この真菌が強い分解能力と G-リグニンに対するある程度の選択性を持っていることを示唆しています。

15 年間の分解残基中の (a) グアヤシル モノリグノール (G-リグニン)、(b) シリンギル モノリグノール (S-リグニン)、および (c) 2 つのモノリグノールの合計 (G&S-リグニン) の含有量の時間的変動。 - 2 日間隔で測定する、- 日間の実験。 実験: Con.、非接種対照。 首相、シュードモナス・マンデリ。 AF、アスペルギルス フミガタス。 PM + AF、2 つの微生物の共培養。 異なる文字でラベル付けされた特定の日付のバーは、4 つの処理間で有意に異なります (P < 0.05)。

3 つの接種実験におけるグアヤシル モノリグノール (G-リグニン) およびシリンギル モノリグノール (S-リグニン) モノマーの純損失: (a) 正味分解損失 (NDL、接種実験と非接種対照間のリグニン モノマー含有量の差)、および(b) 正味分解損失率 (NDR、インキュベーション終了時の NDL をインキュベーション期間で割ったもの、日数)。 方程式と破線は、15 日間の実験における NDL 対時間の線形近似を表しています。 箱ひげ図では、白い四角は平均値を表し、水平線は中央値を表し、ボックスは 25 ～ 75 パーセンタイルを表し、ひげは 95% 信頼区間を表します。 実験: PM、Pseudomonas mandelii; AF、アスペルギルス フミガタス。 PM + AF、2 つの微生物の共培養。 異なる文字でラベル付けされたすべての日付のバーは、4 つの処理間で有意に異なります (P < 0.05)。

リグノセルロース材料の微生物利用とリグニンの解重合に関する以前の報告では、真菌と細菌の両方を含む複数の微生物が分泌する細胞外オキシダーゼによってリグニンが小さな芳香族化合物に分解されることが実証されています14、15、50、51。 これらのリグニン分解酵素は、ヘム含有ペルオキシダーゼ (リグニン ペルオキシダーゼ、マンガン ペルオキシダーゼ、および一部の汎用ペルオキシダーゼなど) とフェノール オキシダーゼ (ラッカーゼ) の少なくとも 2 種類で構成されます。 これらはすべて、化学結合を攻撃して切断する不安定なフリーラジカルを生成する可能性があります。 一般に、リグニン分解菌はさまざまな酸化酵素を分泌でき、これらはより強力な酵素加水分解選択性と触媒効率を備えているため、特異的および非特異的酸化経路の両方を通じてモノマー内およびモノマー間の結合および芳香環をよりよく切断できます52,53。 。 対照的に、細菌はリグニンの分解が真菌よりも遅い。これは、細菌が持つオキシダーゼが少なく、真菌は得られる芳香族物質の抗菌性および疎水性特性に対する感受性が低いためである54,55。 図１、２に示すように。 図２および３に示されるように、インキュベーション結果は、真菌接種材料がリグニンおよび他のリグノセルロース基質を分解するより優れた能力を有することを実証した。 G-リグニンとS-リグニンの両方の分解効率が最も高かったのは共培養実験であり、これは異なる酵素の組み合わせ作用と細胞外酵素間の相乗効果の結果である可能性があります46,49。

リグニンの生化学的分解経路では、リグニンポリマーはまず微生物の触媒作用によってモノマーに解重合され、続いて芳香族異化作用が起こり、その後芳香環の切断とクエン酸回路への組み込みによってさらに分解されます15。 異なる酵素のメトキシ特異性によって引き起こされる構造の違い（図4a、b）が、G-リグニンとS-リグニンが異なる芳香族代謝経路をたどる主な理由であり、フェルラ酸とシリンガ酸が最初の分解生成物として機能します。 G-リグニンとS-リグニンのそれぞれの分解（図4c）。 一般に、フェルラ酸（G-リグニン由来）は、非酸化的脱炭酸、CoA依存性β酸化/非β酸化、側鎖還元経路を介して中間体バニリン酸に変換されます56。 バニリン酸-O-デメチラーゼの触媒作用により、バニリン酸は最終的にプロトカテク酸に脱メチル化されます57。 対照的に、シリンギ酸 (S-リグニン) は、まずテトラヒドロ葉酸依存性 O-デメチラーゼによって脱メチル化されて中間体 3-O-メチルガレートを形成し、その後、複数の経路による一連の切断、脱メチル化、およびカルボキシル化経路を介して触媒されて 4-オキサロメサコネートになります。代謝酵素58． 最後に、これらの低分子量リグニン由来の芳香物質は、微生物細胞の増殖と代謝のための炭素源やその他の物質の供給源になります54。

リグニンベースの芳香族化合物の (a) 化学構造、(b) ポリマー構造、および (c) 生分解経路 15。 リップ、リグニンペルオキシダーゼ。 Mnp、マンガンペルオキシダーゼ。 Vp、多用途ペルオキシダーゼ。

さらに、リグニン生合成におけるメチル化の不可逆性 9 と組み合わせると、おそらくメトキシ基の化学的安定性または酵素活性の生物学的阻害のため、S-リグニンは G-リグニンよりも分解しにくいことが観察されました 59。 たとえば、GC-MS 分析では、3-メチルブタン酸、5-メチル-5-プロピルノナン、3-メチル-2-ブタノール、2-メトキシフェノール、4-メチルトリデカンなどのメトキシ基を含む一部のモノマー誘導体は、リグニン分解の過程で簡単に検出できます8,60。 これらの中間代謝産物の存在は、芳香族基質からのメトキシ基の放出がリグニンの解重合の主要な代謝経路であることを示唆していますが、メトキシ基はメチオニン生合成の C1 源として使用できます 61。 したがって、我々の結果は、微生物代謝の酵素選択性とメトキシ基の構造特異性が共に、生分解中に観察されるリグニンモノマーの違いに寄与していることを示している可能性があります。

さらに、リグニンモノマー比 (G/S) とメトキシ δ2HLM 値を使用して、リグニン分解の変化する特性を特徴付けました。 3 つの接種実験における分解残留物の G/S 比は、初期比値 0.74 から始まる異なる減少率を示しました (図 5a、表 1 および補足表 S4)。 G/S 比の最大の減少は PM + AF 実験で発生し、最終値は 0.33 で、続いて AF 実験 (0.47)、PM 実験 (0.58) でした。 対照的に、接種されていない対照実験におけるG/S比は、分解期間を通して本質的に一定（0.73±0.01）のままでした（図5a）。 さらに、リグニンモノマーに対するメトキシ基の理論的相対分子質量比（G-リグニンでは 17.2%、S-リグニンでは 29.5%）に基づいて、分解残基のメトキシ基含有量が初期の 5.7% から 5.7% に減少すると計算しました。最終値は 3.2% (PM + AF)、対して 3.9% (AF) および 4.8% (PM) (表 1)。 これらの発見は、G-リグニンがS-リグニンより分解されやすく、真菌接種実験ではどちらの分解もより速く起こるという我々の観察をさらに裏付けるものである。

(a) リグニンモノマー比 (G-リグニン/S-リグニン、G/S) および (b) 分解残基中のリグニンメトキシ基の安定水素同位体値 (δ2HLM) の時間的変化。 方程式と直線は、15 日間の実験にわたる G/S 比の線形近似を表しています。 箱ひげ図では、白い四角は平均値を表し、水平線は中央値を表し、ボックスは 25 ～ 75 パーセンタイルを表し、ひげは 95% 信頼区間を表し、緑色のひし形は外れ値を表します。 異なる文字でラベル付けされたバーは有意に異なります (P < 0.05)。 初期、バルク材料の初期δ2HLM値。 対照、非接種対照。 首相、シュードモナス・マンデリ。 AF、アスペルギルス フミガタス。 PM + AF (P + A)、2 つの微生物の共培養。

分解実験前のバルク材の初期平均δ2HLM値は−230.4±1.5mUrであり、これは私たちの研究グループによる年輪材の複数年測定の値（−233.6±9.4mUr、n=119）に近かった。 (原稿は審査中です)。 これらの樹木サンプルは、本研究で庭園バイオマスサンプルを収集した場所からわずか30 km離れた秦嶺山脈から収集されたため、2セットのδ2HLM値の一貫性は、植物源の水（つまり、局所的な降水量）との一貫性を示唆しています。 さらに、異なる培養実験におけるδ2HLM値は分解の約5日後に変動しましたが、測定されたδ2HLM値は分解期間全体を通じて有意に変化しませんでした（ANOVA、P <0.05）（補足表S5）。 この研究で使用された実験材料は複数の供給源の庭園バイオマスの混合物でしたが、植物の落葉には通常、ほぼ同じ割合のリグニンとペクチンが含まれています62。 別の芳香族メトキシ供与体であるペクチン多糖は植物の葉の細胞壁に豊富に含まれており、セルロースやヘミセルロースとともに容易に加水分解されます63。 Anhäuser et al.33 によれば、分解開始時の δ2HLM 値のシフトはペクチンの寄与による可能性があり、ペクチンのメトキシ基はリグニンとは別に分析されていません。 さらに、S-アデノシルメチオニンは、G-リグニンおよびS-リグニン生合成の一般的なメトキシル基供与体ですが、芳香環は異なるO-メチルトランスフェラーゼを介して3位、5位、またはその両方でメチル化されます9。 したがって、δ2HLM 値におけるこれらの変動の存在は、リグニンモノマーとペクチンからのメトキシ基の生成が無視できないものではないことを示唆しています 33。

重要なことに、共培養実験では、最大の G/S 比の減少とメトキシ基の損失が示されましたが、最も強いδ2HLM の濃縮または減少は示されず、同様の変動と同様の平均値 (15 日間の分解期間中の平均) が示されました。真菌接種時の値に。 対照的に、細菌実験で観察されたδ2HLM 値の 3.0-mUr の減少は明らかでした。 メトキシに富むペクチンは分解しやすく、おそらくより正の同位体特徴をもたらすという事実に加えて、微生物による酵素加水分解中の同位体分画を考慮する必要があります64。 より軽い同位体は微生物により容易に利用されるため、生分解は残留基質の濃縮につながる可能性があります65。 Fischer et al.66 によれば、生分解中のベンゼン環の好気性水酸化中に水素の同位体分別が明らかであり、特定の生分解経路の一部の同位体濃縮因子は、分解物質、培養条件、および複雑な酵素反応の混合物によって引き起こされる可能性があります。 。 この結果は、我々が観察したリグニン芳香族化合物の脱メチル化と一致しており、真菌接種実験ではδ2HLM 値がより豊富でした。

4 回の実験における最終 (15 日目) δ2HLM 値 (-227.5 ～ -230.4 mUr の範囲) は初期値 (-230.3 mUr) と有意な差はありませんでしたが (ANOVA、P < 0.05)、わずかな濃縮が観察されました。分解中のリグニンδ2HLM値の変化（図5b、表1および補足表S5）。 しかし、基質の均質性、使用した参照標準、注入量、ベースラインドリフト、自然変動（すなわち、高い標準偏差）、スケール圧縮などの一部の分析的不確実性41,67は、実際の平均値から離れていました。 この研究では、一部の標準偏差 (n = 3、範囲は 0.9 ～ 2.6 mUr) が 1.5 mUr 以上であり、これは理想的な同位体測定で予想される値よりも明らかに大きくなっています 22,25。 全体として、落葉および微生物の代謝同位体分画からのペクチンの損失が、リグニンの分解中に観察されたδ2HLM 値の変動の原因である可能性がありますが、これらのプロセスは G/ の減少に依存していないようです。 S 比またはメトキシ基の損失。 ただし、リグニン固有の δ2HLM 値をリグノセルロース材料の分解ダイナミクスの評価に、または植物の落葉から土壌腐植土へのリグニンの沈着の代用として適用する前に、G- と S- の間の δ2HLM 値の違いに関するより詳細な情報が必要です。リグニン。

我々の分析は、リグニンモノマーとそのδ2HLM値が独立して変化し、生分解における細菌と真菌の異なる相対的役割を明らかにするという我々の仮説を裏付けた。 アスペルギルス フミガタスのリグニン解重合能力は、単独または共培養において、シュードモナス マンデリ単独の能力よりも強かった。 すべての実験において、G-リグニンは S-リグニンよりも容易に分解されました。 分解残渣中のリグニンメトキシ基の測定されたδ2HLM 値は、リグニンモノマー含量、G/S 比、またはメトキシ基の損失に有意な依存性を示さなかった。 これは、リグノセルロース材料の生分解またはリグニンの石化におけるδ2HLMシグナルが、植物の落葉から有機土壌へのリグニン投入のバイオマーカーとして使用できることを示した。 ただし、δ2HLM 値が植物リグニンモノマーの割合に応じて変化するかどうかは明らかではありません。 G-リグニンと S-リグニンの δ2HLM 値の違いは、2 つのモノマーを分離するか、それらの同位体値を別々に決定することによってさらに調査する必要があり、それによってリグニン生分解についてのさらなる洞察が得られます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

酸化アルミニウム

アスペルギルス フミガタス株

コエンザイムA

コロニー形成ユニット

ヨードメタン

未接種の対照実験

リグニンメトキシ基の水素安定同位体比

沈殿中の水素安定同位体比

分解重量減少

グアヤシルモノリグノール

ガスクロマトグラフ

ヨウ化水素酸

p-ヒドロキシフェニルモノリグノール

同位体比質量分析計

質量分析計

正味劣化損失

正味劣化損失率

メトキシ基

シュードモナス・マンデリ株

シュードモナス・マンデリとアスペルギルス・フミガタスの共培養

ポリテトラフルオロエチレン

シリンギルモノリグノール

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δ2HLM 測定の技術的支援については、Xiaohong Liu 教授 (陝西師範大学) に感謝します。 また、リグニンメトキシ基の安定同位体比の測定に関して建設的なアドバイスと協力をしていただいたハイデルベルク大学のフランク・ケプラー教授とその研究スタッフに非常に感謝しています。 本研究は、陝西省自然科学基礎研究プログラム（助成金2021JQ-968、2020JM-708、2020JQ-971）および陝西省地域科学技術プログラム（助成金2021ZDYF-GY-0020、20193058YF046NS046）の支援を受けました。

陝西省科学院土壌資源およびバイオテクノロジー応用重点研究室、植物資源の保存と利用のための陝西工学研究センター、陝西省西安植物園（陝西省植物研究所）、翠華南路17号、西安、710061、中国

Qiangqiang Lu、Guanghua Jing、Liyan He、Ning Zhao、Zhikun Chen、Zhao Zhang、Xinwei Shi

陝西師範大学地理観光学部、西安、710119、中国

ルー・チャン強 & 王ヤーボ

林業大学、ノースウェスト A&F 大学、楊陵、712100、中国

リリ・ジア

天然資源環境学部、ノースウェスト A&F 大学、楊陵、712100、中国

ムケシュ・クマール・アワスティ

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著者全員が研究の構想と設計に貢献しました。 方法論、調査、可視化、視覚化は QL、GJ、YW、LH、NZ、ZZ によって行われました 原稿の初稿は QL によって書かれ、レビューと編集は LJ と MKA によって行われました プロジェクトの管理と資金獲得は QL によって行われましたXS および ZC すべての著者が最終原稿をレビューし、承認しました。

Xinwei Shi への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Lu、Q.、Jia、L.、Awasthi、MK 他。 園芸バイオマスの生分解中のリグニンモノマー含有量とメトキシ基の水素安定同位体比の変動。 Sci Rep 12、8734 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-12689-1

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受信日: 2022 年 2 月 18 日

受理日: 2022 年 5 月 5 日

公開日: 2022 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12689-1

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